第九章 臨床病原體檢測,提 綱,第一節：標本的采集運送、實驗室評價和檢查方法第二節：病原體耐藥性檢測第三節：臨床感染常見病原體檢測第四節：病毒性肝炎檢測第五節：性傳播疾病病原體檢測第六節：醫院感染常見病原體檢測,教學目的與要求：,了解掌握臨床病原體檢查的主要內容（標本采集、標本驗收、藥敏檢查、耐藥性檢測、臨床常見病原體、病毒性肝炎、性傳播疾病、醫院感染）、檢測原理以及臨床實際應用的重要意義。,重點與難點,標本采集的原則及各種檢查方法的適用范圍及其優缺點藥物敏感的常用試驗方法及其特點耐藥菌檢測試驗各種類型臨床常見病原體的檢查甲、乙、丙型肝炎的檢測方法各種性傳播疾病病原體的檢測方法、篩選試驗、確診試驗及金標準院內感染定義,提 綱,第一節：標本的采集運送、實驗室評價和檢查方法第二節：病原體耐藥性檢測第三節：臨床感染常見病原體檢測第四節：病毒性肝炎檢測第五節：性傳播疾病病原體檢測第六節：醫院感染常見病原體檢測,臨床細菌學檢驗的特殊性,依賴于細菌生長采集時間 （發燒？）運送方式 （密閉與否，保溫與否？）感染的細菌種類及生長特征 （苛養菌）病人是否使用抗生素 （抗生素的影響）其他：消毒劑，白細胞吞噬等容易受環境中的細菌污染采集方法 （無菌操作，避免污染）放置時間 （及時運送，避免細菌死亡）,基本原則1：正確的標本類型和采集部位以反映有效病程2：采集和運送應無菌操作，避免污染3：盡快送檢4：視所有標本為傳染品，高度污染標本要有明顯標識5：注意生物安全，標本用后要做消毒處理,一、標本采集和運送,（一）血液標本的采集,適應癥：疑似菌血癥、敗血癥或膿毒血癥的病人酒精棉球消毒，防止污染。靜脈采血后，將血液注入培養瓶內 。采集時間：一般在抗生素使用前，于發熱初期或高峰期采血。采集頻率：24小時內采血23次可提高陽性率，且在不同部位。采血量：血液與培養基的比例為1：5-10，一般成人血量510ml，嬰兒1-5ml。,（二）尿液標本的采集,首次晨尿，無菌采集中段尿10-20ml。排尿困難者考慮導尿采集標本。如考慮厭氧菌感染，采取膀胱穿刺法采集標本。,（三）糞便標本采集,自然排便者：挑取膿、血或粘液部分于清潔容器中送檢。排便困難者：采用直腸拭子采集。懷疑霍亂弧菌感染引起的腹瀉，立即接種或將標本置于堿性蛋白胨水或卡-布運送培養液送檢。傳染性腹瀉應連續送檢3次。,（四）呼吸道標本采集,類型：鼻咽拭、痰和經氣管采集的標本。采集時間：晨痰，且在取痰前用清水反復漱口。方法：（1）自然咳痰法：（2）氣管鏡下采集法；（3）氣管穿刺法。WBC 25/lp,上皮10/lp。上呼吸道存在正常菌群，在采集標本與結果分析時應予考慮。,（五）腦脊液與其它無菌體液采集,臨床醫生采用腰椎穿刺，抽取2-3ml，置于無菌容器中立即送檢，不得保存于冰箱中。腦膜炎的主要病原體：腦膜炎奈瑟菌、肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌。,（六）眼、耳標本采集,（七）泌尿生殖道標本采集,性傳播性疾病取尿道口分泌物、外陰糜爛面病灶邊緣分泌物、陰道宮頸口分泌物和前列腺液等。 生殖道皰疹常穿刺抽取皰疹液。盆腔膿腫患者則于直腸子宮凹陷處穿刺取膿液。所有標本收集后于4保存直至培養,（八）創傷、組織和膿腫標本,損傷范疇較大的創傷，從不同部位采集多份標本 . 清除污物，以碘酒、酒精消毒皮膚.開放性膿腫：無菌棉拭子采集膿液及病灶深部分泌物。封閉性膿腫：無菌干燥注射器抽取。疑為厭氧菌感染，取膿液后立即排凈注射器內空氣，針頭插入無菌橡皮塞送檢。,標本送檢,標本要求盡快送檢，否則影響陽性率。烈性傳染病標本需專人護送。,二、標本的實驗室質量評估標準,1標本必須注明姓名、年齡、性別、采集日期、臨床診斷、檢驗項目等基本信自。 2仔細核對標本采集日期和送檢日期。延誤的標本，一般情況下不接收。通常用于細菌學檢驗的標本的存放不要超過24h。而病毒檢測的標本可于4存放23天。 3檢查送檢容器是否完整，有無破損或滲漏等情況，若有則不予接收。 4標本儲存、運送方式不當，不予接收。 5明顯被污染的標本不予接收。6標本量明顯不足的標本，不予接收。 7同一天申請做同一實驗的重復送檢標本(血培養除外)，不予接收。 8對于烈性傳染病標本的采集和運送應嚴格執行相關規定，要有完善的防護措施，按規定包裹及冷藏，附有詳細的采樣及送檢紀錄，由專人護送。,標本是否合格，以保證檢測結果的準確性！,三、檢查方法,（一）直接顯微鏡檢查（二）病原體特異性抗原檢查（三）病原體核酸檢查（四）病原體的分離培養和鑒定（五）血清學試驗,（一）直接顯微鏡檢查不染色標本,不染色標本：適用于檢查生活狀態下病原體的動力及運動狀況。