密級： 論文編號： 中國農業科學院 碩士學位論文 牛結核病 多重組抗原 間接 劑盒的研制及應用 of it a of it a I 摘 要 為了建立一種有效的牛結核病間接 法， 本研究設計了 3 對引物，從牛分枝桿菌 菌株的基因組中 采用重疊延伸剪接技術 (by 得融合基因 經過多次亞克隆步驟后， 將 段 連于同一表達載體 )中，獲得了重組質粒 該重組質粒轉化 腸桿菌感受態后，經 導 表達 帶有兩個六組氨酸標簽的 融合蛋白 以 合層析的方法 純化該 融合 蛋白。 析表明該蛋白具有良好的免疫反應活性。 以 融合 蛋白 為包被抗原，在確定了最佳封閉液和最佳包被條件后，采用正交試驗設計的方法摸索了最佳抗原、一抗和二抗稀釋度， 以及 最佳一抗 、 二抗作用時間和顯色時間，建立了檢測牛結核病抗體的間接 法。 用 150 份健康牛血清 的 檢測 結果 統計分析后確定診斷方法的判定標準，即樣本 S/P 大于 陽性，小于 陰性，兩者之間為可疑。 通過對 85 份牛結核病血清和 100 份 無結核病牛血清 的檢測結果表明， 法的敏感 59/85），特異性為 96%（ 96/100）。對 50 份 性血清和 67 份 性血清（ 117份 ） 進行檢測，并 與 試 進行 比較 ， 本方法與 試診斷的 符 合率為 本研究還進行了試劑盒的初步組裝， 并將該試劑盒應用于現地血清樣品的檢測， 為產業化開發奠定了基礎。 研究 表明本 試劑盒具 有較好的應用價值和產業化開發前景。 關鍵詞： 牛結核病，融合蛋白，間接 n to an NA of NA . NA of by a +) to a It by of by to be A of to 34) of of 150 in to , .4 as .5 .4 as 5 00 59/85） 6%（ 96/100） . 117 67 of PD 0 of PD PD PD in is a of 錄 1 緒論 . 1 內外研究現狀 . 1 結核病的流行和控制 . 1 結核病診斷技術的研究進展 . 3 結核病疫苗的研究進展 . 5 究目的和意義 . 9 究內容和方法 . 10 分枝桿菌抗原 . 10 . 10 2 試驗部分 . 11 分枝桿菌抗原 融合表達 . 11 料和方法 . 11 果 . 18 論 . 22 接 法的建立及試劑盒的組裝 . 22 料和方法 . 22 果 . 26 論 . 35 3 結論 .考文獻 .錄： .錄 1：測序結果序列（ 期望序列（ 比對： . 43 致 謝 . 者 簡 歷 .國農業科學院碩士學位論文 第一章 緒論 1 1 緒論 內外研究現狀 結核病的流行和控制 牛結核病 (主要是由牛分枝桿菌 (起的一種牛的慢性消耗性傳染病，該病可通過病畜傳染給人類或其他動物。自從 1882 年 次分離培養并詳細描述了結核分枝桿菌以來，人們開始 漸漸 研究和認識 分枝桿菌（ 1882； et 2004）。 到 1898 年 ， 次將牛分枝桿菌 (M. 其它的分枝桿菌明確區分開來（ 898； et 2003）。牛分枝桿菌主要感染不同種屬的溫血動物，包括有蹄動物、有 袋動物、食肉類動物、靈長類、鰭腳類動物和嚙齒類動物在內的 50 多種哺乳動物，還包括類鸚鵡鳥、石鴿、北美洲烏鴉等 20 多種禽類。其中牛是最敏感的動物（ et 1995）。 