水產品中有機錫化合物的檢測方法研究一、研究背景21.1有機錫化合物的性質21.2有機錫化合物的危害2二、研究進展31 氣相色譜法42 液相色譜法53 聯用技術53.1 氣相色譜聯用技術53.2 液相色譜聯用技術63.2.1 液相色譜-電感耦合等離子體質譜(HPLC-ICP-MS)63.2.2 質譜條件的優化74 毛細管電泳(CE)7小結8啟發8參考文獻8摘 要：有機錫化合物具有脂溶性，易進入生物體內，通過食物鏈產生生物富集，對人和動物具有一定毒性。因此研究食品中有機錫化合物的分析方法研究，對保障食品安全，促進人體健康意義重大。本文概述近年來國內外水產品中有機錫化合物分析方法的研究現狀，包括氣相色譜法、液相色譜法、毛細管電泳法等.關鍵詞：水產品；有機錫；分析方法；研究進展一、研究背景1.1有機錫化合物的性質有機錫化合物是指在化學結構中至少含有一個Sn-C鍵的化合物。有機錫化合物可以用以下通式表示：RnSnX4-n(n=1-4) 式中的R可以是甲基、乙基、丁基、苯基、環已基和其他一些取代的烷基等；X可以是氫、氧、鹵素、巰醇基、羥基、羧基或其他一些復雜的官能團。這些復雜官能團與Rn-Sn-結合,構成有機錫的衍生物。根據有機錫化合物中所含Sn-C鍵數目的不同，可以把有機錫化合物分為四類：四有機錫化合物(R4Sn),三有機錫化合物(R3SnX),二有機錫化合物(R2SnX2)和單有機錫化合物(RSnX3)。這四類化合物性質各異。就毒性而言，四有機錫和單有機錫化合物毒性最低，三有機錫化合物生物活性最高，具有很強的殺生作用。二有機錫在常溫下，對水和空氣中的氧都很穩定，尤其是具有熱穩定性，在減壓下蒸餾數小時幾乎不分解，所以二有機錫可以用作塑料工業中的穩定劑。大多數的有機錫為液體或固體能溶解于一般的有機溶劑中，只有少數化合物顯示出明顯的不溶性，如二有機錫氧化物和少部分的有機錫氟化物1。1.2有機錫化合物的危害由于有機錫化合物在各個行業的廣泛應用，導致其在環境中的含量得到了大量的累積，這對人類的健康而言是一種潛在的危害。有機錫能干擾牡蠣中鈣的代謝，使貝殼加厚，可食用部分減少，還可導致腹足類動物由雌性向雄性轉變，通過改變其雌雄比例進而影響其種群繁2。目前，已有多篇報道3-8證實世界各地的海岸港口檢測到了有機錫的存在。TMT是工業上制作塑料過程中產生的副產物，它的來源是甲基硫醇錫，塑料制作中因其加入可以使PVC9獲得較好的熱穩定性、透明性和延展性，表現出了較好的印刷性能，得到的成品在我們日常生活中隨處可見，比如水桶、水管及包裝袋等等10。TBT主要用于防污涂料以及木材防腐劑中，可以有效抑制細菌和微生物的繁殖。同樣地，其經過一系列的代謝作用后，可以得到DBT和MBT11。目前有關有機錫與人體健康的研究大多為體外研究。Heidrich 通過對TBT 影響人類細胞色素P450芳香酶活性的研究發現, TBT 通過降低芳香酶對雌甾酮的親和力而可能對人體性激素的代謝有影響12。Whalen 研究了丁基錫對人類淋巴細胞的免疫毒性, 試驗是取志愿者淋巴細胞在體外接觸TBT 、MBT 和DBT 。結果發現丁基錫能夠明顯抑制淋巴細胞的功能, 即抑制淋巴細胞的抗腫瘤作用13。丁基錫抑制淋巴細胞的抗腫瘤作用, 可能是因為丁基錫快速降低淋巴細胞CAMP 的水平, 從而降低了淋巴細胞的細胞毒功能14。有機錫化合物具有免疫毒性, 大多數研究集中在T 淋巴細胞, 研究發現有機錫化合物也能作用于人類B淋巴細胞, 降低B 淋巴細胞在體外的成活及增生15。20世紀80年代中期以來，相繼在世界各地多種樣本如海水，海洋底泥，海洋生物，雨水，河水及底泥及城市污水中證實了有機錫化合物的存在。比如埃及16從亞歷山大海岸帶的底泥中發現了甲基錫和丁基錫。英國17證實某些海灣中的成年和幼牡蠣體內有有機錫的積累。瑞士18在蘇黎士污水處理廠的市政污水和活性污泥中發現了甲基錫和丁基錫并研究了他們隨污水處理過程的變化。在西地中海海19岸封閉海域也有三丁基錫和三苯基錫的存在。我國有機錫污染問題相當嚴重，特別是近海、港灣和內河港口。目前，在北方的許多水域都發現了有機錫及其降解產物的污染。有機錫污染可能是造成水生生物污染的主要來源，在個別嚴重污染區域甚至存在著引起突發性公害事件的潛在危險性。