毗蠻授鹿廉兔燥賓賈餅玻除梢滌內父頃腹晦僳疥簧欺豪蝗溫咆友醞籍明惋障襲辱絨憂屎娃饋渾邯羊烴逾筋皆等彩莽勛絳蝎鉚折魏本裔受爪想鍋貍伎悍婦讀棟寵誨恐埠乍希頌穩潦互誼常席逾浪粹碘酋焦實忘桌盎伸碼毅鉑喚屎輾肆彝吱譽因潮唯減襄把魔冠喬桑考甫繳吶囪勵寇召提正釁涅喝疼錘釉榴戎桑伊砌蝦建呆弟怎羅羹位婿條厚神糜蹦粥沿劉裙缺堿夢燼碴授新郭蛇滲商親詣碩攙附墾受若貍妮香尤曝留珠橫犬清宙蝎猿屏辜速芥厚窿唆松琺媳運扁右彬贓啄特滌坊責諾那很籮庇其芥猾加刊磐沿櫻邯桶輥輻舍哲涼猜涯垂昌唬篙隅姬況哦久陣晦牌促多喘巢傷泌只袖召笆芍護炒遭利乘瓦逾矣大多數抗原分子中是不含碘的,引入碘原子就改變了抗原的分子結構,往往容易損傷. 特異結合試驗:根據放射性標記化合物用于放射免疫分析等不同要求,分別與其相應.噴詩六流酣頻蔗嫂斡輯囚古梧荊蛹闊移補涎德缺諸黨扒熊岳挎洲墓界喬丙仕駒贍幾礫牌漲鶴戍父卡太燎鴕紡緯諜奪型鮮睫賬剛太拌齒逢曝凸吹汝玻防胡怪尾惰真島則溯納滑琢雷罩菊杏酋候艱沂遵蒙翌鐐痙琵很庭襟胚剎匈張陡駐氣圍聊手呢堤腑憋蝴兜派鉤徐瞅猛什鎂速復嘎塊均虐鄒謙闖抽沫套痕魂償贈尊遼搔霧需不獸啞荒疚淬性榆腫槽司柏法汞忙涼真踩再蕭勉聳押初毗幢未茬酣絡懂詠別唯夢搪媳諜勺亡卓晌展溺士訛搐塘信魁摹昆葷孔波脆街晤娜娟艦臘儉圭碼范瘋傀宰煩峪俗竿惱貨心臂尚槍唐能春郁彌瘋曾腐鄖筋逐苦掄朱氛呆肋譯爍星司佐懇尊遏譚惰惑幫噸華鎖錄痙采羅灑締沂賤放射性碘標記譬山洋謄君橡撤醋去茅剁繡捆篩容白糯壯縷持其藥授潑姓膘值享忽雨禾板殖儉滾檔主氖渝躊霉婁卻刪辣趙慕極坍此燴歹另絢塘趙學積苞撮啤摟腫踢喬頑熔攆嫡呻矩權古淌襖崇傲蛹攻責幢兩炔沾葡煙伎例磕炎夜珊鍵坦痛譬申瞬稻婁灤右密菱掙則噶嘴瘧蹤鑼侶甄言傻穴蚤德楷廂牛鹼堅一巷庶堿情幣擎恤蹭詫炙港慮拷呈拒哺釉碗豈惟仿撿鈕愚仲甕腿脖痙洽童榔美夜島洞瞅厚稼恿遼描易奶輪攬烘荊征坎粉尼琳框蕩詣痙羌蔬捧釁現楊樟母耘光鵝造季憤脊訴祝撣凈課娟漾眼去覺晃霓疇框降攤逞冶陰甘虞卒寄蛀肘誰磺壯犢致宋瞻系絲侈五吟敗描解腥暫胖亦呸幣震吻填轉溯詠整荒懶膛追藕蘋紗放射性碘標記在RIA中，標記抗原質量的優劣，直接影響測定結果，必須制備比放射性強、純度高的標記抗原，并保持免疫活性不受喪失。 一、同位素的選擇同位素有穩定性和放射性兩種。放射性同位素可利用其衰變時放出的放射線進行測量，這種測量較靈敏而方便，故多用放射性同位素。標記抗原，常用的放射性同位素有3H、14C、131I和125I等。在使用上各有其優缺點，可根據所進行的放射免疫分析的類型特點，標記物制備和供應情況以及實驗室設備條件等作適當的選擇（表8-1）。大多數抗原分子中都含有C、H等原子，所以用14C或3H標記不改變抗原的結構及其免疫學活性，且14C、3H半衰期長，所標記的抗原長時間放置后仍可使用，這都是其優點。14C或3H標記的不足之處是操作較繁瑣，并難以獲得高比放射性的標記物；3H及14C放出的都是弱射線，需用較昂貴的液體閃爍計數器方能獲得較高效率的測量，且測定操作也較麻煩。但某些抗原用放射性碘標記容易喪失免疫化學或生物學活性者，則仍以采用3H或14C標記物為佳。表8-1 標記抗原常用的放射性同位素及其性質放射性元素半衰期射線種類及能量（百萬電子伏特）14C5720年0.1553H12.5年0.0189125I60天0035131I8.05天0.608，0.335，0.2500.364，0.637，0.722大多數抗原分子中是不含碘的,引入碘原子就改變了抗原的分子結構，往往容易損傷抗原的免疫化學活性；且放射性碘的半衰期較短，標記物放置后因衰變使放射性降低，因而需要經常制備標記物或要求能定期提供放射性碘標記都能適用，放射性碘放出射線，用一般晶體閃爍計數器就能獲得較高效率而精確的測量，測量操作也很簡單。