1、蛋白質(zhì)雙向電泳及質(zhì)譜技術(shù),蛋白質(zhì)雙向電泳技術(shù),雙向電泳簡(jiǎn)介,2-DE是目前唯一種可以僅通過一次操作解析上千種蛋白質(zhì)的技術(shù) 。 第一向等點(diǎn)聚焦(IEF) pH梯度載體 pI 第二向十二烷基硫酸鈉-PAGE(SDS-PAGE) SDS作為變性劑和助溶劑 分子量,樣品,等點(diǎn)聚焦 (第一向),雙向電泳的基本原理與流程示意,分子量,pH 梯度(pI),SDS-PAGE,兩性電解質(zhì),第二向,雙向電泳具體步驟,樣品制備 緩沖液的配制 IPG條重泡漲及上樣 第一向：IEF IPG條平衡 平衡緩沖液(還原) 平衡緩沖液(巰烷基化) 第二向：SDS-PAGE 膠條染色 成像及圖像分析,為什么要進(jìn)行樣品制備,目前雙

2、向電泳一般只能分辨到1000-3000個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)(spot)，而樣品中的蛋白種類可達(dá)到10萬種以上。 待研究樣本(如臨床樣本)常是各種細(xì)胞和組織混雜，而蛋白質(zhì)組研究的通常是單一的細(xì)胞類型。,？,1 保證樣品蛋白質(zhì)完全溶解，分級(jí)效果好，干擾因素少 盡量使所有待分析的蛋白樣品全部處于溶解狀態(tài)（包括多數(shù)疏水性蛋白）。 避免樣品制備過程中發(fā)生樣品的抽提后化學(xué)修飾（如酶性或化學(xué)性降解等）。 完全去除樣品中的核酸和某些干擾蛋白。 盡量去除起干擾作用的高豐度或無關(guān)蛋白，從而保證待研究蛋白的可檢測(cè)性。 通過超離心去除所有顆粒狀物質(zhì)，防止其堵塞凝膠孔路。 2 最大限度減少樣品的損失 低溫保存樣品(一般需低于-8

3、6) 盡量縮短處理時(shí)間 除鹽，省略不必要的過程 保證樣品在聚焦時(shí)不發(fā)生蛋白的聚集和沉淀。,樣品制備原則,樣品制備流程及注意事項(xiàng),溶解,預(yù)處理 (清洗等),破碎,沉淀,按溶解度分級(jí),富集,除雜,樣品的破碎,原則最小限度的減少蛋白水解和其它形式的蛋白降解 樣品的來源 易碎的細(xì)胞 堅(jiān)硬的組織 植物細(xì)胞 真菌,方法,溫和,劇烈,溫和破碎法,滲透壓沖擊(培養(yǎng)的細(xì)胞) 低滲液中的懸浮細(xì)胞 反復(fù)凍融法(細(xì)菌) 液氮冷凍 去污劑降解(酵母、霉菌) 降解緩沖液(含尿素和去污劑) SDS(應(yīng)在IEF前去除) 酶降解(植物、細(xì)菌、真菌) 溶菌酶(細(xì)菌) 纖維素酶，果膠酶(植物) 溶壁酶(酵母),劇烈破碎法,超聲破碎

4、(細(xì)胞懸浮液) 需以冰冷卻避免過熱 弗式細(xì)胞壓碎器(French pressure cell，帶壁微生物 細(xì)胞在剪切力作用下破碎 研磨(固體組織，微生物) 液氮中將固體組織磨成細(xì)粉末 樣品研磨器(用于少量樣品的處理) 用于精確樣品 珠磨法(胞懸液，微生物) 通過磨珠研磨破壞細(xì)胞壁,作用 去除雜質(zhì) 濃縮樣品 抑制蛋白酶活性 關(guān)鍵-可溶性 獲得可以重新溶解的蛋白 常用方法 硫酸銨沉淀 TCA沉淀 丙酮沉淀 TCA/丙酮沉淀 醋酸銨/甲醇/苯酚抽提,樣品的沉淀,對(duì)于疏水性特別強(qiáng)的蛋白如膜蛋白 硫脲 SDS 新型兩性表面活性劑(如磺基甜菜堿),樣品中雜質(zhì)的去除,去除原則 盡量不丟失蛋白 減少蛋白的修飾

