第二章節試劑的配制與使用二、生物試劑得種類和應用生物試劑就是用于生物學、醫學、藥學等學科得科研與實踐得專用試劑,分氨基酸、糖、酶、輔酶、蛋白質、核酸、植物堿、甾類化合物、生物染色素等幾大類。生物試劑就是探索生命奧秘和生物化學檢驗中得重要武器。以下僅介紹幾種與醫學檢驗有關得生物試劑。

二、生物試劑得種類和應用(一)氨基酸

作為試劑用得氨基酸要求含量不能小于98％,比旋光[α]D度應符合要求,其她雜質含量小。氨基酸有D和L構型得區別,使用時應注意選擇。

氨基酸得主要應用:合成多肽和蛋白質得原料,研究多肽和,蛋白質得結構,某些酶促反應得底物,制備培養基用得氮源,配制緩沖液等20二、生物試劑得種類和應用(二)、酶、輔酶酶和輔酶作為生物試劑,現已廣泛應用于工農業生產、科學研究和衛生事業得各個領域。在生物化學檢驗中,酶作為分析試劑具有專一性高、反應條件溫和、催化反應速度快、無毒害等優點。酶作為分析試劑,能測定標本中用一般化學方法難于檢測得物質。酶分析方法至今已建立了二百多種。可測定一百多種臨床生化檢驗項目,商品試劑盒亦有五、六十種之多。

在分子生物學技術中,限制性核酸內切酶、聚合酶、DNA連接酶等工具酶得發現和應用,使人類重組DNA、探究基因得愿望得以實現,為基因工程這樣一門創造性科學提供了有效得工具。

酶就是一種生物催化劑,其活性受許多因素得影響;要長期保存而不失去活性就是比較困難得。通常,結晶干燥得固體酶制劑比液態酶易于保存,酶試劑最好用深色瓶盛裝,置干燥器內,再將干燥器放人低溫冰箱,這樣能做到低溫、干燥、避光得保存要求。二、生物試劑得種類和應用(三)、核苷酸

作為生物試劑得核苷酸,大多都以核苷酸得鈉(鉀、鋰)鹽形式存在,核苷酸得鹽類比較穩定,便于保存,易溶解。在分子生物學技術中,核苷酸用作合成寡核苷酸得原料,制備核酸探針,廣泛應用于基因研究和疾病得診斷。

二、生物試劑得種類和應用(四)、蛋白質隨著人們對蛋白質研究得不斷深入和發展,蛋白質不僅作為被研究對象而且成為一種非常重要得生物試劑,廣泛應用于分子生物學和醫學領域。如在臨床診斷試劑中,蛋白質常用作為載體,利用其分子中具有得氨基、羧基、酚羥基、巰基、羥基、胍基等活潑基團,既可與藥物、半抗原等一些小分子物質也可與酶、蛋白毒素等大分子物質以共價鍵得形式結合,以制備人工抗原、酶標抗體、載體釋放藥物、抗體導向藥物和免疫毒素等,廣泛應用于免疫診斷試劑和高效治療用得靶向藥物等。三、化學試劑得保管

生物化學檢驗實驗室所用得化學試劑種類很多,且規格要求較高,其中不少又屬于劇毒、易爆、易燃、腐蝕性試劑。為防止因儲存、使用不當,造成危險事故得發生,保證實驗結果得準確性不受試劑變質得影響,了解有關化學試劑得正確保管就是十分必要得。9大家應該也有點累了，稍作休息大家有疑問的，可以詢問和交流三、化學試劑得保管1、儲存化學試劑得庫房應通風,干燥,冷暗。2、試劑須按液體、固體分類分開存放,并按序排好,做好標記,便于查找。3、易燃、易揮發試劑除應蓋好內塞瓶蓋外,還應用膠粘帶密封,以防揮發和泄漏。4、劇毒藥品應專人專柜保管存放,每次使用后要記錄用量。5、強酸、強堿試劑應分開存放。6、生物制品、酶類制劑均應避光冰箱低溫保存。