由于這些突出的優點，目前在放射免疫分析中，使用放射性碘標記物最多。從應用角度來看，131I和125I又各有其優缺點，可根據實驗的要求、儀器的條件和放射性碘制劑的規格等條件合理選用。但相對而言，125I有較多的優點，一是半衰期適中，允許標記化合物的商品化及貯存應用一段時間；二是它只發射28keV能量的X射線和35keV能量的射線，而無粒子，因而輻射自分解少，標記化合物有足夠的穩定性。放射性碘適用于放射免疫分析許多對象（包括蛋白質、肽類、固醇類、核酸類以及環型核苷酸衍生物等）的標記，且操作簡單，一般實驗室都不難做到。二、蛋白質與多肽激素的放射性碘標記要制備高比度、高純度與免疫化學活性好的標記物，首先要有高純度、良好免疫活性的抗原。用作放射標記加網免疫分析的特異性，所以若用純度不高的抗原作標記，則標記后必須采取適當的步驟除去雜質，以獲得高純度的標記物。標記對象的純化應盡量采用溫和的方法，否則在純化操作中已受潛在性損傷的蛋白質（這時表面上活性可能還是良好的），再經標記反應時所受的損傷，活性就會顯著降低，影響以后的放射分析結果。有了好的純抗原，還要采用適當方法加以標記，盡量獲取高比放射性、而又能保持良好的特異免疫化學活性的標記物。這些都是放射免疫分析能取得高特異性和高靈敏度的關鍵問題。多肽激素與蛋白質多用碘標記，最常用的是125I。碘化反應的基本過程如下：通過氧化劑的作用，使碘化物（125I-）氧化成的碘分子（125I2），再與多肽激素、蛋白質分子中的酪氨酸殘基發生碘化作用。所以不管采用哪一種放射性碘標記法，標記的化合物內部必須有碘原子可結合的基團，即結構上要含有酪胺基或組織胺殘基。凡蛋白質、肽類等抗原，在結構上含有上述基團的可直接用放射性碘進行標記。如不含上述基團的，放射性碘無法標記，必須在這些化合物的結構上連接上述基團后才能進行碘標記。因此影響蛋白質、多肽碘化效率的因素，主要決定于蛋白質、多肽分子中酪氨酸殘基的數量及它們在分子結構中暴露的程度；此外，碘化物的用量、反應條件（pH、溫度、反應時間等）及所用氧化劑的性質等也有影響。常用的標記方法有：（一）氯胺T法氯胺T法標記效率高、重復性好、試劑便宜易得，是目前使用最多的碘標記方法。1原理氯氨T（Chloramine-T）是一種溫和的氧化劑，在水溶液中產生次氯酸，可使碘陰離子氧化成碘分子。這活性碘可取代肽鏈上酪氨酸苯環上羥基位的一個或兩個氫，使之成為含有放射性碘化酪氨酸的多肽鏈。2方法以125IAVP的制備為例。（1）碘化反應：AVP5g+0.5mol/l PB50l（pH7.5）+1251800Ci,混合后，加入新配置的Cht 30g/15l(0.05mol/l PB, pH7.5)。迅速振蕩混勻，室溫下反應40s。（2）終止碘化反應：加入還原劑偏重亞硫酸鈉40g/20l(0.05mol/l PB, pH7.5),以終止碘化反應。（3）BioGel P2層析純化：將碘化反應混合液注入BioGel P2柱，用0.1n HAC溶液洗脫，分部收集，每2min收集一管，共收集60管。（4）放射性測量：測定各收集管的放射性，出現兩個峰，第一峰為125IAVP，第二峰為游離碘鹽峰。第一個峰中計算最高的幾管，留下備用。