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1、第二章 基因工程的工具酶與載體,第三節(jié) 表達載體 二、融合蛋白表達系統(tǒng),表達載體的基本結構,表達蛋白的識別,表達蛋白的分離,表達蛋白的活性,蛋白表達的高效性,蛋白表達的可控性,1、融合蛋白表達系統(tǒng)的概念,蛋白質融合表達是指外源基因與載體已有的擔體蛋白的編碼基因拼接在一起，并作為一個新的開放閱讀框進行表達,目的基因,半乳糖苷酶（LacZ） 容易識別、免疫親和分離 綠色熒光蛋白（GFP） 容易識別 谷胱甘肽轉移酶（GST） 免疫親和分離、維持良好構象 金黃色葡萄球菌蛋白A（SAPA）免疫親和分離 泛素蛋白（Ubi） 維持良好空間構象 硫氧化還原蛋白（TrxA） 維持良好空間構象,2、用于融合蛋白構

2、建的高表達的擔體蛋白,3、融合蛋白表達載體,T7載體系統(tǒng) His標簽 +目的蛋白,谷胱甘肽S轉移酶（GST）融合蛋白表達系統(tǒng),ATG,加強GFP表達的哺乳動物細胞融合蛋白表達質粒,GFP融合蛋白的表達,DNA T4連接酶,Sac I 6100bp Pst I 6100bp Sac I + Pst I 4700+1400bp,COS7細胞系,化學斷裂法： 溴化氰（CNBr）甲硫氨酸殘基 酶促裂解法 單殘基位點與多殘基位點斷裂法,4、融合蛋白中目的蛋白的分離和回收,酶促裂解法：多殘基位點,4、融合蛋白中目的蛋白的分離和回收,表達率高，穩(wěn)定性好； 通過親和層析容易對擔體蛋白進行分離和純化； 可以幫助目的蛋白形成正確的空間結構。 容易將擔體蛋白從目的蛋白中裂解出來,5、融合蛋白表達的優(yōu)點,6、構建融合蛋白表達載體的注意事項,目的蛋白的方向 終止密碼子問題 目的基因移碼問題,ATG,EcoR I P1引物,P2引物 BamH I,TGA ACG,終止密碼子問題,融合蛋白表達載體移碼問題,ATG CCA GAC GGG CCC AAT ACCTAA 目的基因,酶切末端加ATG之間的堿基序列必須是3

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