人對牛結核也很敏感，且很多病例與感染動物有接觸史。由于牛和人類的關系（牛奶、牛肉及制品等）較其他動物更為密切，因此約 10%左右的人結核病（不同的國家和地區不同有不同的比例）是由牛分枝桿菌引起。牛結核病的傳染流行不僅會嚴重影響到畜牧業的健康持續發展，而且還威脅著人類的身心健康。因此，早在 1960 年世界衛生組織專家委員會第七次會議 就指出：在那些還流行牛結核病的國家中，人類始終受到該病的威脅，除非消滅牛結核病，否則人類結核病的控制是不會成功的。 牛結核 病 感染一般發生在不太發達的國家和發達國家的特殊人群，他們因 食用未經巴氏消毒的奶制品而感染。人感染牛結核 病 的另一種來源是與感染動物的接觸，如屠宰場工人、獸醫和動物訓練員。在發生該病的這些人群當中，以飛沫形式傳播已被確認為是最可能的感染途徑。后來，有了人結核 病 以飛沫形式傳染給動物的報道（ et 1994； et 1998； et 2005）。 呼吸道傳播是牛結核病的主要傳播途徑。吸入了被污染的飛沫或媒介是傳播牛結核病的最主要的方式 ， 只須很少量的牛分枝桿菌即可引起感染。野生動物間常以此方式傳播牛結核病，如英國的歐洲獾和新西蘭的刷尾袋鼯。 采食了被污染的飼料和飲水是另一種重要的傳播途徑。動物可通過 采 食了有傳染性的黏液、鼻汁、糞便和尿液等或食入了被污染奶牛的牛奶而經口感染。由于牛分枝桿菌具有長時間在體外存活的能力，因此食入了被牛分枝桿菌污染的食物即可造成種間疾病的傳播。此外 ， 還有通過撕咬傳染和垂直傳播的報道（劉思國 ， 等 2005）。 目前，多數國家都不 提倡用疫苗接種的手段來控制牛結核病，而采用屠宰 試診斷陽性牛的策略（ 2001a）。許多發達國家就是利用該策略有效地控制了牛結核病。美國是世界上第一個實行根除牛結核病的國家。自 1917 年實施消滅牛結核病的計劃以來，已經使牛結核病發病率降為 以后一直呈零星散發。美國于 1998 年實現了無牛結核病目標 ,。 但由于野生動物以及人類結核病的發生和流行，后來在密歇根州又有發生。所以，美國的牛群處在不斷地檢疫和高度警惕之中 (et 2000； 2003)。歐共體國 家于 20 世紀 50 年代簽署了控制牛結核病的貿易協定。北歐的丹麥、比利時、挪威、德國和荷蘭等國已基本消滅了牛結核病 ,英國和中國農業科學院碩士學位論文 第一章 緒論 2 法國處在控制狀態。 2000 年英國提供的數據表明 ， 全國獸群中本病的發生率為 過去十幾年間英國西南部的發病率成指數上升。獾被認為是本病在大不列顛和愛爾蘭重要的傳染源，目前正在進行大量試驗來評價獾在牛分枝桿菌控制中的作用 (et 006)。與英國和美國的情況相似，澳大利亞、新西蘭等國家已經消滅了牛結核病 ， 但近年來由于野生動物獾和狐貍等動物結核病的出現 ,致使牛又感染了 結核病（ 2001a）。 近年來發現了很多野生貯存宿主，如新西蘭的刷尾袋鼯和海獅、英聯邦的歐洲獾、美國密歇根的白尾鹿、水牛和南非的羚羊，其他的如大象和犀牛也是牛分枝桿菌的宿主。野生動物通過排泄物將結核桿菌排出體外，污染了飼草、飼料和飲水等 ,家畜采食后感染結核桿菌，進而造成牛結核病的發生。這是牛結核病難以消滅而持續存在的主要原因 (006)。 第三世界國家牛結核病廣泛流行，嚴重地危害著人類的健康和畜牧業的健康發展。