方法：壓滴法、懸滴法。意義：在不染色狀態下借助暗視野顯微鏡或相差顯微鏡觀察病原菌的動力、活動方式。部分病原體可借此初步診斷，如梅毒螺旋體。,（一）直接顯微鏡檢查染色標本,染色標本目的：了解細菌的形態、染色性或觀察宿主細胞內包涵體。方法：革蘭染色、墨汁染色、抗酸染色、熒光染色,革蘭染色,細菌的形態、染色性的特征,革蘭染色,墨汁染色,莢膜抗吞噬30%-50%的患者伴有免疫功能低下等疾病， 8%左右的AIDS患者伴有隱球菌性腦膜炎，預后極差。中樞神經系統存活與腦脊液中缺乏抗體和補體激活系統有關抗真菌治療:兩性霉素B,氟康唑,抗酸染色,熒光顯微鏡用于標本經熒光染色后直接檢出某些病原微生物，用形態學和免疫學相結合的可特異地家側某些病原微生物的存在。,熒光顯微鏡用于標本經熒光染色后直接檢出某些病原微生物,熒光染色,SARS（severe acute respiratory syndrome ）病原體的確定。,直接顯微鏡檢查電鏡檢查,電鏡檢查不常規用于臨床，對某些病毒感染卻有確診的價值,電子顯微鏡發現為某種冠狀病毒,電鏡檢查不常規用于臨床，對某些病毒感染卻有確診的價值,意義無菌體液的直接鏡檢對病原體診斷具有一定意義。對正常菌群寄居腔道的分泌物圖片鏡檢可提示進一步檢查的步驟、采取的方法和確定分離鑒定病原體所需的培養基。,意義,3.由于臨床標本中常含有一定的抗菌物質，以致分離培養可為陰性，此時的鏡檢往往可能在診斷是起作用。4.熒光顯微鏡用于標本經熒光染色后直接檢出某些病原微生物5.電鏡檢查不常規用于臨床，對某些病毒感染卻有確診的價值。,(二)病原體特異性抗原檢查,利用抗原抗體之間的特異性反應，用已知抗體檢測患者血清及其他體液中的待測抗原，借助免疫熒光技術、酶聯免疫技術、化學發光技術、膠乳凝集試驗、對流免疫電泳等技術檢測標本中未知的病原體抗原，其診斷價值常以標本不同而各異。 標本中如果存在多種正常寄居微生物，可因交叉抗原存在而不能肯定診斷。檢測細菌不同的抗原構造，還可分析細菌的菌群和血清型，如沙門菌屬、志賀菌屬和霍亂菌屬等,細菌的血清分型：O1群霍亂弧菌的菌體抗原由A、B、C三個抗原成份組成,利用抗原抗體之間的特異性反應，用已知抗體檢測患者血清及其他體液中的待測抗原,檢測細菌不同的抗原構造，還可分析細菌的菌群和血清型，如沙門菌屬、志賀菌屬和霍亂菌屬,（三）病原體核酸的檢測,常用試驗方法有：PCR。polymerase chain reaction聚合酶鏈式反應，簡稱PCR技術。核酸探針雜交技術Realtime PCR基因芯片等,PCR技術簡史,DNA的復制核酸體外擴增的設想聚合酶鏈反應的發明,基因組DNA,獲取特定DNA片段,擴增特定DNA片段,PCR的基本原理,PCR反應條件PCR過程PCR的特點,PCR的基本原理,PCR反應條件PCR過程PCR的特點,重復13步2530輪,目的DNA片段擴增100萬倍以上,DNA雙螺旋,DNA單鏈與引物復性,DNA變性形成2條單鏈,子鏈延伸DNA加倍,PCR的基本原理,PCR反應條件PCR過程PCR的特點,模板DNA,PCR的基本原理,PCR反應條件PCR過程PCR的特點,引物1,引物2,PCR的基本原理,PCR反應條件PCR過程PCR的特點,引物1,引物2,Taq酶,Taq酶,PCR的基本原理,PCR反應條件PCR過程PCR的特點,第1輪結束,第2輪開始,PCR的基本原理,PCR反應條件PCR過程PCR的特點,Taq,Taq,Taq,Taq,PCR的基本原理,PCR反應條件PCR過程PCR的特點,第2輪結束,PCR的基本原理,PCR反應條件PCR過程PCR的特點,模板DNA,第1輪擴增,第2輪擴增,第3輪擴增,第4輪擴增,第5輪擴增,第6輪擴增,PCR擴增產物電泳,PCR的基本原理,PCR反應條件PCR過程PCR的特點,PCR技術的特點,1 ）高度的靈敏性,30輪循環,擴增量達230個拷貝（109拷貝）,PCR產物每輪循環增加一倍,皮克(pg=10-12)量級擴增到微克(ug=10-6)水平能從100萬個細胞中檢出一個靶細胞病毒檢測的靈敏度可達3個RFU細菌檢測的最小檢出率為3個細菌,2 ）特異性,引物,引物,引物的序列及其與模板結合的特異性是決定PCR反應結果的關鍵。 引物設計的最大原則是最大限度地提高擴增效率和特異性；同時盡可能減少非特異性擴增。,PCR的類型和應用,研究基因克隆，DNA測序，分析突變診斷細菌、病毒、寄生蟲檢測，診斷人類基因組工程遺傳圖譜的構建，DNA測序，表達圖譜法醫犯罪現場標本分析腫瘤各種腫瘤檢測其他,（三）病原體核酸的檢測PCR,PCR：一種體外基因擴增技術，對目的基因組DNA的信號進行放大。