1、WB的轉膜和染色凝膠中蛋白的可視化在現階段染膠可用于確定蛋白的遷移是否均勻一致。如果您計劃將蛋白轉印到膜上，則使用銅染色 法，因為考馬斯染色不可逆。考馬斯染色僅適用于以下情形：在轉膜后染膠檢查轉膜效率；不需要轉 膜，只需觀察SDS-PAGE結果。考馬斯染色切斷電源后，分離的蛋白條帶就會開始擴散（溶于水溶液）。為了防止蛋白的擴散，用40%蒸徭水、10%醋酸、50%甲醇的溶液處理凝膠，就會使大多蛋白沉淀（變得不可溶）。為了讓固定的蛋白可視化，在相同比例的水/醋酸/甲醇混合物中加入質量比0.25%的考馬斯亮藍R- 250,然后將凝膠放置溶液中，在振蕩器上室溫孵育4小時至過夜。接下來將凝膠（保存染料；

2、可重 復多次使用）轉移到67.5%蒸憾水、7.5%醋酸、25%甲醇的混合溶液中，放置在振蕩器上，洗去多 余的染料。染料不會結合丙烯酰胺，因此會被洗脫（留下干凈的凝膠）。但是，染料會與凝膠中的蛋白緊密結合，顯 示為深藍色。銅染色法用蒸憾水簡單沖洗經新鮮凝膠（最多30分鐘），然后轉移至鐘。接0.3 M CuCl 2溶液染色5-15分蛋 下來用去離子水簡單清洗凝膠，在暗視野背景下觀察。清晰條帶。白在半透明藍色背景下形成重復 凝膠可以用0.1-0.25 M Tris/0.25 M EDTApH 8.0沖洗至完全脫色。根據轉膜儀器制造商的說明，進行轉膜。轉膜轉膜流程的詳細說明可在轉膜儀器制造商的網站上找

3、到，根據系統的不同而有所區別。但是，每種方 法的原理都一樣。帶電荷的蛋白（SDS提供）在電場中可以在凝膠中移動，從凝膠轉移到膜上，顯示 蛋白的吒卩跡。早期的方法依賴于擴散；現在在電場中進行印跡是標準方法了。轉膜可以濕轉或半干轉。濕轉由于膜的干燥而更不容易失敗，尤其推薦用于大蛋白轉膜。在兩種轉膜 膜之間的緊密接觸。方法中，膜都放置在凝膠旁邊，兩者夾在濾紙中間，整個三明治結構夾在固體載體之間，保持凝膠與在濕轉中，凝膠和膜緊緊地夾在海綿和濾紙之間（海綿濾紙凝膠 膜濾紙海綿），確保凝 膠與膜之間不形成氣泡。三明治結構浸泡在轉膜緩沖液中，對其施加電場。負電荷蛋白向正極移動， 結合在膜上，并阻止其繼續移動

4、。濕轉的標準緩沖液與跑膠緩沖液所用的都是lx Tris-甘氨酸緩沖液，但是沒有SDS ,并加入了甲醇至終濃度20% o對于分子量大于100 kDm的蛋白，推薦在轉膜緩沖液中加入終濃度為0.1%的 SDS o在半干法轉膜中，三明治由濾紙凝膠 膜 濾紙組成，在轉膜緩沖液中浸濕，直接放置在正負電 極之間。在轉膜中，膜靠近正極、凝膠靠近負極，這很重要。半干轉的轉膜緩沖液中Tris和甘氨酸的比例不一定與濕轉一致，請參考儀器制造商的實驗方案。標準 配方是 48mMTris 39 mM 甘氨酸、0.04% SDS、20% 甲醇。有兩種類型的膜：硝酸纖維素膜(NC膜)和PVDF膜，實驗效果都很不錯。PVDF膜

5、要求進行預處理: 將膜裁剪為合適的大小，然后在甲醇中浸泡1-2分鐘。之后轉移膜至冰冷的轉膜緩沖液中孵育5分鐘。未能在轉膜緩沖液中平衡的膜會導致轉印時皺縮、條帶錯位。小分子和大分子蛋白的轉膜 轉膜緩沖液中SDS和甲醇的平衡、蛋白的大小、膠的濃度會影響轉膜效率。如下調整可以增加轉膜效 率：大分子蛋白(100 kD)對于大分子蛋白，其在凝膠電泳時分離遷移較慢,用低濃度的凝膠，8%或更低。由于低濃度的膠易碎，所以操作時需十分小心。SDS從蛋白上脫落，因此降低甲醇的濃度至大分子蛋白易在凝膠里形成沉淀聚集, SDS ,可以避免出現這種情況。由于甲醇易 使降低轉膜緩沖液中甲醇的比例也會促使凝膠的腫脹，讓大分

6、子蛋白更容易轉膜。只有使用NC 膜時才必需使用甲醇。如果是PVDF膜，在甲醇激活膜后，轉膜緩沖液中可以不加入甲醇。選擇濕轉4。(2過夜，不建議選擇半干轉。小分子蛋白(100 kD)SDS妨礙蛋白與膜的結合，對于小分子蛋白更是如此。因此小分子蛋白的轉膜，轉膜緩沖液中可以不 加 SDS o保持甲醇的濃度20% o對于500 kD的蛋白，請參考下列文獻的凝膠和緩沖液系統：Bolt MW and Mahoney PA (1997).High-efficiency blotting of proteins of diversesizes following sodium dodecyl sulfate-