亞洲和非洲是牛結核病和人類結核病的高發區。在所有的非洲國家中 ， 只有 7 個 國家考慮到牛結核病是必須申報的疾病而采取檢疫和部分撲殺政策 ， 只有 15%的結核病牛群采取檢疫和撲殺政策 ， 其余 48個國家采取的控制措施不當或根本就沒有采取任何措施。因此，大約 85%的牛群和 82%的非洲人生活在采取部分控制措施或根本沒有采取任何控制措施的環境中。 1996南非克洛格國家公園爆發了結核病。據統計公園南部的水牛感染率達 42%，中部地區的感染率為 21%，該結核病的自然宿主是水牛 ,這種無種界限的相互傳播是以前沒有報道的。亞洲國家中 ， 只有 7 個國家采取檢疫和部分撲殺的控制政策 ， 并考慮進行申報 ， 其余 29 個國家只采取了部分控制政策或根本沒有采取控制措施。在亞洲國家中 ,因牛結核病感染 ,只有 6%的牛和低于 1%的水牛采取了申報檢疫和撲殺政策 ， 94%的牛和 99%的水牛采取了部分控制措施和沒有采取任何控制措施。因此 ， 大約94%的亞洲人生活在采取部分控制措施或根本沒有采取任何控制措施的環境中。由于結核病感染宿主的廣泛性，從而造成了結核病的不斷發生，給預防工作造成了很大的困難（劉思國 ,等 2005）。 隨著我國人民生活水平的不斷提高 ， 人們對健康生活的要求也迅速提高 ， 與之相一致的是乳制品需求量的急速攀升 ， 隨之帶動了奶牛業 在近幾年的迅猛發展。在這樣一種情況下 ， 我國的牛結核病疫情正在受到日益廣泛而密切的關注 （楊衛沖， 2004） 。 1985 年和 1987 年進行的兩次全國奶牛抽樣調查結果 ,牛結核病患病率分別為 1979 年、 1985 年和 1990 年三次全國結核病流行病學調查顯示 ， 由牛型分枝桿菌導致的結核病所占的比例分別為 徐美英，等， 1998） 。此后未有全國性的調查統計數據見諸報道 ， 然而地方性的疫情調查顯示情況不容忽視（黃紀銓， 2000；郭海晏，等 2002；朱長光，等 1999）。 近年來 ，隨著耐藥性菌株的產生及個體養牛戶的增加，結核病的陽性檢出率在逐年上升。因此，在我國，牛結核病作為一個危害甚大的傳染病，再次引起人們的關注。在 1999 年的動物疫病病種名錄中，牛結核病被列為牛病中的二類動物疫病。牛結核病已經給我國的養牛業造成了巨大的經濟損失，尤其是對奶牛的危害極其嚴重。患病奶牛的壽命縮短，產奶量顯著降低，母牛常常不能懷孕，使役牛患病后逐漸消瘦，勞動能力減弱，病牛乳汁將給人類的健康帶來了威脅。牛結核病影響著我國養牛業健康發展和人類的健康。 中國農業科學院碩士學位論文 第一章 緒論 3 結核病診斷技術的研究進展 核菌素皮內試驗 結核菌素皮內試驗 (目前被世界各國廣泛采用，并且是世界動物衛生組織(薦的診斷牛結核病的唯一方法。但該方法有許多顯而易見的不足之處： 不能區分各型分枝桿菌，對因感染其它分枝桿菌而致敏的動物沒有特異性，在一些對牛群進行 疫的國家或地區，不能鑒別免疫動物與感染動物； 在那些因病情嚴重而導致免疫反應低下的動物易出現假陰性； 由于遲發型變態反應 (滯后效應，此方法在一段時間 (30d)內不能重復進行； 質量和劑量、結果判定標準及操作方法等因素均能影響檢測結果，故需嚴格進行質量控制； 還必須在活體上試驗，不便于大規模的流行病學調查，也不能應用于回顧性的流行病學分析。