5、 雜質(zhì)的主要種類 DNA/RNA 脂質(zhì) 多糖鹽 離子去污劑 其他固體雜質(zhì),DNA/RNA的去除,樣品中含核酸的不利影響 能被銀染色法染色 在凝膠酸性部分產(chǎn)生水平條紋 當(dāng)樣品到達(dá)IEF凝膠酸性端時(shí)，與蛋白質(zhì)一同沉淀 去除方法 蛋白沉淀法 DNase/RNase處理 超聲(機(jī)械破壞)、超高速離心 DNA/RNA抽提(苯酚/氯仿),其他雜質(zhì)的去除,脂質(zhì) 使蛋白質(zhì)不易溶解且會(huì)影響其分子量及pI 丙酮沉淀 多糖 阻塞膠體，影響蛋白質(zhì)沉淀、聚焦 TCA、硫酸銨或醋酸銨/甲苯/苯酚沉淀；超速離心和高pH 鹽 使膠條導(dǎo)電能力增強(qiáng)，共聚焦不易發(fā)生 透析；膠體過濾；沉淀或重新懸浮 離子去污劑 如SDS，使蛋白質(zhì)帶

6、負(fù)電不能聚焦 丙酮沉淀；將含SDS的蛋白溶于含兩性或非離子去污劑如CHAPS，Triton X-100，NP-40等的緩沖液中并使SDS終濃度0.25% 固體雜質(zhì) 阻塞膠體，影響蛋白質(zhì)沉淀、聚焦 過濾,樣品的溶解,2-DE成功分離蛋白質(zhì)的最關(guān)鍵因素之一 溶解的目標(biāo) 樣品中非共價(jià)結(jié)合的蛋白質(zhì)復(fù)合物和聚積體完全破壞，從而形成各個(gè)多肽的溶解液（否則樣品中結(jié)合牢固的蛋白復(fù)合物可能使2-DE中出現(xiàn)新的蛋白點(diǎn)，相應(yīng)的表示單個(gè)多肽的點(diǎn)的強(qiáng)度會(huì)下降） 溶解方法必須允許可能干擾2-DE分離的鹽、脂類、多糖和核酸等物質(zhì)的去除 溶解方法要保證樣品在電泳過程中保持溶解狀態(tài),增加樣品溶解性的手段,變性劑 改變氫鍵結(jié)構(gòu)，

7、使蛋白疏水中心暴露伸展 尿素、硫尿 表面活性劑 溶解疏水基團(tuán) 離子去污劑SDS、非離子去污劑Triton X-100和NP-40、兩性離子去污劑CHAPS等 還原劑 使變性蛋白進(jìn)一步伸展溶解 含自由巰基的DTT或-巰基乙醇，不帶電荷的磷酸三丁酯(TPB) 起載體作用的兩性電解質(zhì) 到達(dá)平衡位置形成pH梯度，“運(yùn)載”電流、pH 捕獲樣品中少量鹽分 濃度應(yīng)小于0.2（w/v，濃度過高會(huì)使IEF的速度降低),樣品液的準(zhǔn)備,標(biāo)準(zhǔn)液：,IPG 用兩親性電解液的組成,樣品制備注意事項(xiàng),蛋白質(zhì)水解 低溫 Tris堿，碳酸鈉或堿性載體兩性電解質(zhì) 蛋白抑制劑 特殊樣品的制備 低豐度蛋白的分離 預(yù)分級(jí) 窄pH膠(2

8、個(gè)pH單位) 強(qiáng)堿性蛋白(如核糖體)的處理 預(yù)處理富集 特殊pH梯度的IPG膠條（如pH312、4-12或10-12）進(jìn)行等電聚焦 極端分子量蛋白的處理 小于8kD 對(duì)流混合，產(chǎn)生絨毛狀或模糊的帶 大于200kD的蛋白，變性為多肽,梯度器,塑料支持膜,固定pH梯度(Immobilized pH Gradient, IPG)膠條的制備,A,C,B,F,E,D,pH 3 pH 10,固定pH 梯度(IPG)示意圖,聚丙烯酰胺凝膠,COO-,丙烯酰胺單體,R,寬pH梯度及窄pH梯度,寬pH梯度用于： 全部蛋白(確定感興趣蛋白的大致位置) 窄pH梯度用于： 提高分辨率 增加載樣能力以檢測(cè)、分析更多蛋白

