生理學實驗報告實驗內容：一、 蛙的坐骨神經-腓腸肌標本的制備二、 骨骼肌收縮的實驗課程名稱：動物生理學實驗指導老師：實驗人 ： 院系專業： 學 號 ： 2010年10月20日實驗內容一 蛙的坐骨神經-腓腸肌標本的制備（4-1）【實驗目的】1、 學習蛙類動物單毀髓與雙毀髓的方法。2、 學習并掌握蛙類坐骨神經-腓腸肌標本的制備方法。【實驗原理】蛙類的一些基本生命活動和生理功能與恒溫動物相似，而其離體組織所需的生活條件比較簡單，易于控制和掌握。因此在實驗中常用蟾蜍或青蛙的坐骨神經-腓腸肌標本來觀察興奮與興奮性、刺激與肌肉收縮等基本生理現象和過程。制備坐骨神經-腓腸肌標本室生理學實驗中必須掌握的一項基本技能。【實驗器材】常用手術器械（包括粗剪刀、手術剪、手術鑷、眼科剪、眼科鑷、金屬探針、玻璃分針）、固定針、鋅銅弓、蠟盤、培養皿、廢物缸、棉線、紗布、滴管、任氏液。【實驗對象】蛙【實驗步驟】1、 毀腦和脊髓取青蛙一只，用紗布包裹青蛙的四肢和軀干，露出頭部。左手握住青蛙，并用食指按壓頭部前端，拇指按壓背部使頭部前俯；右手找到青蛙枕骨大孔所在位置。將探針由凹陷處垂直刺入，刺破皮膚即進入枕骨大孔，這時將探針由枕骨大孔轉向頭方，向前探入顱腔內，然后向各個方向攪動探針，以搗毀腦組織。如探針確實在顱腔內，可感覺出針在四面皆壁的腔內。腦組織搗毀后，將探針退出，在由枕骨大孔刺入并轉向尾方，與脊髓平行刺捻入椎管，以破壞脊髓。椎管較細，故若已刺入椎管針則不能擺動。脊髓被破壞時蛙腿后瞪挺直。要確定腦和脊髓是否完全被破壞可檢查蛙四肢肌肉緊張性是否完全消失。2、 剝制后肢標本自青蛙兩側腋部以下完全剝離皮膚（注意：可事先剪去尾椎末端及泄殖腔附近的皮膚，使剝離更容易）。而后倒提蛙腿，使其頭部向下，用手術間橫向剪開腹部肌肉，看清脊神經后，用粗剪刀剪斷脊柱（注意勿損傷坐骨神經）。把標本浸泡于盛有任氏液的培養皿中。將手及用過的剪刀、鑷子等全部手術器械洗凈。3、 制備坐骨神經-腓腸肌標本（1）分離兩腿。用粗剪刀縱向剪開脊柱（尾扛骨留在一側）和與兩后肢相連的肌肉，再用粗剪刀剪開趾骨聯合（為保證兩側坐骨神經完整，應避免剪刀偏向一側）。將以分離的標本浸入任氏液。（2）游離坐骨神經。取一條蛙腿，先用玻璃分針沿著脊柱側游離坐骨神經腹腔部，然后用固定針將標本背位固定于干凈蠟盤上。用玻璃分針循股二頭肌和半膜肌之間的坐骨神經溝，縱向分離暴露坐骨神經的大腿部分，直至分離腘窩脛神經分叉處。然后剪斷二頭肌、半腱肌和半膜肌肌腱，并繞至前方剪斷股四頭肌腱。自上而下剪斷所有坐骨神經分支，將連著3-4節椎骨的坐骨神經分離出來。（3）分離腓腸肌。用玻璃分針或鑷子分離腓腸肌與跟腱，并穿線結扎。在結扎遠端用粗剪刀剪斷跟腱，左手執線提起腓腸肌，用手術剪減去其周圍聯系的組織，但保留腓腸肌起始點與骨的聯系，注意切勿損傷支配該肌的神經分支。（4）完成坐骨神經腓腸肌標本。將已游離的坐骨神經搭在腓腸肌上。用粗剪刀自膝關節周圍向上剪除并刮凈所有大腿肌肉，在距膝關節1cm處剪斷股骨。棄去上段股骨，保留部分即為坐骨神經-腓腸肌標本。將標本放入盛有新鮮任氏液的培養皿待用。（5）標本活性檢驗。用手術鑷輕輕提起標本的脊柱骨片，再用經任氏液潤濕的鋅銅弓刺激神經。若腓腸肌迅速發生收縮反應，表明標本機能良好，制備成功。應及時移至盛有任氏液的培養皿中待用。【實驗結果】用鋅銅弓檢驗標本活性，腓腸肌迅速發生收縮反應，標本機能良好，制備成功。【討論】1、制備過程中一定要不斷滴加任氏液以防止標本干燥，否則標本可能喪失正常生理活性。2、操作過程中應避免強力牽拉、手捏神經、夾傷神經肌肉和用金屬器械觸碰坐骨神經。3、所用器械要潔凈，若接觸蛙皮膚需洗凈再用。4、蛙的皮下有淋巴囊，故皮膚很容易剝落。