,（三）病原體核酸的檢測Realtime PCR,實時熒光定量PCR：通過起始點定量和熒光檢測系統實時監測累積熒光強度而實現核酸定量的一種技術。廣泛應用于結核和麻風分枝桿菌、乙型肝炎病毒、丙型和戊型肝炎病毒、HIV、巨細胞病毒的檢查,（三）病原體核酸的檢測Realtime PCR,將大量核酸片段(寡核苷酸、PNA、cDNA、基因組DNA)以預先設計的方式固定在載玻片、尼龍膜和纖維素膜等載體上組成密集分子陣列，與熒光素或其他方式標記的樣品進行雜交，通過檢測雜交信號的強弱進而判斷樣品中靶分子的有無和數量。該技術具有高通量、自動化程度高、快速、樣品用量少、靈敏度高、特異性強、污染少等特點。病原微生物的16S rDNA及23S rDNA序列近幾年被作為一個較理想的基因分類靶序列，其在進化壓力下保持了高度的保守性，同時又具有一定的變異性，基因芯片技術通常利用病原微生物的這一分子生物學特性，實現多樣本多病原微生物的同時檢測。,（三）病原體核酸的檢測基因芯片,意義,靈敏度高，是檢測病原體微生物最靈敏的方法，但具有一定的假陽性與假陰性。特異性強，陽性只表明存在某種病原體的核酸，是否正被感染應結合臨床具體分析。特別適用于目前尚不能分離培養或很難分離培養的微生物。適用于核酸變異的病原微生物，如病毒,（四）病原體的分離培養和鑒定,明確感染病原體提供體外抗微生物藥物敏感試驗結果,1.細菌感染性疾病病原體的分離培養分離培養是微生物學檢驗中確診的關鍵步驟 根據臨床癥狀、體征和鏡下檢查特征做出病原學初步診斷，選擇最合適的培養方法，主要是選擇適當的培養基、接種前的標本處理和確定孵育條件，然后根據菌落性狀(大小、色澤、氣味、邊緣、光滑度、色素、溶血情況等)和細菌的形態、染色性，檢測細菌生化反應結果和血清學實驗、動物接種實驗(白喉桿菌)，對分離菌作出鑒定，也可借助于微量鑒定系統快速簡便鑒定分離菌,（四）病原體的分離培養和鑒定,細菌分離培養與鑒定的結果評價：正常人群的無菌體液中檢測到細菌，應考慮細菌為感染的病原體。存在正常菌群的標本檢測到細菌，應結合細菌的量考慮是否為致病菌。如臨床表現支持感染，但培養陰性，應考慮為標本不合格、培養不恰當等因素。直接鏡檢找到病原體，而培養陰性，應考慮有L細菌、厭氧菌或苛氧菌感染。,2.不能人工培養的病原體感染性疾病將標本接種易感動物、雞胚或行細胞培養,（四）病原體的分離培養和鑒定,病毒分離培養與鑒定的結果評價：從組織、血液以及腦脊液中分離到病毒可明確診斷。從呼吸道、腸道等分離到病毒，如該病毒人體不能長期攜帶，有診斷價值，如麻疹病毒、流感病毒等。反之需相應的臨床表現，才有病原學意義，如巨細胞病毒，腸道病毒等。陰性不能排除病毒感染。必須結合流行病學資料、臨床表現、標本來源及病毒種類加以分析。,（五）血清學試驗,用已知病原體的抗原檢測患者血清中相應抗體以診斷感染性疾病。,人體感染病原體后經過一定時間產生特異性抗體，在體內可維持數月或更長時間。,雙份血清檢查：病程早期和晚期分別采血清2-3份檢查，雙份血清的滴度呈4倍或4倍以上升高，考慮病原體感染單份血清檢查：特異性 IgM可作為感染性疾病的早期診斷指標，且可區分原發與復發感染。方法有：凝集試驗、沉淀試驗、補體結合試驗、間接免疫熒光、放射免疫、酶聯免疫吸附試驗。,適用范圍,血清學診斷可用于現癥診斷，還可以用于疾病追溯調查。血清學診斷對于某些病原體不能培養或難以培養的疾病，可以提供診斷的依據，,血清學診斷肥達反應,抗原結構,O抗原：化學成分為脂多糖；耐熱；是沙門菌分群依據；相應抗體為IgM抗體；與相應抗體結合出現顆粒狀凝集；。,H抗原：化學成分為蛋白質；不耐熱；有雙相鞭毛；沙門菌分型依據；與相應抗體結合出現絮狀凝集；相應抗體為IgG抗體。,Vi抗原：不耐熱；能阻止O抗原與相應抗體結合,血清學診斷肥達反應,原理：用已知傷寒沙門菌O、H抗原和甲、乙、丙型副傷寒沙門菌H抗原與病人血清作半定量凝集試驗，以測定受檢血清中有無相應抗體及其效價。意義：協助診斷腸熱癥（傷寒與副傷寒）,幾種沙門菌抗原構造,腸熱癥病人血清抗體出現情況,肥達反應正常值,O凝集效價1：80H凝集效價1：160副傷寒H凝集效價1：80,大于正常值具有診斷意義,O與H抗體的診斷意義：,O、H效價均升高：已感染傷寒O、H效價均低于正常值：未感染沙門菌或免疫力低下,生理鹽水, 待檢血清,診斷抗原,1:20 1:40 1:80 1:160 1:320 1:640,傷寒O效價 1:320傷寒H效價 1:640甲型副傷寒H效價 1:20肖沙門菌H效價 1:20,診斷意義：感染傷寒沙門菌,傷寒帶菌者的檢測,從標本中分離出病原菌血清中檢出Vi抗體，效價1：10,第二節：病原體耐藥性檢測,1922年他發現了一種叫“溶菌酶”的物質，發表了皮膚組織和分泌物中所發現的奇特細菌的報告。 