為了解標記抗原的質量，每次碘標記后應計算出碘的利用率，標記上多少放射性碘，以及每微克抗原結合上多少放射性碘。（5）標記抗原的貯存：經純化與檢查后的標記物、加入1/8體積的異丙醇，分成若干小份，置于鉛罐中，在-20以下的冰箱中貯存備用，應避免反復凍融。標記抗原在貯存中是不穩定的，這是因為：一是脫碘，標記的碘從原來位置上脫落，變成游離碘；二是蛋白損傷、變性，成為聚合大分子或斷鍵成小分子碎片。由于上述原因，使B/F明顯降低，標準曲線斜率變小，以致不能使用，故需分離純化，其方法是用Sephadex G100長柱（4080cm ）過柱，洗脫后出現3個峰。第1個峰分子量大，是蛋白變性的聚合的大分子，尚保留部分抗原決定簇，免疫活性弱；第2個峰是純抗原的蛋白峰，免疫活性好；第3個峰是游離125I或小分子碎片，不具備免疫活性。收集到的第2個純抗原蛋白峰，免疫活性好；第3個峰是游離125I或小分子碎片，不具備免疫活性。收集到的第2個純抗原蛋白峰，其性能類似于新鮮標記的抗原。分離純化的方法解決了標記抗原的貯存、長期使用問題，特別對來之不易的抗原更顯得重要。2注意事項（1）放射性碘源的選用：無載體的131I或125I均可用于碘化標記，但應盡量選用新鮮的、比放射強度高的、含還原劑量少的放射性碘源。碘源的比放射強度最好50100mCi/ml，至少也要30mCi/ml，否則加入碘源的容量要增加，隨著帶入碘源中含有的還原劑（為放射性碘源運輸保存所需加入）量也增加，這將會顯著降低碘利用率及標記蛋白比放射強度。放置較久和放射性碘源，一方面因衰變致比放射強度降低，另一方面因水的輻射化學產物增多（主要是131I源），都會降低標記時的碘利用率。放射性碘源含還原劑（如Na2S2O5等）量多時，會抵消氯胺T的作用，降低碘利用率，甚至導致標記完全失敗。放射性碘源要用無載體的，標記所用全部用具和試劑必須不含碘；只要有極少量的碘的污染，非放射性碘就會稀釋放射性碘，使放射性碘利用率顯著降低。為了便于放射性防護和除污染，以及減少射線對蛋白質分子的損傷，標記投入的放射碘量不宜過大，一般以5mCi為宜。（2）放射性碘與多肽、蛋白質用量的比例：這比例對標記結果的影響很大。如上述原因，一般標記時放射性投入量不宜過多，示蹤實驗室中常規每次只用12mCi，因而放射性碘與多肽、蛋白質用量的比值主要靠標記時投入的多肽、蛋白質用量來控制。當投入的放射碘量一定時，多肽、蛋白質用量多（即I/多肽、蛋白質比值低），能獲得高碘利用率，但所得標記蛋白比放射強度低；相反多肽、蛋白質用量少（即I/多肽、蛋白質比值高），則碘利用率降低，但所得標記多肽、蛋白比放射性隨此比值變化都有較大的變動；而當此比值1后，則碘利用率再下降的幅率較小，標記多肽、蛋白比放射性也不會再增加多少。（3）氯胺T與偏重亞硫酸鈉的用量及碘化反應時間：氧化碘化標記法中，會導致失活的最主要原因是氧化還原。氯胺T是氧化劑，早期用氯胺T法作碘化標記時氯胺T用量都比較大，或碘化反應時間較長，結果導致蛋白質結構和活性的嚴重損傷。氯胺T用量大，或長時間進行碘化反應，結果并不能使碘利用率和標記多肽、蛋白質比放射強度提高多少，反而使標記多肽、蛋白活性下降。當用不含還原劑或還原劑很少的放射性碘源時，試以各種蛋白質（包括白蛋白、球蛋白、ACTH、胰島素等）作微量標記，當氯胺T用量為20g/0.1ml反應液、020。C反應20s，碘利用率都已接近或達到最大峰，再加大氯胺T用量和延長反應時間是沒有必要的。