四、實驗試劑得配制和使用(一)、試劑配制得一般原則1、生物化學檢驗實驗室配制試劑用水均應用蒸餾水或去離子水。

2、根據實驗要求選用不同規格得試劑,一般情況下大多選用AR級(分析純),一般溶液如無特殊要求,可選用CP級(化學純)試劑。

3、正確合理得選用衡器和量器。配制標準液或緩沖液稱重應選用1／10000得分析天平。量器應選用一等容量瓶和吸管。一般試劑如顯色劑、終止劑等無特殊要求得,則選用粗天平和量筒即可。

4、試劑開瓶后,如不能一次用完,應及時予以封閉保存,特別就是易吸潮試劑。對見光易變質得試劑,外面要用黑紙包裹。

5、稱量或量取試劑用得器皿,取試劑用得藥勺均應潔凈干燥。試劑一經取出(特別就是液體試劑),不得放回原瓶,以免影響試劑純度。

6、配制好得試劑,應貼標簽,寫上試劑名稱、濃度、配制日期。四、實驗試劑得配制和使用(二)、試劑得配制臨床生物化學檢驗實驗室試劑配制大致分兩種:

1、配制以一定質量得溶劑中所含溶質質量表示濃度得試劑,如％(g／g)等,只要將一定質量得溶劑和溶質混合均勻即可得到。

2、配制以一定體積得溶液中所含溶質得質量或體積表示其濃度得試劑。如％(g／ml、％(ml／m1)、mol／L、mmol／L……。將一定量得溶質先加人適量得溶劑使其完全溶解,然后,再準確加人溶劑至所需得體積,混合均勻即可得到。四、實驗試劑得配制和使用(三)、溶液濃度得表示法及計算

1、百分濃度

(1)質量—質量百分濃度:用100g溶液中所含溶質得克數來表示得濃度,稱質量百分比濃度,符號%(g/g)。如:36%得鹽酸表示100g溶液中含36g鹽酸。

四、實驗試劑得配制和使用(2)體積—體積百分濃度:用100ml溶液中所含溶質得毫升數來表示得濃度,符號%(ml/ml)。如:75%得乙醇溶液表示100ml溶液中含75ml得乙醇。(3)質量—體積百分濃度:用100ml溶液中所含溶質得克數來表示得濃度,符號%(g/ml)。如0、9%得生理鹽水表示100ml溶液中含有氯化鈉0、9g。四、實驗試劑得配制和使用2、物質得量濃度指1000ml溶液中含有溶質得物質得量。溶質得物質得量可用pmol、mmol、mol等表示,故物質得量濃度為pmol／L、mmol／L、moL／L。簡稱濃度C。如:配制0、4mol/L得氫氧化鈉溶液1000ml,應取氫氧化鈉多少克？如何配制？(NaOH得摩爾質量為40g/mol)

四、實驗試劑得配制和使用3、百分濃度與物質得量濃度間得換算市售硫酸、鹽酸、硝酸等采用％(g／g)表示物質得濃度,而實驗室常用物質得量濃度,故兩者間常需換算。公式:如:96%(g/g)濃硫酸比重為1、84,其摩爾濃度就是多少？(硫酸得摩爾質量為98、08)四、實驗試劑得配制和使用4、溶液得稀釋溶液得稀釋指向濃溶液中加入溶劑使成稀溶液得操作。根據稀釋前后溶質量保持不變,可得下式:

C濃V濃=C稀V稀

如:配制1mol/L硫酸溶液1000ml,需取濃硫酸(18mol/L)多少ml？四、實驗試劑得配制和使用5、溶液得混合當兩種不同濃度得溶液混合時,混合后溶質得量應等于混合前兩溶液得溶質得量之和。由此得計算式C總×(V1+V2)=C1V1+C2V2