但他自己無法發明一種提純青霉素的技術，致使此藥十幾年一直未得以使用 。1939年，瓦爾特弗洛和鮑利斯錢恩，重復了弗萊明的工作，證實了他的結果，然后提純了青霉素 1945年，弗萊明、弗洛里和錢恩共獲諾貝爾生理學及醫學獎。,第二節：病原體耐藥性檢測,抗菌藥物是目前臨床使用最為廣泛的藥物，它的發現、研制和臨床應用是現代醫學史上的重要里程碑，使絕大多數微生物感染，尤其是細菌感染成為可治性疾病,抗生素壓力,體外抗菌藥物敏感試驗的目的,臨床分離菌株，如不能對抗生素敏感性進行預測，必須常規進行藥敏試驗。臨床治療效果差而考慮調整抗菌藥物時。了解細菌耐藥的流行病學情況。評價新抗菌藥物的抗菌譜和抗菌活性等。,抗微生物藥物敏感試驗(antimicrobial susceptibility test, AST)對敏感性不能預測的臨床分離株進行藥敏試驗，以指導臨床選擇治療藥物。,體外抗菌藥物敏感試驗的方法,常用的檢查細菌是否對藥物耐藥的方法有定性測定的紙片擴散法、定量測定的稀釋法和E試驗法。對某些特定耐藥菌株的檢測除藥物敏感試驗外還要附加特殊的酶檢測試驗、基因檢測等方法。常用方法有:紙片擴散法（Kirby-Bauer test）稀釋法（dilution test）E試驗法（E test） 耐藥篩選試驗折點敏感試驗,原理：含有定量抗菌藥物的紙片貼在已接種測試菌的瓊脂平板上，紙片中所含的藥物吸取瓊脂中的水分溶解后便不斷地向紙片周圍區域擴散，形成遞減的濃度梯度。在紙片周圍抑菌濃度范圍內的細菌的生長被抑制，形成透明的抑菌圈。抑菌圈的大小反映測試菌對測定藥物的敏感程度。,KB紙片瓊脂擴散法,試驗程序,按敏感(susceptible，S)、中度敏感(intermediate，I)、耐藥(resistant，R)報告。S：測試菌能被測定藥物常規劑量給藥后在體內達到的血藥濃度所抑制或殺滅。I：測試菌能被測定藥物大劑量給藥后在體內達到的血藥濃度所抑制，或在測定藥物濃集部位的體液(如尿)中被抑制。R：測試菌不能被在體內感染部位可能達到的抗菌藥物濃度所抑制。,細菌藥敏試驗-液體稀釋法,Minimal inhibitory concentration (MIC)，最低抑菌濃度：能夠抑制檢測菌肉眼可見生長的最低藥物濃度稱為最低抑菌濃度。,抗菌藥物對倍稀釋,先以水解酪蛋白液體培養基將抗生素作不同濃度稀釋，再種入待檢菌，,培養,置35溫箱，培養24h。,結果判讀,結果判讀：肉眼觀察，以不出現肉眼可見生長（混濁現象）的最低藥物濃度為該藥對測試菌的MIC。,細菌藥敏試驗- E-test法,1.結合稀釋法和擴散法原理和特點而設計的一種操作簡便(如同擴散法)、精確測定MIC(如同稀釋法)的一種方法。2.在涂布有待測試菌的平板上放置1條內含干化、穩定、濃度由高到低呈指數梯度分布的商品化抗菌藥物塑料試條。35孵育1618h。3.抑菌圈和試條橫向相交處的讀數刻度即是待測菌的MIC，參照CLSI標準判斷,細菌藥敏試驗- E-test法,青霉素的MIC 解釋標準S 2R8,結論：MIC:1.0該肺炎鏈球菌對青霉素敏感,缺點,Etest試條價格昂貴，目前尚未廣泛使用,藥敏試驗結果的解釋（1）,敏感（susceptible）：表示測試菌能被測定藥物常規劑量給藥后在體內達到的血藥濃度所抑制或殺滅。耐藥（resistant）：表示測試菌不能被測定藥物常規劑量給藥后在體內達到的血藥濃度所抑制或殺滅，治療無效。,藥敏試驗結果的解釋（2）,中介 (intermediate) : 測試菌能被測定藥物大劑量給藥后在體內達到的血藥濃度所抑制，或在測定藥物濃集部位的體液(如尿)中被抑制該范圍作為敏感與耐藥之間的緩沖區，避免由于微小技術誤差影響實驗結果。,（二）特殊的耐藥菌監測的特殊試驗,由于細菌存在一種或幾種耐藥機制，造成了細菌的多重耐藥性。單一的藥敏試驗已不能完全表示細菌的耐藥性，必須進行一些特殊的耐藥性監測試驗。1.耐甲氧西林葡萄球菌的篩選測定2.氨基糖苷類抗生素高耐藥腸球菌的篩選測定3.耐青霉素肺炎鏈球菌的篩選測定4.-內酰胺酶的檢測5.超廣譜-內酰胺酶的檢測,1.耐甲氧西林葡萄球菌的篩選測定（methecillin resistance staphylococcus，MRS）,包括耐甲氧西林金黃色葡萄球菌和耐甲氧西林凝固酶陰性葡萄球菌是目前導致醫院感染的重要病原菌。