對大連、天津、青島、北海等地港口水域的采樣測定發現，幾個采樣點毫無例外地存在著有機錫污染，其中三丁基錫(TBT)及其降解產物二丁基(DBT) 和一丁基錫(MBT)的濃度范圍平均達到151ng/L20。1999年，江桂斌21等對我國部分內陸水域由于使用丁基錫作為船舶防污涂料而帶來的水污染現狀進行了研究，運用氣相色譜，表面發射火焰光度檢測方法對所采樣品進行了測定，在我國多處內陸水域發現了丁基錫污染。2001年-2002年，黃長江22對我國東南沿海廈門、汕頭和惠陽3港口進行有機錫污染的調查，在水樣、底泥和生物樣中都檢測到有機錫，我國沿海有機錫污染比較普遍和嚴重，已對生態系統產生實質性的負面生態效應二、研究進展有機錫化合物（organotin compounds，OTC）在工農業等領域應用廣泛，例如用作生產塑料穩定劑23，24、農用殺蟲劑25及船體防污涂料26等。近 20 年來，環境中有機錫的分析技術發展很快。由于有機錫既含有金屬元素，又具有有機物的性質，因此，將有機物分離技術如氣相(GC)27、高效液相28(HPLC)、毛細管電泳(CE)與某些特征檢測技術，如原子吸收29(AAS)、原子發射30(AES)、質譜(MS)31等相結合的聯用技術是目前發展的趨勢。1 氣相色譜法氣相色譜能分析在操作溫度下能氣化而不分解的物質，而有機錫化合物大多不易揮發，因此采用氣相色譜分析此類化合物時，往往要進行衍生化，使其轉化為易揮發的物質。目前，有機錫化合物的衍生化反應有3 種方式：1 ) 氫化衍生法：在酸性條件下，利用氫化反應將有機錫化合物轉變為相應的氫化物，常用的衍生化試劑有NaBH4 與KBH4。由于有機錫氫化衍生物不穩定、易揮發，該方法目前應用的很少；2 ) 采用格氏試劑32、33進行衍生反應，用格氏試劑衍生時必須在絕對無水的有機溶劑中進行，而且這種方式在衍生反應過程中會產生有害氣體，且衍生反應完成后還須將多余的衍生試劑分解后才能用有機溶劑提取，條件較為苛刻，操作也較為繁瑣；3)應用四乙基硼酸鈉進行衍生反應34、35，在水溶液中加入四乙基硼酸鈉直接進行乙基化衍生的方法得到越來越多的應用，這種方式優點是衍生和萃取可一步完成，無需分解過量的衍生試劑，大大簡化了反應過程，節省了分析時間，并且形成的衍生物很穩定。Camilla 等34對貝類樣品中的丁基錫化合物進行分析，比較了兩種衍生化試劑的衍生化效率，一種方法采用格林試劑，另一方法采用四乙基硼酸鈉，通過實驗對比發現，四乙基硼酸鈉能獲得更低的檢測限，尤其是對TBT。Magi 等36探討了NaBEt4 濃度、pH 值、緩沖液的濃度對衍生化效率的影響，在超聲條件下，用Methanol-tropolone 萃取牡貽類樣品中的MB T 、DB T 、TB T 。萃取液經離心、NaBEt 4 衍生化后，用固相萃取進行樣品凈化，在最佳實驗條件下，用GC-MS 進行有機錫分析。結果發現：MBT、DBT、TBT 的LOD 為1118ng Sn/g，LOQ 為1221ng Sn/g，一天內測樣的RSD 為1%7%，日間的RSD 為4%11%。在質譜基礎上發展起來的串聯質譜(MS-MS)具有比質譜還高的分辨力。串聯質譜的圖譜背景低，從而提高了儀器和方法的檢測限，在有機錫分析方面有很大的發展潛力。用氣相色譜進行有機錫分析時，樣品要經過提取、衍生、凈化，再用合適的檢測器與色譜聯用進行分析，其檢測器有多種類型，包括質譜(MS)、火焰光度法、脈沖火焰光度檢測器(PFPD)等。GC-MS 在有機錫的形態分析中的應用非常廣泛，隨著質譜技術的發展，GC-MS 分析有機錫，檢測限可以達到p g 級，其靈敏度高、定量準確、重現性好，適合于有機錫化合物的測定2 液相色譜法在使用氣相色譜分離有機錫化合物的同時，液相色譜也被用于有機錫化合物的分離。氣相色譜對高沸點化合物、非揮發性物質、熱不穩定化合物、離子型化合物及高聚物的分離、分析較為困難，致使其應用受到一定程度的限制。而液相色譜則不受樣品揮發度和熱穩定性的限制，它非常適合分子質量較大、難氣化、不易揮發或對熱敏感的物質、離子型化合物及高聚物的分離分析，因此用液相色譜對有機錫化合物進行分析時，不需要衍生化等，只需將有機錫從樣品基質中釋放出來，簡化了樣品前處理步驟，節省了分析時間，所以液相色譜建立的方法更加簡便、快速。