為防止剝離皮膚時滑脫，可用紗布墊著手用力一次剝下。【思考題】1、制備坐骨神經-腓腸肌標本時應注意些什么？答：動作要輕柔；不要牽拉神經、手捏神經或夾傷神經肌肉；盡量避免金屬器械觸碰神經；不要把股骨全部剪掉，需要留一段固定標本。2、鋅銅弓為什么可以檢測神經肌肉的興奮性？答： 通常將金屬浸入電解質溶液中，如Zn便溶解而成Zn離子。而在Zn的里面則形成負離子。Cu在溶液中則相反，金屬與溶液之間便產生了電位差，即電極電位。如果將Zn和Cu一端接觸，則在接觸部位電流由Cu向Zn方向流動；而在溶液中則相反，由Zn向Cu流動。當鋅銅弓接觸組織時（注意：表面必須濕潤），電流便沿Zn可興奮組織Cu方向流動，而產生流動作用。這樣，鋅銅弓好像一個電池，Zn如同其陽極，Cu好像陰極而發揮作用。神經或肌肉的電刺激閾值非常小，所以僅用鋅銅弓接觸，即可構成刺激，以便檢驗組織的機能活性。3、 剝皮后神經肌肉標本出現的血液能用自來水沖洗嗎？答：不能。原因：自來水的濃度遠小于標本的細胞液濃度，所以會導致標本吸水，可能使得標本吸水漲破；自來水中可能含有一些金屬離子，如Ca2+，會使肌肉抽搐，可能使得標本失去生物活性。實驗內容二 骨骼肌收縮的實驗（4-2,4-4）【實驗目的】1、學習肌肉實驗的電刺激方法及肌肉收縮的記錄方法。2、觀察刺激強度與肌肉收縮反應的關系3、 用不同頻率的電刺激(最大刺激強度)作用于坐骨神經腓腸肌標本，觀察刺激頻率與收縮反應之間的關系，了解復合收縮的形成過程。【實驗原理】1、腓腸肌有許多肌纖維組成。刺激腓腸肌時，不同的刺激強度會引起肌肉的不同反應。當刺激強度過小時，不會引起肌肉發生收縮反應，此時的刺激為閾下刺激。當全部肌纖維同時收縮時，則出現最大的收縮反應。這時，即使增大刺激強度，肌肉收縮的力量也不會再隨之加大。可以引起肌肉發生最大收縮反應的最小刺激強度為最適刺激強度。2、不同頻率的電脈沖刺激神經時，肌肉會產生不同的收縮反應。若刺激頻率較低，每次刺激的時間間隔超過肌肉單次收縮的持續時間，則肌肉的反應表現為一連串的單收縮；若刺激頻率逐漸增加，刺激間隔逐漸縮短，肌肉收縮的反應可以融合，開始表現為不完全強直收縮，以后成為完全強直收縮。【實驗器材】常用手術器械、計算機采集系統、JZ100型張力換能器（100g）、支架、一維位移微調器、肌槽、雙凹夾、固定針、鋅銅弓、蠟盤、培養皿、廢物缸、棉線、紗布、滴管、任氏液。【實驗對象】蛙的坐骨神經-腓腸肌標本【實驗步驟】（一） 刺激強度與骨骼肌收縮反應的關系1、制備坐骨神經-腓腸肌標本，置于任氏液中穩定5-15分鐘，以穩定其興奮性，備用。2、固定標本將坐骨神經-腓腸肌標本所帶的股骨斷端固定于肌槽的骨頭固定孔內，腓腸肌肌腱上的扎線與張力換能器金屬彈性梁臂上相連，然后將標本的坐骨神經干搭在肌槽的電極上，電極接頭與刺激輸出線相接，見下圖。利用一維位移微調器調節扎線的張力，不可過松或過緊，使肌肉自然拉平為宜，保證肌肉一旦收縮即可牽動張力換能器的金屬彈性梁。3、實驗儀器連接及參數設置打開計算機采集系統，連接各儀器，選擇實驗項目“刺激強度與反應的關系”。調節刺激延時至最小，波寬為1ms，選擇強度遞增的刺激方式進行刺激。放大倍數一般設為10-20倍或靈敏度30g/div，濾波頻率為100Hz，掃描頻度1.0s/div（放大倍數、濾波頻率及掃描速度可根據實驗標本不同具體設置，延時設為最小）4、 實驗觀察（1）啟動刺激圖標，觀察肌肉收縮反應。如果肌肉無收縮反應，則適當增加刺激強度，其他刺激參數保持不變。間隔少許時間，重復進行刺激，直到出現肌肉的最小收縮。測量收縮幅度并記下刺激強度，此時的刺激強度位閾強度。（2）逐漸增加刺激強度，觀察刺激強度與肌肉收縮反應的關系。