9、,IPG 膠的重泡漲及上樣,2-DE 樣品,重泡漲溶液,重泡漲溶液： 8M 尿素 2% NP-40 或 CHAPS 2% IPG緩沖液 (兩親性電解液) 0.28% DTT 微量 溴酚藍(lán),IPG 膠條支架,IPG 膠條 定位,泡漲目的：使樣品能完全以可溶形式進(jìn)入IPG膠條內(nèi),蛋白載樣量,IPG膠條對(duì)蛋白載樣量的影響因素： 待分析的蛋白點(diǎn)的量應(yīng)滿足隨后的質(zhì)譜分析待研究蛋白的豐度 樣品的復(fù)雜度 復(fù)雜度較高的樣品，為了盡可能的了解所包含的每種蛋白，需要反復(fù)實(shí)驗(yàn)才能完成。如果將待檢樣品被富集以后則更易分析。 IPG膠條的pH范圍 預(yù)試驗(yàn)確定 先寬后窄 先線性后非線性 先短后長(zhǎng),第一向：等點(diǎn)聚焦,1.

10、放置電極墊 (?) 2. 200 V 維持 1.5h 3. 500 V 維持 1.5h 4. 1000 V 梯度上升 1500vh 5. 8000 V 梯度上升 (?) 36000vh,電極墊,IPG 膠條的平衡,平衡液 6 M 尿素和30% 甘油 減少電內(nèi)滲 第一步平衡 加DTT 使變性的非烷基化蛋白處于還原狀態(tài) 第二步平衡 加碘乙酰胺 使蛋白質(zhì)巰烷基化，防止其在電泳過程中重新氧化,使被分離的蛋白質(zhì)與SDS完整結(jié)合,第二向: SDS-PAGE SDS 平衡 SDS-PAGE,SDS 平衡液 50 mM Tris-HCl 6 M 尿素 30% 丙三醇 2% SDS 微量 溴酚藍(lán),SDS-PAG

11、E,向電泳緩沖液中加 0.5%的瓊脂糖,標(biāo)記紙片,IPG 膠條,膠體考馬斯亮藍(lán)染色 靈敏度為30100ng，線性范圍是20倍 可實(shí)現(xiàn)PAGE的無背景染色 會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行修飾而影響質(zhì)譜分析的結(jié)果 胺基黑染色 轉(zhuǎn)印至聚偏二氟乙烯（PVDF）上的蛋白質(zhì)的染色 轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上的蛋白質(zhì)的染色 銀染 可減少膠內(nèi)蛋白質(zhì)產(chǎn)量 對(duì)某些種類的蛋白質(zhì)染色效果差 對(duì)其后的蛋白質(zhì)測(cè)序和質(zhì)譜分析造成影響,染色方法,銀染色,50% 甲醇 25% 乙酸 4h,ddH2O 洗3次 30min/次,0.004% DTT 溶液 30min,0.1% AgNO3 30min,ddH2O 30 sec,3% Na2CO3 0.0

12、185% 甲醛,2.3M 檸檬酸,5% 乙酸 25% 甲醇,負(fù)染 主要包括金屬鹽染料、鋅咪唑染料等的使用 能專門提高PAGE膠上蛋白質(zhì)的回收率 速度快（515min）且能保持蛋白質(zhì)的生物活性 不能用于膜上染色 適用于蛋白質(zhì)顯色、完整蛋白質(zhì)的膠上被動(dòng)提取以及質(zhì)譜分析 膠體擴(kuò)散染料 主要包括印度墨水染料、膠體金屬染料等 高靈敏度檢出電轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素和PVDF膜上的蛋白質(zhì) 靈敏度與PAGE膠內(nèi)的銀染類似 不用于膠內(nèi)染色,染色方法,有機(jī)熒光團(tuán)染料 包括共價(jià)結(jié)合和非共價(jià)結(jié)合的熒光團(tuán)染料兩類，后者最為常用，其典型代表是已經(jīng)商品化的SYPRO Red、 Orange、 Ruby等熒光染料 可對(duì)SDS-PA