盡管液相色譜對有機錫進行分析時不需要進行衍生化處理，但是能與液相色譜聯用的靈敏檢測器較少，從而限制了液相色譜的發展37。3 聯用技術有機錫化合物組分復雜、濃度低，單一的分離檢測方法往往難以滿足復雜樣品分析檢測的要求。分離與檢測技術的聯用可以發揮各自的優勢，滿足分析的要求。GC-AES、GC-ICP-MS、HPLC-ICP-MS 等利用色譜的高分離效能與檢測器的高靈敏度結合，能滿足儀器分析要求的高準確度和靈敏度，可以很好地應用于食品中微量有機錫的檢測。3.1 氣相色譜聯用技術氣相色譜- 電感耦合等離子體質譜(GC-ICP-MS)ICP-MS 是利用電感耦合等離子體作為離子源，產生的樣品離子經質量分析器和檢測器后得到質譜圖，利用質譜圖對樣品所含元素進行定性、定量分析。電感耦合等離子體質譜具有高靈敏度、分析速度快、很寬的線性范圍，能夠執行元素的分析。由于這些特點，GC-ICP -MS38、39、40聯用技術已用于生物樣品中有機錫的分析。但ICP-MS 儀器耗費與維修費用高，與氣相色譜儀連接接口復雜，且商品化的GC-ICP-MS 傳輸線不是很多，這些原因限GC-ICP-MS 的應用。Qin 等38向樣品中加入HCl-methanol，超聲30min，離心，上清液衍生化后，用頂空微萃取HS-SDME 與氣相色譜- 電感耦合等離子體質譜GC-ICP-MS 結合測定貝類樣品中的丁基錫。實驗中對衍生化試劑NaBEt4、NaBH4 的衍生化效率進行比較，發現NaBEt4 衍生化效率更好，所得到的MBT、DBT、TBT 檢測限更低，其檢測限分別為1.4、1.8、0.8ng/L，相對標準偏差為1.1%5.3%。3.2 液相色譜聯用技術HPLC 本身所帶檢測器對有機錫化合物進行分析時，其靈敏度不高，通過接口技術HPLC 可實現與一些元素特征性檢測器聯用，這種連接須滿足兩個條件：1)色譜柱的流量等參數與所用檢測器相匹配的問題；2)檢測器須控制由此帶來的稀釋效應以達到最高的靈敏度。3.2.1 液相色譜-電感耦合等離子體質譜(HPLC-ICP-MS)HPLC 與ICP-MS 聯用作為微量元素分析有效的途徑，它融合HPLC 高效分離特點及ICP-MS低檢出限、寬動態線形范圍及能跟蹤多元素同位素信號變化等優點。液相色譜與電感耦合等離子體質譜聯測定有機錫時，靈敏度高、檢測限低，它是食品中有機錫常用的分析技術。ICP 經過的高溫過量的氧氣對采樣錐造成損害，因此需要適當控制氧氣的加入量。Yu 等41利用HPLC-ICP-MS 分析貝類樣品中的TMT、DBT、TBT、DPhT、TPhT。采用AgilentTC-C18 色譜柱，CH3CN、H2O、CH3COOH 流動相體積比65:23:12，0.05% TEA，pH3 對菲律賓蛤及毛蛤樣品進行超聲萃取及高速離心后，用上述方法進行了分析。結果表明：海產品含有4 種有機錫，其中TBT 和TPhT 的含量最高為14.38104.7g/L (干質量)。TMT、TBT 和TPhT 的加標回收率均大于80%。Leng等42利用Eclipse PlusC18反相色譜柱對水產品中7種有機錫化合物進行分離，利用電感耦合等離子體質譜對錫元素進行檢測，外標法定量測定水產品中7種有機錫化合物的含量。在leng的文章里，因為文獻多采用TC-C18陰離子交換柱43-47或300-SCX陽離子交換柱44分析有機錫化合物。而leng研究旨在同時檢測7種有機錫化合物，考察了7種有機錫化合物混合標準溶液在ZORBAX 300-SCX色譜柱的分離情況。ZORBAX 300-SCX離子交換柱能較好的分離DPhT、DBT、TPhT、TBT、TMT等5種有機錫化合物，卻對MBT和MPhT無法進行有效分離（圖1下），且目前也未見相關文獻報道使用該色譜柱對MBT和MPhT化合物進行分離。由圖1b可知，采用ZORBAX SB C18分離7種有機錫化合物，在30min內只檢測到TBT和DBT ，這可能與SB C18色譜柱采用空間位阻較大的二異丁基側鏈基團作為鍵合相有關，影響了有機錫化合物與鍵合相的相互作用，導致分離效果不理想。由圖1c和1d可知，采用XDB-C18色譜柱能同時有效地分離TMT、MBT、DPhT、DBT、TPhT、TBT等六種有機錫化合物，而使用Plus C18色譜柱則能使TMT、MPhT、MBT、DPhT、DBT、TPhT、TBT等7種有機錫化合物在30min內得到有效地分離。