此類葡萄球菌具有多重耐藥性，即對全部一內酰胺類抗菌藥物，包括青霉素族和頭孢菌素族以及臨床常用的其他多種抗菌藥物均耐藥。因此，此類葡萄球菌的早期檢出和確定具有重要臨床意義,1.耐甲氧西林葡萄球菌的篩選測定（methecillin resistance staphylococcus，MRS）,1g苯唑西林紙片的抑菌圈直徑10mm，或MIC4g/ml的金黃色葡萄球菌, 1g苯唑西林紙片的抑菌圈直徑17mm，或MIC0.5g/ml的凝固酶陰性葡萄球菌稱耐甲氧西林葡萄球菌。,臨床意義,對所有-內酰胺類藥物均無效，并對氨基糖甙類、大環內脂類、克林霉素和四環素等抗生素多重耐藥。治療首選藥物為萬古霉素。,2.氨基糖苷類抗生素高耐藥腸球菌的篩選測定,對多種抗菌藥物包括氨基糖苷類呈固有耐藥是腸球菌的特點，故單用氨基糖苷類治療腸球菌感染無效。但如與一種作用于細胞壁的抗菌藥物如青霉素類合用，則可發生協同作用而增強殺菌效力。如果腸球菌對氨基糖苷類產生了高耐藥性，這種聯合應用就會無效。所以及時篩選出腸球菌中氨基糖苷類高耐藥株，有助于臨床調整和重新確定治療方案。,2.氨基糖苷類抗生素高耐藥腸球菌的篩選測定,定義: 對30g萬古霉素紙片抑菌圈直徑19mm， 或MIC32g/ml應視為耐萬古霉素腸球菌（vancomycin resistant enteroccoccus，VRE）。,臨床意義,耐萬古霉素腸球菌目前尚無有效的治療方法，但是對青霉素敏感的VRE可用青霉素和慶大霉素聯合治療，若對青霉素耐藥而不是高水平耐氨基糖苷類可用壁霉素和慶大霉素。另外氯霉素、紅霉素、四環素（或多西環素、或米諾環素）及利福平可用于VRE株。,3.耐青霉素肺炎鏈球菌的篩選測定,定義：1g苯唑西林紙片的抑菌圈直徑2g/ml應視為耐青霉素肺炎鏈球菌。,臨床意義,耐青霉素的肺炎鏈球菌對氨芐西林、 氨芐西林/舒巴坦、 頭孢克肟、 頭孢唑啉的臨床治療療效很差，治療時參考藥敏結果選擇藥物，經驗治療重癥感染時，可用頭孢曲松或頭孢噻肟聯合萬古霉素用藥。,4.-內酰胺酶的檢測青霉素族和頭孢菌素族抗生素的基本結構一內酰胺環,一內酰胺酶能裂解青霉素族和頭孢菌素族抗生素的基本結構一內酰胺環，從而使其喪失抗菌活性。,快速檢測-內酰胺酶,-內酰胺酶檢測的意義,-內酰胺酶：可水解-內酰胺類抗生素。臨床意義：（1）流感嗜血桿菌、淋病奈瑟菌以及卡拉莫拉漢菌等陽性，表示對青霉素、氨卞西林以及阿莫西林耐藥。（2）葡萄球菌屬以及腸球菌屬等，陽性表示對青霉素、氨基組青霉素、羧基組青霉素以及脲基組青霉素耐藥,5.超廣譜-內酰胺酶(extend spectum -lactamase, ESBL)的檢測,超廣譜-內酰胺酶是由質粒介導的基因所編碼，可水解青霉素類、頭孢菌素和氨曲南，主要見于大腸埃希菌、肺炎克雷伯克、產酸雷伯菌及奇異變形桿菌。篩選方法：雙紙片擴散法、三相試驗和E試驗雙紙片協同試驗操作簡便、結果可靠、成本不高，是臨床上較常開展的項目。,雙紙片擴散法,藥物：頭孢他啶30 ug頭孢他啶/克拉維酸 30/10 ug以及頭孢噻肟30 ug頭孢噻肟/克拉維酸30/10 ug結果判讀：對兩組中任何一個藥物，在加克拉維酸后，抑菌圈與不加克拉維酸的相比，增加值 5mm 時，判定為產ESBL（如，頭孢他啶的抑菌圈直徑16；頭孢他啶/克拉維酸的抑菌圈22 ）。,臨床意義,產ESBL細菌,不論體外藥物敏感試驗結果如何, 對青霉素類、1-3代頭孢菌素類和氨曲南治療均無效，藥敏也全部修改成耐藥。,提 綱,第一節：標本的采集運送、實驗室評價和檢查方法第二節：病原體耐藥性檢測第三節：臨床感染常見病原體檢測第四節：病毒性肝炎檢測第五節：性傳播疾病病原體檢測第六節：醫院感染常見病原體檢測,臨床常見病原體為：細菌、病毒、真菌、寄生蟲、支原體、衣原體以及立克次體等。,（一）細菌感染檢查項目的選擇,細菌感染性疾病一般均需進行細菌學診斷以明確病因。三個方面著手：檢測細菌或其抗原-主要包括直接涂片顯微鏡檢查、培養、抗原檢測與分析。檢測抗體。檢測細菌遺傳物質-主要包括基因探針技術和PCR技術。 難培養或培養要求高的細菌：綜合運用免疫學或分子生物學檢測，如結核分枝桿菌感染以及幽門螺桿菌感染等。細菌培養是最重要的確診方法。,（二）病毒感染檢查項目的選擇,在易感細胞內以復制方式進行增殖的非細胞型微生物病毒感染的實驗室檢查包括病毒分離與鑒定、病毒核酸與抗原的直接檢出，以及特異性抗體的檢測。 病毒分離與鑒定：細胞培養。早期診斷手段：多檢測病毒抗原、特異性抗體或核酸。,（三）真菌感染檢查項目的選擇與應用評價,真菌是以腐生或寄生方式攝取養料的真核細胞型微生物。