在一些國家，使用比較結核菌素試驗 (比較皮內試驗， 即在頸部一側的不同部位，同時注射 M. 兩種 夠提示被檢動物是 染還是非特異的 應（ 1999；楊衛沖， 2004）。 結核病 斷方法的研究進展 結核菌素皮內試驗已經不能滿足大規模的流行病學調查和牛結核病疫情進一步控制的要求。因此， 需要一種高特異性和高敏感性的血清學診斷方法來彌補它的不足 。 法因其快速、簡便和成本低而受到青睞。最早，人們用 建立了 et 983)。但是有研究表明，該方法的特異性和敏感性都不能令人滿意 (et 987, 1990)。因此，牛分枝桿菌培養濾液中的單個蛋白被純化出來用作 斷抗原，但蛋白純化步驟繁瑣、成本高而實用價值低（ et 989）。隨著牛分枝桿菌分子生物學和基因工程技術的進步，包括 立了間接 法（ et 002）。這種方法較 異性有所提高，但敏感性卻更低了，而以多種抗原 雞尾酒 進行 驗有望提高其反應的敏感性（ et 996）。 驗 最早 由 于 1990 年建立 （ et 1990） ，其原理為致敏的外周血淋巴細胞（ 體外培養的條件下，受特異抗原 (如 激后被活化，表達并分泌 過一定的技術手段 (如 培養上清中的 行檢測，或者對 表達進行定量或者半定量 (如 還可通過 術對分泌 淋巴細胞進行計數 (形成的斑點數 )及對單個細胞分泌的 行定量 (形成的斑點大小 )，其結果與淋巴細胞增生試驗具有很好的相關性。目前， 應用最普遍 的是 法測定 肝素抗凝血液和 37 培養過夜， 或 以 者用于檢查交叉反應 )作為全血培養的刺激物 ， 第二天收集血漿樣品并以夾心 測 et 997） 。該 測定系統簡便快速，便于用作疫情監測時大量樣品的測試。與結核菌素皮內試驗相比 , 定法不僅簡單快速，靈敏度和特異性 (尤其是后者 )高，而且由于減少了前者試驗中操作和解釋上的主觀性，中國農業科學院碩士學位論文 第一章 緒論 4 使結果更為客觀可靠。而且，在皮內試驗進行后的 8內再進行 驗，其靈敏度和特異性未 受 顯著影響 (分別為 85%和 93%)，因此可以作為皮內試驗理想的補充實驗 (et 000)。 最近的研究發現，用 為刺激抗原，可以大大減少交叉反應，從而顯著提高該方法的特異性。使用 牛群進行免疫接 種并不會影響對疫情的監測 ， 能夠同時實施疫情監測計劃和免疫接種計劃，所以該方法尤其適用于那些對牛群進行 種的國家或地區 (et 999； 2001b)。 牛 驗的大范圍田間試驗已在世界上許多國家 (包括澳大利亞、愛爾蘭、比利時、新西蘭、阿根廷、西班牙、意大利和美國 )完成，并在澳大利亞、愛爾蘭和新西蘭被批準為正式試驗。以 為抗原，該法 敏感性 約為 特異性約為 et 000）。若以 雖然 敏感性 有所下降，但是特異 性可達 2001 年 ， 報道，通過使用混合了 雞尾酒 抗原進行刺激，可使該試驗的特異性達到 100%。診斷上的高特異性將大大降低大規模實施 檢疫 計劃的經濟成本，從而有利于這一計劃的大范圍推廣實施。 菌體成分的檢測 998)報道了利用薄層層析技術 (通過分析 GL( 可以快速對 行檢測和鑒定。該技術只需 10細菌培養物，與傳統的生化鑒定方法相比具有簡便快速的優點，因而是一種可靠的替代方法。還有學者利用過氧化物酶標記的單克隆抗體檢測 體抗原 (如 )的免疫過氧化物酶試驗檢測法。