相比SB C18色譜柱，采用二甲基側鏈基團作為鍵合相的XDB C18和Plus C18色譜柱對有機錫化合物的分離頗為有效，兩種色譜柱的差別僅在于填料的孔徑和比表面積的差異。具有較小孔徑和較大比表面積填料的XDB C18分離能力略遜于大孔徑小比表面積的PlusC18色譜柱。3.2.2 質譜條件的優化從ICP經過的高溫過量的氧氣對采樣錐造成損害，因此需要適當控制氧氣的加入量44。對于質譜條件的優化，由于流動相中有機相的比例較大，很可能導致ICP熄火，因此需要加一路選擇氣(O2:Ar)合適比例，這樣可以減少碳在錐體表面的堆積，避免熄火，然而通入氧氬混合氣會明顯降低儀器的靈敏度，因此需要平衡好兩者的關系，要采用合適配比的氧氬混合氣，從而可以最大化的改善儀器熄火的現象，并且達到較高的靈敏度。4 毛細管電泳(CE)毛細管電泳(capillary electrophoresis，CE)是20 世紀80 年代后期分析化學、特別是生物分析化學領域取得的重大研究進展，也是90 年代最有影響力的分離手段之一。毛細管電泳是指以高壓電場為驅動力，以毛細管為分離通道，依據試樣中各組分之間淌度和分配行為上的差異而實現分離的一類技術，具有快速、高效、高靈敏度、重現性好及自動化等優點。對同一元素的不同形態，只要有結構或電荷上的差別，即可用CE進行分離48目前毛細管電泳已進入一個新的發展階段，用毛細管電泳和間接紫外檢測器或間接熒光分離有機錫是種較新的方法。小結目前有機錫分析存在兩大問題：一是有機錫分析的樣品種類少。目前研究主要關注環境中有機錫對人體造成的危害，水產品中有機錫測定的文獻相對較少，而食品是人類生存的必需品，必須加強這方面的研究，揭示其對人體健康的危害；二是有機錫分析技術的限制。有機錫的主要分析技術是氣相色譜、液相色譜。GC 對高沸點化合物、非揮發性物質、熱不穩定化合物、離子型化合物及高聚物的分離、分析較為困難。用氣相色譜分析有機錫時，必須進行衍生化步驟，有機錫衍生化是煩瑣的、費時的，還會影響有機錫的萃取效率。HPLC 不涉及有機錫的衍生化，分析對象也要廣泛得多，可以分離通常以離子或中性形式存在的絕大部分有機錫化合物，適用范圍頗為廣泛。但是與HPLC 聯用的靈敏檢測器有限，與GC 和HPLC 相比，毛細管電泳法有很大的應用潛力，越來越受到人們的重視。綜上所述，在有機錫化合物研究中，要進一步加大樣本檢測數量，優化樣品前處理條件，盡可能排除各種共存物質的干擾。啟發在第十八次論文年會中的講座中，關于在儀器分析的試驗中，得到很多啟發，例如分析結果的準確率受很多因素的影響，可以考慮因素，探究最佳實驗條件，得到更低的檢出限，因此，我考慮了以下幾個因素：1、通過調整色譜條件（色譜柱、流動相類型和配比、流速等）、ICP-MS條件，建立有機錫化合物定性定量的分析方法。2、通過溶劑提取、超聲、萃取、固相分離等手段，對樣品進行處理，獲得較穩定的、提取率較高、基質干擾小的處理方法。參考文獻1 胡冠九，徐明華有機錫化合物的性質,環境污染來源及測定方法環境監測管理與技術，2000(B12): 14-16,30.。2 CUIYan-Jie, KANG Tian-Fang, CHAO Jing-Bo.20093 Fent K, Mueller M D. Environ.Sci. Technol, 1991, 25:4894934 Ebdon L, Evans K, Hill S. The science of the total environment,1989, 80:63685 Dahab OA.Air and soil pollution, 1988, 40:43344l6 Terry L,Wade. Chemosphere, 1990, 20(6):6476627 IANG Gui-Bin. Journal of hygiene research.2001, 30(1):l38 ZHAO Dong-Mei,WANG Xin-Hong, MA Jian-Qiang, HONG Hua-Sheng. Journal of tropical oceanography. , 2007, 26(4):7683 9 Sadiki AI, Williams DT, Carrier R, et al. Plot study on the contamination ofdrinking water by organotin compounds from PVC materials J .Chemosphere, 1996,32: 2389-2398 10 代佼，王正虹，李林.