13、GE膠內(nèi)蛋白質(zhì)進(jìn)行一步染色，約3060min完成 靈敏度為210ng其線性范圍為3個(gè)數(shù)量級(jí) 在Tris/甘氨酸轉(zhuǎn)印緩沖液中染色后，蛋白質(zhì)可被轉(zhuǎn)印至膜上并進(jìn)行免疫染色或Edman測(cè)序來鑒定蛋白質(zhì) 金屬螯合染料 與現(xiàn)代蛋白質(zhì)組學(xué)研究相兼容的 專門與常用微量化學(xué)表征過程兼容 不包含戊二醛、甲醛或Tween-20等，很容易和集成化蛋白質(zhì)組學(xué)平臺(tái)（包括自動(dòng)化凝膠染色儀、圖像分析工作站、機(jī)器人剪切儀器、蛋白質(zhì)酶解工作站和質(zhì)譜儀等）相結(jié)合,染色方法,凝膠的圖像處理分析,典型流程 凝膠圖像的掃描 圖像加工 斑點(diǎn)檢測(cè)和定量 凝膠配比 數(shù)據(jù)分析 數(shù)據(jù)呈遞和解釋 2-DE數(shù)據(jù)庫的建立,2-DE 分離的可溶性 E.

14、coli 蛋白,目前雙向電泳需解決的問題,樣品的制備及溶解 不溶性蛋白(膜蛋白及核內(nèi)蛋白) 難分離蛋白(如毛發(fā)及皮膚中的蛋白) 載樣量的提高 初步分離 低豐度蛋白、堿性蛋白及大分子量蛋白 定量分析 靈敏度及可重復(fù)性,對(duì)于雙向電泳的建議,首先采用寬pH范圍的膠條，確定蛋白的分布范圍，通常采用pH3-10的膠條 如果pH線性分布的膠條分離效果不好，可采用非線性膠條 加大蛋白上樣量，提高局部蛋白的分辨率 采用窄pH范圍的膠條，提高某pH范圍蛋白的分辨率 第二向采用梯度膠進(jìn)行分離 去除高豐度蛋白，進(jìn)行蛋白的分級(jí)處理，富集低豐度蛋白,蛋白質(zhì)質(zhì)譜技術(shù),質(zhì)譜基礎(chǔ),樣品,離子源,質(zhì)量分析器,離子檢測(cè)器,固體

15、液體 蒸汽,形成離子 (帶電分子),電離,質(zhì)量分選(過濾),檢測(cè),根據(jù)m/z分選離子,數(shù)據(jù)處理,質(zhì)譜,檢測(cè)離子,基本步驟: 1. 樣品離子化 2. 根據(jù)質(zhì)量(m/z)不同分離離子 3. 檢測(cè)每種質(zhì)量離子的數(shù)目 4. 收集、處理數(shù)據(jù)得到質(zhì)譜圖,質(zhì)譜的評(píng)價(jià)指標(biāo),質(zhì)量范圍 速度 靈敏度 分辨率 精確度,+,+,+,自由漂移區(qū),檢測(cè)器,基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS),335 nm,ESI,四級(jí)桿質(zhì)量分析器,碰撞室,反射器,MCP 檢測(cè)器,碰撞氣體,串聯(lián)質(zhì)譜法 (MS/MS),ESI-Q-TOF 質(zhì)譜儀,步驟： 1質(zhì)量分析 2碰撞(離子裂解) 3質(zhì)量分析,TOF質(zhì)量分析器,

16、強(qiáng)的抗背景干擾能力 極高的檢測(cè)靈敏度和準(zhǔn)確度 可用來分析復(fù)雜混合物中的蛋白質(zhì) 豐富的檢測(cè)信息，高通量鑒別蛋白質(zhì),串聯(lián)質(zhì)譜的優(yōu)點(diǎn),1、鑒定和注釋蛋白質(zhì)的路線,通過肽質(zhì)譜指紋圖（peptide mass fingerprinting，PMF）和數(shù)據(jù)庫搜尋匹配 通過串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行單個(gè)或多個(gè)蛋白質(zhì)的鑒定 鳥槍法蛋白質(zhì)組學(xué),1234.5396 783.9147 375.2561,多肽 已測(cè)得質(zhì) 譜數(shù)據(jù)或理論 質(zhì)譜 數(shù)據(jù),MALDI-TOF檢測(cè)的多肽指紋,胰酶消化,凝膠,蛋白質(zhì),數(shù)據(jù)庫,?,1,2,3,比較:,? 是否相同 ?,質(zhì)譜,3235.2256,肽質(zhì)譜指紋圖在數(shù)據(jù)庫中匹配不成功的可能原因,樣品量太少

