1、免疫組織化學技術進展及應用,山西醫科大學第二醫院病理科 張曉琴,一、免疫組織化學技術的概念,免疫組織化學技術是利用抗原與抗體的特異性結合，并利用酶作用于底物，發生一系列化學反應顯色，借助顯微鏡觀察著色部位，從而鑒定組織或細胞結構的化學成分和化學性質的技術。,抗原：是一類在合適條件下，能激發機體免疫系統發生免疫應答，并能與免疫應答所產生的效應物質（包括抗體和效應細胞）在體內或體外發生特異性結合反應的物質。其兩種性能a免疫源性b反應源性,抗原決定簇：又稱抗原表位，決定抗原的特異性，是與相應抗體或淋巴細胞抗原識別受體相結合的部位，是決定和控制抗原特異性的特殊化學基團。,抗體：機體受到抗原刺激后，通過

2、體液免疫應答，b淋巴細胞活化、增殖、分化成為漿細胞，由漿細胞合成并分泌的僅與該抗原發生特異性反應的球蛋白（凝集素、調理素、沉淀素）。,抗體大部分位于r區帶。r球蛋白并非都有抗原活性。免疫球蛋白是包括了抗體和化學結構與抗體相同或相似，但卻無抗體活性的異常球蛋白,抗原抗體的結合具有高度的特異性，是物理化學吸附現象，抗原抗體復合物在一定的條件下可以解離。,二、免疫組織化學技術的起源和發展,1966年nakane建立了免疫酶標記技術，之后這門技術發展迅速，從直接酶標法發展到間接酶標法，在這期間，由于所用標記物的不同或標記方法的不同，由此衍化出的方法多達二十種以上。,用以做標記的物質：生物素、地高辛、膠

3、體金，熒光素、酶、同位素等。其中用于標記的酶有辣根酶、堿磷酶、葡萄糖氧化酶等等。,根據酶標記的對象的不同： 直接酶標法：將酶直接標記在特異性的抗體上。 間接酶標法：將酶標記在特異性抗體之外的其他參與反應的物質上。,根據酶在反應過程中扮演的角色不同： 酶標抗體法 抗原抗體酶標二抗顯色 非標記抗體酶法 抗原抗體抗酶抗體酶顯色 如：pap法、apaap法,那么，現在又根據免疫組化方法中是否有生物素的參與，我們又把免疫組化試劑分為生物素檢測系統和非生物素檢測系統,其實，現在的多數的免疫組化方法，是多種技術的有機的融合，它吸取了各種免疫組化理論基礎的優點，使免疫組化技術更趨向于成熟和穩定，更方便于廣泛的

4、運用。,作為一個高水平的技術員，而不僅僅是一個操作工，應該認真學習弄通免疫組化技術的理論和原理，才能在實際工作中從容應對隨時出現的問題，做到以不變應萬變。,到目前為止，最廣泛的用于病理組織學診斷和臨床科研的免疫組化方法是我們今天重點介紹的sp法和elivision法,這兩種方法所用的標記酶均為過氧化物酶（peroxidase）,三、最常用的免疫組化染色法,1：sp法 2：elivision法,1：sp法,主要是利用了生物素（biotin）與鏈霉菌抗生物素蛋白（s-avidin）之間具有的高度的親合力。,生物素和抗生物素蛋白是自然界中具有最強結合力的物質之一，并且它們同時和抗體或酶交聯，并不影響

5、它們的生物學活性。而sp法正是利用了他們的這一特性，同時，每個s-avidin分子具有的四個亞單位，這種特殊的結構使的抗原抗體結合的信號可以有效的呈多級放大，便于我們的鏡下觀察，有利于我們作出陽性的判斷。這就是我們常說的三步法。,主要操作步驟如下： 在組織切片或細胞片上加入特異性的一抗 其次，加入生物素標記的二抗 隨后，加入與過氧化物酶交聯的鏈抗生物素蛋白（即所謂的三抗）。 最后dab顯色,sp法反應原理示意圖,被檢測抗原,特異性一抗,生物素化二抗,抗生物素蛋白-hrp,dab顯色,2：elivision法,是應用了多聚物技術的最新一代免疫組化非生物素檢測系統，它利用高分子葡聚糖或有機單位小分

6、子直接將二抗的免疫球蛋白與過氧化物酶聯結成多聚體形式。使每一個抗體分子與多個酶分子相連，直接放大了抗原抗體結合的信號，替代了傳統sp法中的二抗三抗。這就是所謂的二步法。,主要操作步驟如下： a）在組織切片或細胞片上加入特異性的一抗 b）第二步，加入二抗過氧化物酶多聚體。dab顯色。,elivision法反應原理示意圖,特異性一抗,被檢測抗原,二抗-hrp多聚物,dab顯色,四、sp三步法與elivision二步法的比較,sp三步法的產生和建立遠早于elivision二步法，是經過多年的實踐并得到不斷完善的染色方法，它靈敏度高，特異性強，價格相對低廉，用于病理診斷及科研多年，在各級規模醫院中被廣