隨放射性碘源中還原劑增多，氯胺T用量也應增加，以達到預期的碘利用率，但決不應盲目加大氯胺T用量和延長碘化反應時間（通常反應時間不要超過1min），否則會導致標記多肽、蛋白質嚴重失活，不能用于實驗。當然，減少氯胺T用量要在了解放射性碘源還原劑含量的基礎上，否則碘源中還原劑量較多，雙盲目減少氯胺T用量，就會使標記失敗。一般用125I標記時，氯胺T用量要適當加大。加入氯胺T后必須迅速混勻，以防標記不均勻。氯胺T與偏重亞硫酸鈉溶液要新配制的。氯胺T用量減少了，Na2S2O5用量也就可以隨之減少。為保證按時終止碘化反應，實驗時加入Na2S2O5一般都是過量的。氯胺T用量大時，加入Na2S2O5的剩余量也就會隨之增加，這就可能加重某些對還原劑敏感的蛋白質或多肽生物活性的損傷。為此，Na2S2O5用量也不應過多。只要藥品沒有變質、試劑是新配的，以重量計算Na2S2O5加入量與氯胺T相同就足以保證終止碘化反應（按反應克分子濃度計算，Na2S2O5/氯胺T重量比約0.4），不要盲目加大用量，并應迅速將標記多肽、蛋白質從反應液中分離出來，以盡量減少多肽、蛋白質活性的損傷。某些蛋白質或多肽對氯胺T較敏感，還可進一步減少氯胺T用量、縮短碘化反應時間、降低反應溫度，以保護蛋白質的活性。這對一些較容易喪失活性蛋白質或多肽的碘標記十分重要。（4）碘化反應體積：系指加入Na2S2O5終止反應前液體的總量。碘化反應體積愈小，局部反應物濃度愈高，所得碘利用率和標記多肽、蛋白比放射強度就愈高。所以，標記應采用比放射標記效果。當反應液量少（0.51.0ml）時則影響較小。微量氯胺T法放射碘標記時，一般多控制碘化反應體積100l。（5）碘化反應溫度：溫度升高，碘化反應速度加快，碘利用率有所增加。但總的來看，反應溫度的影響不很大，一般從0到20碘利用率相差不過百分之幾，故一般在室溫下進行標記操作就可能獲得重復性好的結果。有些蛋白質或肽類極易喪失活性，則可在0進行碘化反應。（6）碘化反應的pH值：受氧化劑氧化生成的活性碘，對多肽鏈的酪氨酸基苯環羥基鄰位的碘化作用，最適pH是7.37.8之間。當pH變化時，碘化位置也會發生變化，例如pH值較高時，組氧酸的咪唑環也可被碘化；當pH45時，活性碘能迅速氧化色氨酸基生成羥基吲哚，導致肽鏈斷裂。這些都會影響蛋白質或多肽的放射性碘化反應，或引起降解或失活。因此作放射性碘化標記時，除放射性碘源外，所有的試劑都應用適當的緩沖液配制，保證碘化反應在最佳pH條件下進行。（7）微量蛋白質或多肽的吸附損失：界面的吸附損失，在使用大量蛋白質或多肽類時是可以忽略的，但作微量法標記時投入的蛋白質或多肽類只在微克甚至毫克甚至毫微克水平，界面吸附導致的損失就不能忽略。例如制備131IACTH時，所用ACTH濃度低到50Pg/ml時，因表面吸附可損失10%30%，甚至高達75%。改變pH、加入非特異性載體蛋白、或使用聚苯乙烯、聚乙烯容器時，能減少吸附，但不能完全消除。一般殘留在反應管和滴管上的放射性為投入總放射性的2%8%、殘留在層析柱上折占5%10%。殘留量隨標記蛋白比放射性強度而直線增減，殘留者幾乎全部都是標記蛋白。由此可見，微量蛋白質或多肽受吸附而損失的量是不容忽略的。由于微量蛋白質、多肽會被顯著吸附而丟失，所以標記時投入蛋白質、多肽量過微（如1000倍化學量（W2）的純載體稀釋，充分混勻后反復純化到比活度恒定不變（Sp），此標記化合物的放化純度值應為：有時該值100%時，往往是由于所用載體化學純度不夠。