（3）當刺激強度達到某一數值后，肌肉收縮幅度不再隨刺激強度的增加而升高。記錄此時的收縮刺激強度。（二）刺激頻率與骨骼肌收縮反應的關系1、實驗儀器用品的準備同實驗內容二（一）的準備。2、打開計算機采集系統，連接各儀器，選擇實驗項目“刺激頻率與反應的關系”。調節刺激的延時、波寬至最小，放大倍數一般設為10-20倍，濾波頻率為100Hz。3實驗觀察強直收縮：用“連續刺激”方波刺激坐骨神經腓腸肌標本，改變電刺激頻率，觀察不同頻率的閾上刺激引起肌肉收縮形式的變化。刺激的波寬和電壓強度調到最適刺激強度，保持此參數不變，每次給刺激僅改變連續刺激方波的頻率。分別記錄不同頻率時的肌肉收縮曲線。觀察不同刺激頻率時肌肉收縮形式的變化。【實驗結果及結論】（一）刺激強度與骨骼肌收縮反應的關系結果：1、腓腸肌標本刺激強度與骨骼肌收縮反應的關系如附：圖1所示。其中，閾刺激強度為0.035V，最適刺激強度為0.125V。最大反應的收縮幅度為17.33g。2、將圖1中的峰值連接起來成為一條平滑的曲線，大致形狀如下圖：17.33 0.035 0.125結論：當給予閾下刺激時，不能引起肌肉收縮反應； 當給予閾刺激時，引起肌肉的最小收縮； 當給予的刺激強度由閾刺激至最適刺激逐漸增加時，肌肉的收縮反應隨之升高； 當給予的刺激強度達到最適刺激后，肌肉的收縮幅度不再隨刺激強度的增加而升高。（二） 刺激頻率與骨骼肌收縮反應的關系結果：腓腸肌標本刺激頻率與骨骼肌收縮反應的關系如附：圖2所示。其中，頻率6.0Hz時，腓腸肌進行單收縮，收縮幅度小； 7.0Hz頻率19.0Hz時，腓腸肌進行強直收縮，收縮幅度很大。結論：1、隨刺激頻率的增大，骨骼肌分別進行單收縮、不完全強直收縮、強直收縮，后二者是新的收縮過程與上次尚未結束的收縮過程發生綜合的結果。2、單收縮、不完全強直收縮、強直收縮三者中強直收縮的收縮幅度最大，不完全強直收縮其次，單收縮再次，可以表明三種收縮所能發出的力量為強直收縮不完全強直收縮單收縮。【討論】1、在“刺激強度與收縮反應的關系”實驗中，當刺激強度達到最適刺激強度后，已經引起肌纖維同時收縮，所以再增大刺激強度，肌肉收縮幅度不再增大。2、在觀察“刺激頻率與反應的關系”時，每次肌肉收縮后應讓肌肉休息后再做下一次刺激，因為肌肉在連續受刺激后會產生肌肉疲勞，這是因為肌肉內部儲存的能量有限的緣故。如果不許休息肌肉可能因此產生痙攣或失去活性。3、固定標本時，懸線松緊應合適，防止前負荷造成影響。4、在整個實驗過程中（包括標本制作和實驗）應不斷的用任氏液潤濕標本從而使標本保持活性，防止標本干燥而失火。5、在不正式記錄時應將電子刺激器輸出端斷開防止不必要的刺激。6、肌肉若出現痙攣，可能是漏電原因引起的，也可能是空氣流動快引起的，應注意檢查電路、關窗。7、在附：圖2中，頻率為4.0Hz時的單收縮幅度要大于頻率為7.0Hz的不完全強直收縮，可能原因是給予的刺激強度過大。應當將刺激強度調為最適刺激強度為好。【思考題】1、同一標本的閾刺激強度與最適刺激強度是否會發生變化？為什么？答：同一標本的閾刺激強度和最適刺激強度會發生變化。因為隨著標本離體時間的增加，它的興奮性會發生變化，所以會發生變化。2、連續電刺激神經，為何容易產生肌肉疲勞？答：肌肉收縮的機制是肌纖維相對滑動,當橫橋與細肌絲結合時,橫橋行使ATP酶的功能,消耗ATP使肌絲間滑動,所以肌肉收縮是一個消耗能量的過程,而肌肉內儲存的ATP是有限的,所以長時間的收縮會使肌肉疲勞。3、分析討論肌肉發生收縮總和的條件與機制。答：條件：后一次刺激落入前一次刺激的收縮期內。 機制：若后一次刺激落入前一次刺激的絕對不應期內，則不會有動作電位產生，所以不會產生二次收縮的任何反應