7、polyacrylamide gel electrophoresis.AnalBiochem, 247,185 - 92.更多轉膜提示：使用銀子，避免手指接觸膜。手指上的油和蛋白會阻礙轉膜，形成臟的印跡。將凝膠和膜夾在濾紙中間后，兩者之間的氣泡可以通過滾筒、移液管或者15mL管滾壓三 明治結構來去除，或者在裝有轉膜緩沖液的盤中組裝三明治結構，防止氣泡形成。確保將濾紙和膜的大小剪裁得與凝膠一致。在半干轉中，較大的突出會阻止電流通 過膜。雞來源的抗體會結合在PVDF膜上，形成高背景。改用 NC膜可以幫助降低背景染色。麗春紅染色使膜上蛋白可視化要確定轉膜的成功，用TBST洗膜。將麗春紅母液按照1:1

8、00稀釋。母液是2%的麗春紅S加入 30%的三氯乙酸和30%的磺基水楊酸制成。在麗春紅染色液中孵育5分鐘，然后用大量水沖洗直至水清澈、蛋白條帶顯現。該膜可以用TBST或水重復沖洗至完全脫色。對于PVDF膜，用甲醇重新激活后，再用TBST清洗。TBS 10x 1L溶液；24.23 gTrizmaHCl80.06 gNaCl在800 mL蒸館水中溶解用HC1將pH調至7.6將體積加至1 LTBST1L溶液；100 mL TBS 10x900 mL蒸憾水1 mL Tween 20Tween 20很粘稠，會粘在槍頭上。請確保在Tris緩沖液中加入正確的劑量。使用10%的溶液比直 接加入未稀釋的Twee

9、n 20更容易操作。膜的封閉封閉膜可以阻礙一抗和/或二抗非特異性的結合到膜上(膜對蛋白有很高的結合能力，因此對抗體也有 很咼的結合能力)O通常使用兩種封閉溶液：脫脂牛奶或BSA(CohnfractionV) o牛奶相對便宜，但是不推薦用于磷酸 化蛋白的研究；牛奶中包含的酪蛋白是一種磷酸化蛋白，可能會導致抗體的非特異性結合，形成高 背景。有些抗體對BSA封閉的膜比牛奶封閉的膜信號更強，原因還不清楚。查看數據表中的應用說明，看其 中是否有封閉的具體說明。配置5%的牛奶或BSA溶液，即在每100 mL TBS含Tween 20 (TBST)的緩沖液中加入5 g牛奶或BSA o充分混合并過濾。不過濾可

10、能會導致斑點，在顯影時影響條帶。在搖床上4。C孵育1小時。孵育后用TBST沖洗5秒。一抗孵育孵育緩沖液以建議稀釋度在TBST中稀釋抗體。如果數據表沒有標明建議稀釋度，設計稀釋梯度(1:100- 1:3000),并根據結果進行優化。抗體過量會導致非特異性條帶。某些實驗室習慣使用封閉緩沖液，而另一些實驗室則使用不含封閉劑的TBST來孵育抗體。您可能 會發現抗體緩沖液加或不加封閉劑，不同的抗體，結果也不盡相同，。如果沒有高背景問題，用低濃度 (0.5 -0.25%)甚至完全不加牛奶或BSA ,有些抗體會產生更 強的信號。孵育時間時間可能從幾小時到過夜不等(不超過18小時)，取決于抗體對蛋白的親和力和

11、蛋白豐度。我們建議抗 體更高的稀釋度、更長的孵育時間，確保特異性結合。孵育溫度 最好低溫孵育。如果在封閉緩沖液中孵育過夜，必須在4。(2孵育，否則會岀現污染從而破壞蛋 白(尤其是磷酸化基團)。建議在搖床上孵育，充分均勻覆蓋膜，防止結合的不均勻。二抗孵育用TBST清洗膜數次，每次清洗5分鐘或更長，去除殘余一抗。孵育緩沖液與稀釋度以建議的稀釋度在TBST中稀釋抗體。如果數據表沒有推薦的稀釋度，設計稀釋梯度(1:1,000- 1:2,0000),并根據結果進行優化。抗體過量會導致非特異條帶。您可以在封閉緩沖液中孵育二抗， 但是在降低背景時可能會犧牲特異性信號的強度，這可能是因為封閉蛋白會阻礙抗體目標蛋白的結 合。孵育時間和溫度搖床上室溫孵育1- 2小時。選擇哪個偶聯物？我們推薦辣根過氧化物酶(HRP)偶聯的二抗，不推薦堿性磷酸酶(ALP)偶聯的二抗，因為其靈敏度較 低。顯影方法檢測試劑盒 對于HRP偶聯的抗體，通常使用加強的化學發光（ECL）試劑盒作為底物。我們提供不同檢測靈敏度的 HRP底物。X射線膠片自動化X射線膠片儀，簡單易用，被廣泛使用。切記，過曝的膠片不適合進行分析，因為無法確定蛋 白的相對量。且過曝的