真菌的微生物學診斷手段主要包括直接檢查、培養檢查、免疫學試驗和動物試驗,直接顯微鏡檢查：初步明確真菌感染,分離培養：明確何種真菌感染,大多數真菌營養要求不高，常用沙保氏培養基 （SDA）培養。淺部病原性真菌的最適溫度為2228，生長緩慢，大多于14周出現典型菌落。深部病原性真菌培養在37中生長最好，生長較快，經3-4天即長出菌落。,真菌感染檢查項目的選擇與應用評價,真菌抗原檢測：只適合于血清與腦脊液中隱球菌、念珠菌以及莢膜組織胞漿菌等。真菌抗體檢測：深部真菌的檢測。,（四）寄生蟲感染檢查項目的選擇與應用評價,直接顯微鏡檢查：觀察寄生蟲生活史的各階段，是寄生蟲感染的主要診斷依據。寄生蟲抗體檢測：輔助診斷。,支原體感染檢查項目的選擇與評價,支原體是一群介于細菌與病毒之間，可通過濾菌器、無細胞壁，能在無生命培養基中生長繁殖的最小原核微生物。 與人類疾病有關的是肺炎支原體、唾液支原體、口腔支原體、人型支原體、發酵支原體和微小株支原體。,支原體感染檢查項目的選擇與評價,直接顯微鏡檢查：無價值。分離培養：陽性可明確診斷。目前臨床多檢測支原體抗原與核酸，用于早期快速診斷。,螺旋體感染檢查項目的選擇與評價,暗視野顯微鏡檢查：是診斷早期梅毒唯一快速、可靠的方法，尤其對已出現硬下疳而梅毒血清反應仍呈陰性者意義更大,梅毒血清學試驗（1）過篩試驗：RPR、VDRL、TRUST（2）確診試驗：FTA-ABS、MHA-TP、TPPA,螺旋體感染檢查項目的選擇與評價,TPHA試驗,螺旋體感染檢查項目的選擇與評價,腦脊液檢查：VDRL試驗陽性等有診斷價值。腦脊液PCR檢測，可以快速準確的診斷神經性梅毒。TP-PCR：TPPCR檢測梅毒螺旋體DNA，特異性很強，敏感性很高，是目前診斷梅毒螺旋體的先進方法。PCR檢測梅毒螺旋體的DNA，其敏感性、特異性均優于血清學方法,Howard Taylor Ricketts,立克次體檢測,斑疹傷寒群,立克次體目,立克次體屬,東方體屬,埃立克體屬,巴通體屬,柯克斯體屬,恙蟲病群,斑點熱群,犬埃立克體群,腺熱埃立克體群,嗜吞噬細胞埃立克體群,立克次體目的類別,柯克斯體,培養特性,專性細胞內生長的原核細胞性微生物對多種抗生素敏感引起自然疫源性疾病，且為人畜共患,病原體 所致疾病立克次體屬 斑疹傷寒（流行性斑疹傷寒、地方性斑疹傷寒、 加拿大斑疹傷寒） 斑點熱（洛磯山斑點熱、紐扣熱、昆士蘭熱、 立克次體痘、北亞蜱傳斑疹傷寒）柯克斯體屬 Q熱東方體屬 恙蟲病群（恙蟲病）埃立克體屬 犬埃立克體群（人單核細胞埃立克體病） 腺熱埃立克體群（腺熱埃立克體） 嗜吞噬細胞埃立克體群（人粒細胞埃立克體病）巴通體屬 戰壕熱、貓抓病、Oroya熱、秘魯疣、桿菌性血管瘤、 心內膜炎,外斐試驗為非特異性血清學診斷試驗，用于斑疹傷寒、斑點熱和恙蟲病的確診特異性血清學試驗有免疫熒光試驗、酶聯免疫吸附試驗和補體結合試驗等,衣原體,衣原體是一類嚴格在細胞內寄生，有獨特發育周期，能通過細菌濾器的原核細胞型微生物。衣原體屬分為四個種沙眼衣原體肺炎衣原體鸚鵡熱衣原體獸類衣原體,衣原體感染檢查項目的選擇與評價,直接顯微鏡檢查：檢查衣原體包涵體可提供早期初步診斷。分離培養：陽性可明確診斷。目前臨床多檢測衣原體抗原與核酸，用于早期快速診斷。,第一節：標本的采集運送、實驗室評價和檢查方法第二節：病原體耐藥性檢測第三節：臨床感染常見病原體檢測第四節：病毒性肝炎檢測第五節：性傳播疾病病原體檢測第六節：醫院感染常見病原體檢測,甲型肝炎病毒標志物檢測乙型肝炎病毒標志物檢測丙型肝炎病毒標志物檢測,病毒性肝炎主要有7型，即甲型(HA)、乙型(HB)、丙型(HC)、丁型(HD)、戊型(HE)、庚型(HG)、輸血傳播病毒肝炎它們分別由肝炎病毒甲型(HAV)、乙型(HBV)、丙型(HCV)、丁型(HDV)和戊型(HEV)、庚型(HGV)、輸血傳播病毒(TTV)所引起。,一、甲型肝炎病毒標志物檢測,甲型肝炎病毒（Hepatitis A virus、HAV）屬微小RNA病毒科，無包膜，核心為單股正鏈RNA。,0 1 2 3 4 5 6 7 8 26 52,糞中HAV,ALT,Anti-HAV, IgG,Anti-HAV, IgM,Weeks,HAV infection,HAV為甲型病毒性肝炎的病原體，主要通過糞口途徑傳播。,臨床表現為急性黃疸肝炎。