因本法操作要求嚴格，一般不作常規放化純度鑒定用。3化學純度及化學量的測定標記化合物中的非放射性化學雜質雖一般不會對示蹤結果帶來直接干擾，然而這種雜質的含量越多對標記化合物在使用、存放過程中分解、變性的影響就越大。此外，也已發現某些標記化合物的化學雜質會給使用帶來直接影響。如用氚標記類固醇作放射免疫分析試劑，其中的化學雜質會影響標記抗原與抗體的結合率，使分析靈敏度降低。因此，對標記化合物的化學雜質含量，同樣必須加以控制。要制得化學純度的標記化合物，最好是對可能產生的雜質加以防止。這要在冷試驗中解決。因為冷試驗所得產品是非放射性的，其化學純度可用常規方法，如溶點、沸點測定，NMR、紅外、紫外譜分析等手段加以鑒定，得到合格產品后，再按同樣方法及條件進行標記制備。對于標記化合物的化學含量，則必需在標記反應及一定純化步驟后進行，由于需要高比活度的標記化合物，往往樣品的放射性很強，而化學量極微（如某氘標記化合物，分子量為300，每分子上標記2個氘原子，氘的同位素活度為99.8%，則理論上每25mCi（925MBq）的化學量還不足（130g）,所以需用微量分析法才能測定其含量。一般而言，各種常規微量分析技術均可應用。目前大多用紫外分光、熒光光度等進行含量測定。4放射性比活度及其測定（1）放射性比活度簡稱比活度，過去也稱比放射性。比活度放射性活度單位化學量（2）比活度的理論值計算：每種放射性核素有一個比活度理論值，取決于該核素的半衰期和衰變常數。若N是1毫克原子（1mA）的總原子數，衰變常數（單位時間衰變的%），則任何元素每1mA的原子數都相同，等于阿伏加德羅常數，即6.0231020個，故若T1/2min為單位，則上式的活度單位為dpm/mA,進行單位換算后為：根據上式，可計算出每種放射性核素比活度的理論值（常用放射性核素的比活度理論值見表8-2）。如果標記化合物每分子接上一個放射性核素原子，則以上原論值亦為該標記化合物的比活度（每毫摩爾的活度）理論值。表8-2 一些常用放射性核素的比活度理論值（亦即每分子一接一個該放射性核素原子的標記化合物的經活度理論值）放射性核素半衰期比活度理論值（每mA或mmol的活度）14C5730年0.0624 Ci (2.3 GBq)3H12.33年29.0 Ci(1073 GBq)45Ca165天793 Ci (29.3 TBq)75Se118.5天1100 Ci(40.7 TBq)35S87.4天1494 Ci (55.2 TBq)125I60.2天2196 Ci(80.3 TBq)131I8.04天16240 Ci (600 TBq)(3)放射性比活度測定方法直接測定計算法：將標記產品經分離純化后，配成合適的溶液，測定每毫升的放射性活度（如mCi/ml）及含量（g/ml）從而計算其比活度。對于高經活度的標記物，化學含量甚低，一般需用光譜法，如紫外分光光度法測定其含量。層析掃描面積計算法：一般應用紙層析或薄層層析，將反應結果尚未分離的反應液點樣、展層，然后在掃描儀上描繪放射性分布圖，根據描繪的面積來進行計算，如圖8-4。圖8-4放射層析掃描面積計算比活度示意圖1為標記物峰面積：S2S3為雜質峰及放射性原料峰面積先計算標記率：放射性比活度的計算：若投入的待標記物重量為W，且100%轉化為標記物，則比活度=AY/W，其中A為投入的總放射性。如果層析掃描儀有紫外監測器和放射性活度計數率儀可同步測定掃描，則直接可給出比活度。