其優點是檢測速度快、成本低、操作簡便、在檢測分枝桿菌混合感染時尤其出色；缺點是結果易受標本采集和病程影響，準確率比較低。 巴細胞增生實驗 致敏的外周血淋巴細胞 (特異性抗原 (如 )刺激下 ， 可使抗原特異性 T 淋巴細胞亞群發生增生反應。經典方法使用同位素對合成 須的某種核苷酸進行標記。最近有報道使用 55代同位素標記的胸腺嘧啶核苷。 一種胸腺嘧啶核苷的類似物 ,可取代胸腺嘧啶核苷參與 合成。被結合的 由熒光標記抗 體識別并結合 ,配合流式細胞儀可以對其進行識別并計數。通過測定外周血循環中的增生淋巴細胞的比例可了解淋巴細胞增生的程度 ， 間接反映淋巴細胞被特異性 抗原致敏的情況 ， 從而分析動物機體對 細胞免疫狀態。 合酶鏈反應 (術 ) （ 1999）從 序列中分別選擇一段高度保守的區域設計引物對樣本進行擴增，由于不同分枝桿菌基因組中插入序列的不同，可以鑒別多種分枝桿菌，且結果具有很好的穩定性和重復性。 （ 2002）對結核分枝桿菌復合群 ( 16 列設計引物，能從組織中一次檢測出這兩類分枝桿 菌。該試驗秉承了 術高度靈敏的特性，而且通過對不同的特異區段設計相應引物，能夠鑒別各種分枝桿菌。 中國農業科學院碩士學位論文 第一章 緒論 5 （ 2003）發現，可以將人巨噬細胞系 細胞具有 體 ,缺乏膜表面及胞漿免疫球蛋白，易于培養且對 感 ,是擴增牛 有效媒介 )用來從臨床樣本中分離和增殖分枝桿菌，經過 48 小時培養可以將微量的分枝桿菌大量增殖。收集培養后的細胞 ,隨后可以通過半巢式 (測被感染的 胞中牛 M. 或 通過流式細胞儀檢測分子伴侶 10(0，也有人稱之為 為 特有 )的表達和分泌 ， 從而檢測 酸探針技術 （ 1997）將 因組上一段長度為 165有 動子的 行放射性標記并將其作為探針，提取待測菌株的 限制性內切酶 消化，跡后與探針進行雜交 。 該方法綜合利用了 的限制性酶切 片段 長度多態 (術和 針技術，能夠從混合樣品中一次檢出 多種致病或非致病分枝桿菌。 （ 1997）建立了間隔區寡核苷酸分型技術 (用以檢測 是利用一段特定的間隔區寡核苷酸與體外擴增得到的 這種雜交具有菌株特異性 ， 因而可以 同時對 各個菌株進行快速的鑒定和鑒別 ， 還可鑒別 方法只需要少量的 并可直接利用細菌裂解物進行試驗 ， 無需進行細菌的傳代培養和提取 果分析也相當簡便。 （ 2000）在術的基礎上 ， 結合運用序列捕獲 (術 (目的是富集樣本中的細菌 可以直接從組織樣本中檢測一組間隔區寡核苷酸型 (式 ， 從而可以快速檢測出 結核病疫苗的研究進展 卡介苗（ 由 1908間發展出來的。時至今日， 是防治結核病的唯一可用疫苗 (et 2004)。但是， 免疫保護力卻并不令人滿意，因不同地區不同人群差異很大（ 0%，也缺乏統一的評價標準 (003)；且，環境分枝桿菌往往導致 et 002)；此外， 種牛無法用結核菌素 （ 驗與自然感染牛區分（ 2001）。所以，世界各國都在致力于改進 研制一種新型有效的結核病疫苗。 因工程重組或減毒的活疫苗 這是一類通過各種基因工程手段，發展起來的基于主要保護性抗原和活載體（ 他分枝桿菌、沙門氏菌或痘病毒）的活疫苗。 重組的卡介苗（ 多次傳代過程中，毒力下降的同時，由于抗原蛋白的編碼基因也發生突變或丟失，其抗原性也下降。