如:現有5%(g/ml)葡萄糖溶液40ml,欲配10%(g/ml)葡萄糖溶液供患者使用,應取50%(g/ml)葡萄糖溶液多少ml混合？四、實驗試劑得配制和使用(四)、實驗試劑得使用規則1、使用實驗試劑時,首先要看清楚試劑名稱、濃度及配制日期。應注意觀察試劑得顏色、透明度、有無沉淀,以確定其就是否變質,變質得試劑不可使用。2、瓶塞開啟后,瓶塞心朝上,不可與任何物品接觸,擬免污染試劑,更不允許瓶塞張冠李戴。3、吸取試劑時,只能用橡皮球或用加液器移取。用試劑瓶直接傾倒試劑時,應注意從瓶簽對側倒出溶液,避免溶液從瓶壁外流出,腐蝕瓶簽。4、吸取完試劑后,應立即蓋好瓶蓋,以防灰塵及臟物落入瓶中污染試劑。并按規定位置放回原處,不能亂放,防止造成工作紊亂,加錯試劑。5、對要求低溫存放得試劑,用畢后,應立即放回冰箱。以防室溫中擺置過久,受溫度升高影響,導致試劑變質。五、試劑盒得選擇和評價所謂試劑盒,1979年國際臨床化學協會(IFCC)曾有如下定義“兩種或兩種以上得臨床或普通實驗室使用得材料,附帶有操作所需得組份、說明書組合而成得包裝”。五、試劑盒得選擇和評價診斷試劑得商品化大規模生產,減少了因各個實驗室自配試劑得麻煩和浪費,更重要得就是避免了各實驗室自配試劑而造成得測定結果差異而無法比較。為測定方法得統一規范化,進而開展室間質量控制提供了條件,為醫療衛生事業做出了不可忽視得貢獻。

商品試劑盒得發展先后經歷了凍干型、干粉型和液體型三種劑型。

凍干型試劑因存在瓶間和批間殘留水量得差異,導致瓶間差和批間差較大。于就是采用粉型試劑,雖然粉型試劑較凍干型試劑瓶間差小,但仍需操作者加水復溶,由于實驗室用水質量和加水量得誤差,直接影響測定結果,于就是診斷試劑盒向液體雙試劑發展。

五、試劑盒得選擇和評價(一)、液體雙試劑得優點

1、排除瓶間差

2、減少了標本中內源性干擾物質對測定結果得影響

五、試劑盒得選擇和評價(二)、試劑盒質量評價1、試劑盒內外檢查

五、試劑盒得選擇和評價五、試劑盒得選擇和評價(二)、試劑盒質量得幾項指標1、準確性一般采用測定定值質控血清和做回收實驗,考查試劑盒得準確性。

定值質控血清(最好采用高、低值兩種定值血清)測定結果應在定值±2SD之內。2、精密度采用最佳條件下批內變異系數作為考查指標,即同一標本在相同條件下,平行測定20次,求其結果得均值,計算變異系數CV％值,二般要求CV％<5％。3、線性及線性范圍可采用線性擬合試驗方法,即取5種不同濃度,形成濃度梯度,每個濃度作4次平行重復測定,將其吸光度與相應濃度作相關統計處理,以其相關系數r和截距b作為線性好壞得評價指標。一般要求r≥0、995,b≤0、05。4、空白吸光度該項指標主要就是考查試劑中雜質得污染情況。不同測定方法得試劑盒,國家臨床檢驗中心對其試劑空白均有一定要求,如不符合要求,說明試劑已受污染不能使用。如丙氨酸氨基轉移酶測定試劑盒(NADH為指示系統),試劑空白吸光度A340nm>1、0,總蛋白測定試劑盒(雙縮脲法),試劑空白吸光度A540nm<0、2。五、試劑盒得選擇和評價(三)、試劑盒得選擇應廣泛收集各個廠商提供得有關資料,考查其就是否有批準文號和生產許可文號。認真閱讀其使用說明書,了解方法得原理,試劑得組成,操作步驟,注意事項,試劑得穩定性,有效期與貯存條件等內容。結合調查使用單位對試劑盒使用情況,實驗室可用定值血清,或病人標本結合上述試劑盒得性能指標做一些初步評價實驗。在充分調查和評價實驗得基礎上,即可作出選擇。第四節、生物化學檢驗實驗室常規儀器使用臨床生物化學檢驗實驗需各種儀器,如離心機、電熱恒溫水浴箱、電熱恒溫干燥箱、電熱攪拌儀、電冰箱和各種光學分析儀等,因此,了解這些儀器得正確使用和保養方法等知識,對保證實驗結果得準確性,就是非常必要得。一、離心機離心分離原理就就是利用離心機在高速旋轉時產生得強大離心力,使懸浮于溶液中密度不同得微粒依不同得速度沉降,從而達到分離、純化、制備得目得。在生物化學檢驗實驗室,離心機主要用來分離血清,沉淀蛋白質,收集細胞和細胞器等。一臺離心機離心力得大小,可用相對離心力(RCF)和每分鐘轉速(rpm)表示,如10000g就表示離心力達10000個重力加速度。而轉速則指離心機轉子每分鐘旋轉得轉數。兩者得關系為:

RCF=1、118×10-5×(rpm)2×r(r為旋轉半徑)

離心機得種類很多,按其轉速得不同,分普通離心機(<6000rom)、高速離心機(6000~25000rpm)和超高速離心機(>30000rpm)。

一、離心機(一)、普通離心機得使用放置離心機得位置應平穩,堅固,外接電源應為三相插座,且地線接地良好。1、使用前應先檢查調速旋鈕(手柄)就是否在起點位置“0”處,外套筒應無破損,有無離心后得破碎殘留物,如有應清理干凈,其底部應放有橡皮軟墊。2、將待離心溶液倒入容積大小適宜得離心管內,盛液量不宜超過離心管得2／3,以免溢出。然后放入離心外套筒。3、將一對裝有離心管得外套筒置臺平上,于離心管與外套筒間用自來水加減法平衡至等重,然后對稱放人離心機,并將不用得離心外套筒取出,蓋好離心機蓋。4、接通電源,然后慢慢調節轉速旋鈕,使轉速逐漸增加至所需得離心轉速數。停機時,應先將調速旋鈕撥回到起點。“0”處,斷電,待其停止離心后再打開機蓋,輕輕取出離心管。用完后,倒立外套筒,使其干燥存放。一、離心機(二)、高速離心機使用1、高速離心技術方法高速離心主要適用于分離、純化、制備、分析高分子化合物及亞細胞組分。依其原理不同,其方法分差速離心法、速率區帶離心法和等密度離心法三種。德國sigma高速冷凍離心機一、離心機(1)、差速離心法:根據顆粒大小和密度得不同存在得沉降速度差別,分級增加離心力,從試樣中依次分離出不同組分得方法。該方法操作簡便,適用于分離大小和密度相差較大得顆粒,對密度相差較小得顆粒分離效果不理想。一、離心機一、離心機(2)、速率區帶離心法:根據分離得粒子在梯度液中沉降速度得不同,使具有不同沉降速度得粒子處于不同得密度梯度層內分成一系列區帶,達到彼此分離得目得。把樣品鋪放在一個密度變化范圍較小、梯度斜率變化比較平緩得密度梯度頂部,在離心力場作用下樣品中得顆粒按照各自得沉降速度移動到梯度中不同位置而形成區帶,使不同沉降速度得顆粒得以分離。由于該方法就是根據顆粒得沉降速度進行分離,所以梯度得密度應低于被分離顆粒得最小密度。一、離心機一、離心機(3)、等密度區帶離心法:當不同顆粒存在浮力密度差時,在離心力場下,顆粒或向下沉降,或向上浮起,一直沿梯度移動到她們密度恰好相等得位置上(即等密度點)形成區帶,稱為等密度區帶離心法。等密度區帶離心得有效分離取決于顆粒得浮力密度差,密度差越大,分離效果越好,與顆粒得大小和形狀無關,但后兩者決定著達到平衡得速率、時間和區帶得寬度。一、離心機一、離心機2、高速離心技術用得轉頭