7、泛應用，得到了普遍的認可。正是由于這種方法的建立，發展和壯大了免疫組化技術在醫學領域中的運用范圍。使免疫組化技術得以廣泛的普及。,但不可避免的是它也存在著很多的缺點，比如：操作步驟較煩瑣，實驗時間長；另一方面，由于它運用了生物素-鏈抗生物素蛋白系統，而人體組織中，特別是肝、腎腦等組織中都有較高的內源性生物素，加上實驗過程中所必需的抗原修復也可導致內源性生物素的激活，最終使得非特異性的背景著色在某些組織中顯得尤為突出，從而影響結果的判斷。,而elivision二步法是90年代中期興起的一種新的免疫組化檢測系統，由于這種方法舍棄了傳統的生物素-抗生物素系統，直接將二抗和過氧化物酶通過載體聯合，形成

8、一個同樣可呈多級放大的多聚物，不僅降低了由于內源性生物素所導致的背景著色，而且減少了操作步驟，具有簡單、快速、敏感等優點，使免疫組化技術趨向于簡單化、方便化，是免疫組化技術的又一次飛躍，,更高的敏感度，更好的染色效果逐漸被病理技術工作者所認可。同時操作的簡單化，減少了煩瑣的操作過程中所帶來的染色結果的偏差和影響，更有利于免疫組化技術的標準化。,四、sp三步法與elivision二步法的比較,sp法 靈敏度高，特異性強 信號放大效果好 價格相對低廉 操作步驟較煩瑣，實驗時間長 不能防止內源性生物素的干擾,elivision法 靈敏度高，特異性強 信號放大效果好 價格相對偏高 操作步驟簡單，實驗時

9、間短 可以防止內源性生物素的干擾,五、免疫組化染色的自動化,隨著免疫組化技術的不斷普及和發展，更多的基因蛋白檢測抗體的問世，還有它日益在臨床診斷治療中的廣泛的運用，向我們提出了更高的要求，不僅要作到快速準確，定性定量，還要向高質量高標準方向發展，使免疫組化染色檢測走向更高的質量控制階段，提高結果的可信度、穩定性、可重復性，提高實驗室之間的重現性 。,敏度靈,而免疫組化的自動化無疑又將使我們的免疫組化技術向前發展一步。由于全封閉自動化控制替代了傳統的手工操作，確保每批染色結果的一致性和重現性，極大地減少了人工操作中出現誤差的幾率，因此，在不久的將來，它將推動免疫組化標準化的進程。,六、免疫組化染

10、色技術的應用,在常規的病理診斷中，大多數病例是可以在普通的he切片上作出明確的形態學診斷的，但也有約5-10%的特殊病例需要應用免疫組化染色來解決這一難題，特別是某些病例還需作出詳細的分型以指導臨床的治療，以及預后的判斷。,與病理診斷相伴隨的是，更多的基因蛋白檢測抗體的不斷問世，免疫組化技術在腫瘤及其它疾病的病理、病因等諸多方面的研究也在不斷走向深入，有力地促進了各學科領域的進展，在醫學研究中發揮著不可忽視的作用。,歸納以下幾條： 1：腫瘤良惡性的判斷 2：腫瘤的分類和分型 3：指導腫瘤的臨床治療及預后判斷 4：顯示組織中的特殊成分 5：病原體的檢測 6：用于腫瘤及其它疾病的組織學研究。,er

11、 pr cerbb2：er pr陽性的乳腺腫瘤患者大多對內分泌治療有效，緩解率高，復發率低，預后好。即使er/pr中只有一項陽性的患者，其預后也好于兩項全陰性的患者。cerbb2基因過度表達和擴增見于多種腫瘤，與腫瘤的分化程度和分級有密切關系，是腫瘤預后的參考指標，er pr cerbb2三者同時陽性表達的患者進行三本氧胺治療無效。er pr陰性，cerbb2陽性的患者可用基因靶向藥物赫賽汀治療,p53100,er100,pr100,her-2100,胃腸道間質瘤cd117陽性患者可用基因靶向藥物格列威進行治療。,egfr（上皮生長因子受體）：表達于多種正常組織，特別是復層上皮和鱗狀上皮的基底

12、層。乳腺癌病人egfr的過度表達，預示其生存期短，激素療效差。西妥昔作為一種單抗抗腫瘤藥物是egfr的抑制劑，它可以結合腫瘤細胞egfr位點，抑制腫瘤細胞增殖旁路，抑制腫瘤生長并促其凋亡。,vegf（血管內皮生長因子）：在體內可誘導血管新生。作用于血管內皮細胞，促進血管內皮細胞增殖，增加血管通透性。在腫瘤組織的血管形成中發揮重要作用。與腫瘤的生長，浸潤和轉移密切相關。,七、免疫組化操作中的細節問題及注意事項,1：組織的前期處理是做好免疫組化染色的保證。如固定及時與否、固定充分與否、脫水透明過分與否等，這些因素可使組織結構不清晰，抗原彌散，造成假陰性或假陽性。脫片。,2：載玻片需防脫片處理。,3：切片需4微米，裱貼牢固，沒有氣泡，烤片充分,4：脫蠟、脫二甲苯以及酒精等每一個步驟，要徹底干凈。,5：熟悉免疫組化步驟及每一步的意義所在,6：注意一抗、二抗、所用標記酶及顯色劑是否相互匹配。,7：抗體為高濃度的原液時，有必要對抗體的稀釋度及反應時間進行摸索。,8：根