針對該不足，通過質粒等載體植入結核桿菌主要保護性抗原，使其能分泌這 些保中國農業科學院碩士學位論文 第一章 緒論 6 護性抗原，從而增強 免疫效力。重組 現今唯一保護力超過 可用疫苗。 一能表達 融合蛋白，其二能分泌 白。免疫試驗結果表明前者的保護力比 強，后者的保護力與 當 (003)。 了包含更多的抗原和具有更強的保護力外，它還擁有 所有優點： 安全，接種發病率僅為百萬分之一。 生產成本低，它沒有花費昂貴的合成和純化步驟。 能在巨噬細胞內復制，穩定地釋放各種抗原物質。 穩定易保存。但是， 與 樣不能用于免疫缺陷的個體，也干擾 驗 (000)。 一種很有前途的結核病疫苗。通過以下途徑還可以進一步改進 使用具有更強啟動子的載體，增加抗原的表達量。 增加抗原的種類。 改變免疫接種途徑 (003)。 使外源基因與細胞因子 融合表達或共表達。但是， 擾 驗嚴重限制了它在牛體上的應用。因此，還未見 于牛的報道。進一步提高 保護力和發展新的牛結核診斷方法可望能解決這一應用上的限制。 非致病性分枝桿菌疫苗及其作為載體的重組疫苗 尋找非致病性的分枝桿菌作為結核病的疫苗。研究較多的有母牛分枝桿菌（ 恥垢分枝桿菌（ 田鼠分枝桿菌（ 哈瓦那分枝桿菌（ 非致病性的分枝桿菌疫苗具有生長速度快和安全等優點。而且它與 樣能引入外源基因構建成重組的非致病性的分枝桿菌疫苗（呂華坤，等， 2004）。 以其他細菌或病毒為載體的重組疫苗 據報道將結核分枝桿菌 的主要保護性抗原引入減毒的沙門氏菌或痘病毒內制成結核病疫苗。其保護力與 當。而且，通過引入合適的抗原能設計出不干擾與 驗的疫苗（范雄林，2001）。 減毒結核分枝桿菌疫苗和營養缺陷型疫苗 用基因工程的方法剔除其毒力因子或使之產生營養缺陷，從而改造牛分枝桿菌、結核分枝桿菌或 為新型疫苗。 將牛分枝桿菌的 因敲除得到的突變株對豚鼠的致病力明顯減弱。而且，接種的豚鼠還不產生針對 遲發性變態反應（ 可用 試區 分疫苗接種和自然感染（ 2000）。 的研究表明脯氨酸或色氨酸營養缺陷型結核桿菌，在 10 天之內 90%以上被巨噬細胞殺死。在小鼠（ 內兩者都無毒力，并且能提供相當于（前者）或高于（后者） 保護力（ A， et 2001）。 亮氨酸營養缺陷型 能在小鼠體內和培養的巨噬細胞內復制，免疫牛不產生針對 et 996）。 由此可見，減毒結核分枝桿菌疫苗和營養缺陷型疫苗有如下優點： 安全，它甚至對免疫缺中國農業科學院碩士學位論文 第一章 緒論 7 陷（ 體都沒有毒力。 免疫效力較強。 可望發展成為一種結核的標記疫苗。 白亞單位疫苗 亞單位疫苗是由一個或多個分枝桿菌組份加上適當的免疫佐劑而成的疫苗。當前作為亞單位疫苗的候選分子的主要是蛋白性抗原。其中研究得最多的是培養濾液蛋白（ 熱休克蛋白（ 范雄林， 2001）。 結核蛋白亞單位疫苗可分為培養濾液蛋白（ 合物疫苗、單一蛋白亞單位疫苗、復合蛋白亞單位疫苗、融合蛋白亞單位疫苗以及表位亞單位疫苗。 培養濾液蛋白（ 苗在小鼠體內能誘導與 當 的保護力。 用牛分枝桿菌 牛 合物作為疫苗免疫牛。 再 用牛分枝桿菌有毒力株攻毒。結果表明，該疫苗能夠提供優于 保護力 (et 000)。 合物疫苗成分復雜而不確定 ,分枝桿菌生長緩慢而不易大批生產，而且該疫苗的免疫牛無法用 試與自然感染牛相區別 (et 002)。