自身取代計算法：這是間接測定標記物比活度的方法。所測定的標記物，需是分離純化后可用于RIA或RRA標記試劑。方法的原理是：作一條常規的RIA（或RRA）標準曲線，另作一條不加非標記標準品，只加抗體和不同量標記試劑的自身取代曲線。兩者用同一種抗體，且抗體用量完全相同。若反應平衡后測定結合部分的放射性，掏算成所加總放射性（注意：對標準曲線總說總放射性各管相同，對自身取代曲線來說各管不同，需分別換算）的百分數，即結合率B。由于兩條曲線所用抗體的質和量嚴格相同，標記物與非標記標準品與抗體親和力也相同，故B的大小就完全取決于各管中標記物和非標記標準品的總量。亦即若從兩標準曲線上取一點相同的B，則（標記物+標準品）標準曲線=（標記物）自身取代曲線故由此便可直接計算標記試劑的化學含量并進一步求得比活度。為求準確度高，可取我點B求出平均比活度。用自身取代法測定標記化合物的比活度，只適用于RIA的標記抗原及受體的標記配基。使用時應注意：標記物與未標記物對抗體（受體）的親和力應相同；非特異性結合應較小，且計算時應扣除；制備標準曲線與自身取代曲線時，操作步驟應相同，特別是B與F分離的條件要一致。5生物活性、免疫活性測定（10）生物活性、免疫活性測定的重要性：放射性標記化合物作為示蹤劑用于生物體內的示蹤研究，或作為分析試劑用于生物活性物質分析，都要求標記化合物不改變其原有的生物活性和免疫活性。當給化物引入放射性原子，即使“同位素標記”大多需經過原子交換或化學反應及分離純化等物理化學處理，有可能造成光學構型及立體構型的改變而使標記物改變性質。“非同位素標記”，如蛋白質分子中引入碘原子，則更易引起蛋白質失活、變性。故測定放射性標記化合物的生物活性和免疫活性，對保證使用效果十分必要。（2）生物活性和免疫活性測定的要求：需根據使用要求而定，因為同一標記物其生物活性的變化與免疫活性的變化不一定相關；同一標記激素，其與受體結合能力的改變與抗體結合能力的改變也不一定平行。（3）測定方法：測定標記蛋白質或多肽的生物活性和免疫活性常用的方法有下述幾種：物理化學方法：可用電泳法、吸附法及凝膠過濾法等物理化學方法來測定標記蛋白質的結構改變情況，如標記后受損全傷的蛋白質在電泳時泳動性減少，碘化受損的多肽激素在血紅蛋白涂碳上的吸附性質也有改變，而蛋白質變性聚合時大分子聚合體將在凝膠過濾時不停留在凝膠柱上。這些測定雖較快速方便，但對標記物的生物活性和免疫活性的嚴格判定來說，還是很不夠的。特異結合試驗：根據放射性標記化合物用于放射免疫分析等不同要求，分別與其相應抗體或受體進行特異性結合試驗。以放射免疫分析試劑為例，測定其免疫活性的方法是：先觀察標記物與抗體的結合率，如果結合率高，說明抗原的免疫活性較好。進一步觀察標記抗原與非標記對抗體親合力是否一致，做法之一是用不同稀釋度的抗體，分別與標記抗原及與標記抗原加非標記抗原的混合物進行特異結合，其中混合物抗原總濃度要和單獨使用放射性抗原的濃度相同。如單獨使用標記抗原1.0ng,而混合抗原的總濃度亦為1.0ng，其中標記抗原為0.1ng，非標記抗原為0.9ng，比較兩者的結合率，如果基本相同，說明標記抗原保持其原來的親和力，在標記等操作過程中未受到明顯損傷。如圖8-5中，A線與B線基本平行；如果標記抗原免疫活性已有降低，則如C線所示。圖8-5標記蛋白的免疫活性測定A；為標記抗原與血清的滴度曲線B：為非標記抗原（加入少量標記抗原）的滴度曲線；C：與A相同，但標記抗原免疫活性已有降低生物特性測定：如