三甲基氯化錫的毒性及危害研究進展.現代預防醫,2011,Vol.38,NO.811 Muhammad Bachri Amran, A. Sentosa Panggabean, Buchari Buchari.Ion-pair reversed-phase chromatography for speciation of organotin compoundsAnn Toxicol Anal. 2010; 22(3): 129-134 12 Heidrich D D, Steckelbroedk S, Klingmuller D.Inhibition of human cytochrome P450 aromatase activity by buty ltins J .Steroids , 2001 , 66(10):763 769. 13 Whalen M M, Loganathan B G , Kannan K.Immunotoxicity of environmentally relevant concentrations of butyltins on human natural killer cells in vitro J .Environ Res, 1999, 81 (2):108 116 . 14 Whalen M M, Loganathan G B.Butyltin exposure causes a rapid decrease in cyclic AMP levels in human lymphocytes J .Toxicol Appl Pharmacol , 2001, 171(3):141 148. 15 De Santiage A, Aguilar-Santelises M .Organotin compounds decrease in vitro survival , proliferation and differentiation of normal human B lymphocytes J .Hum Exp Toxicol, 1999 , 18(10):619 624.16 Dahab,O.A. Water, air and soil pollution, 1988,40,433-44117 Ebdon,L., Evans,K. Hill S., The science of the total encironment,1989,80:63-6818 Fent,K, Muller,M.R. Environ, Sci. Techno., 1991,25,489-49319 Wade,T.L.,et al. chemosphere,1990,20(6),647-66220 江桂斌，徐福正有機錫化合物測定方法研究進展海洋環境科學，1999,(3):61-68.21 江桂斌，劉稷燕我國部分內陸水域有機錫污染現狀初探環境科學學報，2000（5）: 636-638. 22 黃長江， 董巧香，等.我國東南沿海 3 港口有機錫污染的調查海洋學報,2005（1）: 57-63. 23 江桂斌國內外有機錫污染研究現狀衛生研究，2001，30(1)：1324 石孝洪，魏世強，李 軍有機錫化合物的環境化學行為及效應重慶大學學報，2003，26(7)：10410725 王永芳有機錫化合物的污染及其毒性中國食品衛生雜志，2003，15(3)：24424726 Vinas, P., Lopez-Garcia, I., Merino-Merono, B., Campillo, N.,Hernandez-Cordoba, M. Journal of Environmental Monitoring. 