,0 1 2 3 4 5 6 7 8 26 52,糞中HAV,ALT,Anti-HAV, IgG,Anti-HAV, IgM,Weeks,HAV infection,Graph showing the course of Hepatitis-A virus infection,標志物名稱 檢測方法 參考值抗HAV-IgM ELISA 陰性抗HAV-IgG ELISA 陰性抗HAV-IgA ELISA 陰性HAVAg ELISA 陰性HAV-RNA RT- PCR 陰性,檢測方法與參考值,臨床意義,抗HAV IgM，說明機體正在感染HAV，在HAV感染后1-2周內出現，是早期診斷甲肝的特異指標。抗HAV IgG，出現于恢復期并長期存在，是獲得免疫力的標志。陽性表示既往感染或者注射過疫苗。HAVAg是HAV感染直接的證據，于發病前2周可從糞中排出，糞便中HAV或HAV抗原顆粒的檢測可作為急性感染的證據。HAV-RNA是HAV感染直接的證據，對診斷，特別對早期診斷具有特異性。檢測糞便排泄物、污染的水源和食物，有利于及時監測與預防甲型肝炎。可作基因分型研究。,二、乙型肝炎病毒標志物檢測,乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）為嗜肝DNA病毒，屬于包膜病毒。在電鏡下可見大球形顆粒、小球形顆粒和管型顆粒,大球形顆粒,小球形顆粒,管形顆粒,大球形顆粒，又稱 Dane顆粒，為完整的HBV顆粒。,分為包膜與核心兩部分，包膜含有HBsAg，核心部分是病毒復制的主體，含有環狀雙股DNA、DNA聚合酶、HBcAg和HBeAg等。,乙肝抗原：1963年美國腫瘤研究所B.S.BIumberg在澳大利亞首先發現，稱為“澳抗”又稱肝炎相關抗原。乙肝病毒：1970年英國Dane在電鏡下首先觀察到乙肝病毒顆粒，是直徑42nm的雙層外殼的病毒顆粒，稱為Dane氏顆粒，后來又有人發現26nm的核心顆粒。e抗原：1972年瑞典人Magnius發現與乙肝有關的第三種抗原。e抗原為一種可溶性抗原。在HBV核心的表層,HBV為乙型病毒性肝炎的病原體，血液為其主要的傳播途徑。,機體感染HBV后產生相應的免疫反應，形成多種不同的抗原抗體系統表面抗原抗體系統 (HBsAg，抗HBs)核心抗原抗體系統 (HBcAg，抗HBc)e 抗原抗體系統 (HBeAg，抗HBe),檢測方法與參考值,臨床意義（1）,HBsAg： HBsAg是HBV的外殼，不含DNA，故HBsAg本身不具傳染性；但因其常與HBV同時存在，常被用來作為傳染性標志之一。陽性常見于急性、慢性乙型肝炎，慢活肝。肝硬化、肝癌患者中有相當百分比的病人陽性，此現象說明肝硬化、肝癌患者有傳染乙肝的危險，還說明了乙肝，肝硬化，肝癌發展演變的內在聯系。乙肝是病因之一。乙型肝炎帶原者得到肝癌的機會是一般人的150倍。乙肝攜帶者：乙肝病毒的攜帶者約有1.2億，沒有臨床癥狀,體檢肝功能正常或有輕微損害，有時ALT升高，具有一定的傳染性不應作為供血者。可持續數周、數年，將來可能發生慢性活動性肝炎、遷延性肝炎、肝硬化和肝癌，因此值得注意。,抗-HBs,抗-HBs是種保護性抗體，可阻止HBV穿過細胞膜進入新的肝細胞，陽性提示機體對乙肝病毒有一定程度的免疫力 。抗-HBs陽性表示：既往曾感染過HBV，現已恢復；接種乙肝疫苗后；被動性獲得抗-HBs抗體。,HBeAg陽性表明: 患有乙型肝炎，是病毒復制活躍，傳染性強的指標，且HBeAg持續陽性的乙型肝炎，表明肝細胞受損較重，且易轉變為慢性肝炎，肝硬化。 HBeAg (+) ,HBsAg(+)的孕婦所生的新生兒，母嬰垂直傳播的機會很高，達90%值得重視。,HBeAg：,抗-HBe,抗-HBe陽性意味著大部分HBV被清除，復制減少，傳染性降低，但并非無傳染性。乙肝急性期即出現抗-HBe陽性，易發展為慢性乙型肝炎。慢性活動性肝炎出現抗-HBe陽性，易發展為肝硬化。e抗體和e抗原一般不同時存在，e抗原消失，e抗體產生。,可分為IgM、IgG和IgA三型，目前常用的方法是檢測抗一HBc總抗體，抗-HBc總抗體主要反映的是抗-HBc IgG 。也可分別檢測抗一HBc的IgM、IgG或IgA。抗HBc檢出率比HBsAg更敏感，可作為HBsAg陰性的HBV感染的敏感指標。 抗-HBc IgG ：對機體無保護作用，其陽性可持續數十年甚至終身。,抗-HBc,乙型肝炎病毒血清標志物的綜合評價,(1) (2) (3) (4) (5) 急性或慢性乙型肝炎，高傳染性 急性、慢性乙型肝炎或慢性HBsAg攜帶者 急性乙肝趨向恢復或慢性乙肝，弱傳染性 急性HBV感染康復期或有既往感染史，有免疫力 乙肝恢復期，弱傳染性 急性HBV感染“窗口期”， 或既往曾感染過乙肝 接種HBV疫苗或HBV感染后康復 急性乙肝康復期，開始產生免疫力 無HBV感染,(二)乙型肝炎病毒表面抗原蛋白前S1和前S1抗體測定,乙型肝炎病毒表面抗原蛋白前S1抗原位于病毒顆粒的表面，是乙肝病毒識別肝細胞表面特異性受體的主要成分，是乙肝病毒復制和活動的標志物。 