17、，PMF圖信噪比太低，輸入庫中搜尋的數(shù)據(jù)質(zhì)量不好。 2-DE膠上所取的一個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)并非單一蛋白質(zhì)，所獲PMF圖實(shí)際上是兩個(gè)以上蛋白質(zhì)的混合圖。,操作中角蛋白或其他蛋白質(zhì)的污染 蛋白質(zhì)發(fā)生了較多的轉(zhuǎn)譯后修飾，數(shù)據(jù)庫中未有記載 所用胰蛋白酶質(zhì)量不夠好，蛋白酶自酶解片段多 未知的新蛋白質(zhì) 數(shù)據(jù)庫規(guī)模太小,續(xù)：,氨基酸序列 VLDPNTVFAL,蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫 ？查詢,串聯(lián)質(zhì)譜圖,從頭測(cè)序,輸入,輸出,序列片段 PNT,串聯(lián)質(zhì)譜鑒定多肽的計(jì)量方法,組織切片或印片原位質(zhì)譜分析技術(shù) 兩級(jí)飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜（MALDI-TOF/TOF） 傅里葉轉(zhuǎn)換回旋共振質(zhì)譜（FTMS） 表面增強(qiáng)激光解吸/電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（S

18、ELDI-TOF-MS）,聯(lián)合技術(shù)精確鑒定蛋白質(zhì),2、基于生物質(zhì)譜的定量蛋白質(zhì)組研究策略,原理：對(duì)于具有相同離子化能力的蛋白質(zhì)或多肽，可以通過比較質(zhì)譜峰的強(qiáng)度（或峰面積）得到待比較蛋白質(zhì)的相對(duì)量。,3、基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)相互作用研究方法,靶蛋白制備 蛋白質(zhì)復(fù)合體的純化 蛋白質(zhì)復(fù)合體的質(zhì)譜鑒定,基本步驟：,(1)親和層析耦聯(lián)質(zhì)譜技術(shù),基本原理：將某種蛋白質(zhì)以共價(jià)鍵固定在基質(zhì)（如瓊脂糖）上，含有與之相互作用的蛋白質(zhì)的細(xì)胞裂解液過柱，先用低鹽溶液洗脫下未結(jié)合的蛋白質(zhì)，然后用高鹽溶液或SDS溶液洗脫結(jié)合在柱子上的蛋白質(zhì)，最后用多維液相色譜耦聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)（MDLC-ESI-MS/MS）鑒定靶蛋白的結(jié)合蛋白。

19、,先決條件,得到足夠多的保持生物活性的重組靶蛋白作為誘餌（bait） 獲得足夠量、純度高的與誘餌相互作用的蛋白質(zhì),利用含靶蛋白的融合蛋白獲得相互作用蛋白質(zhì),谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶（glutathione S-transferase，GST）融合蛋白 蛋白A融合蛋白,主要優(yōu)點(diǎn),靈敏度高：高濃度靶蛋白 候選蛋白質(zhì)與靶蛋白的結(jié)合機(jī)會(huì)均等 檢測(cè)多亞基蛋白質(zhì)之間的相互作用,(2) 免疫共沉淀耦聯(lián)質(zhì)譜技術(shù),原理：以細(xì)胞內(nèi)源性靶蛋白為誘餌，用抗靶蛋白抗體與細(xì)胞總蛋白進(jìn)行免疫共沉淀（immuno-precipitation，IP）純化靶蛋白免疫復(fù)合物，凝膠電泳分離后，質(zhì)譜鑒定靶蛋白的結(jié)合蛋白。,研究鼻咽癌細(xì)胞系中的p53相互作用蛋白,抗p53抗體與HNE1和HNE2總蛋白進(jìn)行免疫共沉淀 SDS-PAGE分離免疫沉淀