相比之下，單一蛋白亞單位疫苗、復合蛋白亞單位疫苗和融合蛋白亞單位疫苗則有一定的優勢： 它是一種明確的產物。 縮短了生產周期。 由于融合蛋白亞單位疫苗是以融 合的形式產生的，因此其中的蛋白之間能互相增強免疫原性 (et 001)。 它不干擾 試診斷。 對被環境中的分枝桿菌致敏的動物同樣有效 (et 002)。 此外，表位疫苗也因其具有安全和簡單的優點而受到重視。 研究了兩個來自 別表位 1氨基酸殘基（ 51氨基酸殘基（ 作為疫苗的可能性。他們發現 能誘導機體的免疫應答。但是 ，只有 提供足夠強的與 當的保護力。而且無論是自然感染還是疫，機體產生的免疫反應都是針對 。這一結果表明：表位多肽可以作為抗結核的疫苗；而且具有簡單、安全、能持續誘導強烈免疫反應但不被反應清除以及所有亞單位疫苗具備的優點 (et 000)。 酸疫苗 1990 年， 發現將細菌半乳糖苷酶基因注入肌細胞能導致基因細胞核內轉導并合成半乳糖苷酶。 1992 年， 證明注射質粒 激發機體 的免疫應答。至此，核酸疫苗就宣告誕生。 我們今天所說的 苗是指將抗原的基因插入質粒載體構建成的重組載體；它能在細菌體內擴增；通過肌肉注射或基因槍等方式導入動物體后，能穩定表達抗原物質，誘導機體免疫應答。 1996 年， 和 各自構建了針對結核的 苗 (003)。從此，核酸疫苗成了結核疫苗研究中的熱門。牛結核的核酸疫苗也取得了很大的進展。 編碼單個抗原的 苗 用分別編碼 三個 苗做牛體免疫試驗。發現 誘導 細胞分泌特異性的 明編碼 第一章 緒論 8 的 苗能夠使牛產生針對牛結核的細胞免疫和體液免疫。而編碼 苗誘導的免疫反應則相對較弱，編碼 苗則幾乎沒有誘導產生免疫反應。在他們的研究中還發現這三種 苗免疫的牛都不對結核菌素皮試產生反應 (et 000)。 997)等的研究發現 苗有免疫治療的作用。 對 苗的治療作用的機理作了探討。他們發現： 苗治療組小鼠的肺部有淋巴細胞浸潤； 這些浸潤的淋巴細胞中， 胞表面 表達上調；而 胞表面只有 達的上調； 見， 苗的治療作用主要是增強了以細胞毒作用為特征的 型細胞免疫反應，從而減少荷菌量 (et 004)。 編碼多個抗原的 苗 編碼單個的 苗保護力一般都低于 多個候選基因的聯合作用則可以提高 怡等（ 2003）構建了分別編碼 種抗原基因的苗。將這三者混合成組合 苗再免疫小鼠。結果表明該 苗有比 好的保護力。 組合 苗在體內表達時，可能會產生競爭，使得某些抗原蛋白不能得以表達。而將多個基因插入到一個載體上而成的嵌合 苗，在體內表達融合蛋白，則可以避免這種情況。（ 2004）構建了融合表達 苗。他們用小鼠做免疫試驗和攻毒試驗。結果顯示： 結果表明在動物的不同器官融合 苗都有不同程度的表達； 融合 苗誘導的體液免疫和細胞免疫均比 導的強； 攻毒小鼠有更高的存活率，肺部的荷菌量也更少。可見，融合 苗更有應用前景。 表位 苗 （ 2004）將編碼結核分枝桿菌抗原 38白的 位 M（ 90 到 198 位氨基酸殘基）和 38（ 38白的第 166 到 175 位氨基酸殘基 ）的 段重組到 體中，構建了表位 苗： 了觀察 S 序列（ S,泛素（ Ub,兩個表位的作用，他們還構建了 個表位 苗。小鼠免疫實驗發現：表位 苗能誘導表位特異的 答。