【參考值】 Elisa法。PreS1為陰性；抗PreS1為陰性。,臨床意義,前S1抗原可識別肝細胞表面特異性的病毒受體，是非常重要的傳染性指標。同時血清前S1抗原的存在與病毒復制的關系密切。作為病毒復制指標較HBeAg敏感，可以反映HBeAg陰性乙肝患者體內的病毒活動狀況，避免由于HBeAg陰性造成的誤診和漏檢，對“二對半”檢測起重要的補充作用。前s1抗原轉陰越早、前s1抗體轉陽越早，患者病程越短、預后越好。,HBV DNA：是HBV感染最直接，最靈敏和最特異的檢測指標，且血清中HBV DNA的水平可作為治療方案與療效觀察的指標。,HBV DNA定量檢測,循環數. 擴增子數 (靶序列拷貝數)122438416532664201,048,576301,073,741,824(10億),目的基因擴增,三、丙型肝炎病毒標志物,丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）為黃病毒屬、單鏈正股RNA病毒，由核心和包膜組成。血液為其主要傳播途徑。病情雖較乙型肝炎輕，但更易轉為慢性。,安徽霍山“丙肝事件”,丙型病毒性肝炎是由丙肝病毒（HCV）所引起，是通過輸血或血制品、血透析、腎移植、靜脈注射毒品、性傳播、母嬰傳播等傳染引起的。與乙型肝炎相比，更容易演變為慢性、肝硬化和肝癌,檢測方法與參考值,標志物 檢測方法 參考值 HCV-RNA RT-PCR 陰性 抗-HCV IgM ELISA 陰性 抗-HCV IgG ELISA 陰性,臨床意義,HCV-RNA ： 有助于HCV感染的早期診斷。陽性提示 HCV復制活躍，傳染性強。HCVRNA轉陰提示HCV復制受抑，預后較好。連續觀察HCVRNA，結合抗一HCV的動態變化，可作為丙肝的預后判斷和干擾素等藥物療效的評價指標,臨床意義,抗-HCV IgM： 是丙型肝炎活動和具有傳染性的指標，常見于急性HCV感染。持續陽性可作為轉為慢性肝炎的指標，或提示病毒持續存在并有復制抗-HCV IgG： 陽性表明體內已有HCV感染，但不能作為感染的早期指標。,提 綱,第一節：標本的采集運送、實驗室評價和檢查方法第二節：病原體耐藥性檢測第三節：臨床感染常見病原體檢測第四節：病毒性肝炎檢測第五節：性傳播疾病病原體檢測第六節：醫院感染常見病原體檢測,1.性傳播性疾病（sexually transmitted disease,STD）：是指通過各種性接觸而傳播的侵犯皮膚、性器官及全身多臟器的疾病，簡稱性病（venereal disease）2.分類：（1）經典（傳統）STD：梅毒、淋病、軟下疳和性病性淋巴肉芽腫。（2）目前：全球發現的STD有30余種，常見為17種；（3）我國法定為8種： 梅毒、淋病、尖銳濕疣、軟下疳、性病性淋巴肉牙腫、非淋病性尿道炎、生殖器皰疹及艾滋病。,（一）流行病學,城市牛皮蘚,正規醫療機構是性病患者的正確選擇,（二）常見臨床類型,性病 病原體艾滋病 人類免疫缺陷病毒梅毒 梅毒螺旋體淋病 淋球菌非淋球菌尿道炎 溶脲支原體、沙眼衣原體等生殖器皰疹 單純皰疹病毒尖銳濕疣 人乳頭瘤病毒軟下疳 杜克雷嗜血桿菌,重要的性病及病原體,中國愛滋病村里的病人,愛滋病家庭遺孤,（一）艾滋病病原體測定,直接顯微鏡檢查與分離培養：病毒培養是檢測HIV感染最精確的方法，一般采取培養外周血單個核細胞的方法進行HIV的診斷。臨床較少采用。ELISA等為過篩實驗，此法敏感性高，但容易出現假陽性結果，故陽性者需用其他試劑盒重復1次 。HIV-RNA檢測：通常是通過檢測HIV RNA水平來反映病毒載量，直接反映病情進展，病毒核酸檢測方法可用于HIV的早期診斷。排除假陽性可確診。Western blot：通常作為檢測抗HIV一1和抗HIV一2的確診實驗，該法敏感性和特異性皆好 。,（二）梅毒螺旋體感染檢查項目的選擇與評價,直接顯微鏡檢查：有初步診斷價值。非特異性抗體的檢測：過篩試驗。特異性抗體的檢測：確診試驗。,（三）淋病病原體的檢測方法選擇與評價,涂片檢查：多形核白細胞內見革蘭氏陰性雙球菌，男性泌尿生殖道標本可明確診斷，而女性需結合培養結果分析。,分離培養；為診斷淋病的金標準，廣泛采用，陽性即可確診。,PCR：可用于早期快速診斷，但假陽性率高。特異性抗原與抗體檢測：方法尚不成熟。,（四）非淋球菌性尿道炎病原體測定,是由淋菌以外的其他病原體，主要是沙眼衣原體、解脲支原體等通過性接觸所引起的尿道炎癥