2004, 6(4):26226627 Minganti, V., Capelli, R., Depellegrini, R. Fresenius Journal of Analytical Chemistry. 1995, 351(4-5): 47147728 Munoz, J., Gallego, M., Valcarcel, M. Analytica Chimica Acta.2005,548(1-2):667229 Munoz, J., Gallego, M., Valcarcel, M., Analytical Chemistry. 2005,77(16):5389539530 Xu Fuzheng，Jiang Guibin，Han Hengbin. Chinese J. Anal. Chem. 1995，23(11)：1308131231 Raimund Wahlen, Tim Catterick. Journal of Chromatography B. 2003,783:22122932 GUERIN T, SIROT V, VOLATIER J L, et al. Organotin levels in seafood and its implications for health risk in high-seafood consumersJ.Science of the Total Enviorment, 2007, 388: 66-77.33 JIANGGuibin, ZHOUQunfang.Direct grignard pentylation of organotin contaminated lard samples followed by capillary gas chromatography with flame photometric detectionJ. Journal ofChromatography A, 2000,886: 197-20534 CAMILLA L, MARINA D C, EMANUELE M. Comparison of two analytical methods for the determination of organotin compounds in marine organismsJ. Comptes Rendus Chimie, 2009, 12(8): 831-840.35 沈海濤, 馬冰潔, 高筱萍, 等. 氣相色譜 - 質譜法測定水產品中的有機錫J. 中國衛生檢驗雜志, 2008, 18(1): 69-70.36 MAGI E, LISCIO C, di CARRO M. Multivariate optimization approach for the analysis of butyltin compounds in mussel tissues by gas chromatography-mass spectrometryJ. Journal of Chromatography A, 2008, 1210(1): 99-107.37 柳英霞，李娟，等食品中有機錫化合物分析方法研究進展J，食品科學2010, Vol. 31, No. 19 43538 QIN Xiao, HU Bin, HE Man. Speciation of butyltin compounds in environmental and biological samples using headspace single drop microextraction coupled with gas chromatography-inductively coupled plasmamass spectrometryJ. Journal of Chromatography A, 2008, 1211:135-141.39 俞是聃, 肖毓銓, 陳曉秋, 等. 氣相色譜與電感耦合等離子體質譜聯用測定海產品中有機錫的研究J. 福建分析測試, 2008, 17(1): 40-43.40 UVEGESM, RODRIGUEZ-GONZALEZ P, GARCIA ALONSO J I, etal. Isoto