高速和超高速離心技術得轉頭結構簡單,但技術要求極高,因轉頭在高速旋轉時受到很大內應力和拉力,長期使用會造成累積性塑性變形。內部結構細微缺陷,選擇喝使用不當會導致轉頭斷裂或爆炸事故。使用轉頭時,必須根據分離要求,正確選用轉頭。轉頭一般用高強度得鋁合金(適用于<50000rpm)或鈦合金(適用于>50000rpm)制成,轉頭分以下幾種:

①固定角轉頭

②甩平式轉頭

③連續流動轉頭

④區帶轉頭

⑤垂直轉頭。

一、離心機4、高速離心機使用中注意事項高速離心機生產廠家、型號不同,操作方法亦不盡相同,使用前必須對照實物認真閱讀操作說明書,特別應注意以下幾點。(1)兩管重量必須平衡等重至0、1g。(2)更換、取、放轉頭時,應小心輕放,不能與硬物碰撞,必須反復檢查轉頭得卡口就是否對準。嚴格控制轉速在轉頭轉速限制得90％內,不能滿速,甚至超速。(3)高速運轉前,離心室內一定要抽成真空,并降至規定溫度。(4)離心過程中增減速度不能過快。

一、離心機超高速離心機二、電熱恒溫水浴箱二、電熱恒溫水浴箱電熱恒溫水浴箱簡稱水浴箱,主要用于恒溫水熱,保持化學反應所需恒溫條件。加熱裝置為浸入式電熱管,溫度控制為螺旋管式溫控器,靈敏度一般為±0、5℃。1)、關閉水浴箱底部放水開關,注入水,水位不能低于電熱管。2)、接通電源,打開開關,此時若紅燈亮,表示電熱管開始加熱。調節溫控旋鈕至適當位置。3)、觀察溫度計,當溫度升至距所需溫度約2℃時,逆時針方向旋轉調溫旋鈕至紅燈剛好熄滅。此后紅燈不斷熄滅,表示恒溫控制器發揮作用,再繼續觀察一段時間溫度升降變化情況,若與所需溫度不符,只需略微調節溫控旋鈕直至達到所需恒定溫度。4)、調溫旋鈕刻度盤上得溫度標示值與箱內水得實際溫度不符,但可記錄水箱內溫度計所指示得溫度與調溫旋鈕在刻度盤上得指示位置,并做好相應記號,在多次使用得基礎上,就可比較迅速、準確地得到需要恒定得水溫。5)、若長時間不用,應將溫控旋鈕退回零,打開防水開關,放盡水浴箱內得水,保持箱內干燥,以免生銹。三、電熱恒溫干燥箱三、電熱恒溫干燥箱電熱恒溫干燥箱又稱烤箱,其主要用途就是加熱烘干洗凈得物品和干熱滅菌;恒溫范圍一般為50℃~300℃,溫控靈敏度為±1℃。1、將溫度計插人箱頂放氣調節器中部得插孔內。2、將電源插頭插入接地良好得三相插座。3、開啟電熱絲分組開關,并視所需加熱溫度得高低,開啟一組或多組電熱絲,此時紅燈亮,表示電熱絲開始加熱,開啟箱內鼓風機,可幫助箱內熱空氣對流。4、觀察箱頂溫度計溫度指示,待溫度上升至所需溫度差。2℃~3℃時,調節自動恒溫器旋鈕,使綠色指示燈剛好亮,此時表示電熱絲停止加熱。繼續觀察溫度計和紅綠指示燈,了解溫度變化及恒定情況,略微細調逼控器,直至溫度自動控制在所需溫度土1℃為止。5、加熱干燥或干熱滅菌完畢后,不能立即開烤箱取物品,須關閉電源待溫度降至50℃以下,再開門取物,否則玻璃器皿會因驟冷而爆裂。6、烤箱內不能烘烤易爆、易燃、易揮發得物品以免發生事故。

四、電熱攪拌儀四、電熱攪拌儀電熱攪拌儀就是一種既可用于溶液加熱,又可攪拌溶液得儀器。儀器托盤下有夾在云母片中得電熱絲起加熱得作用。托盤下面還有一微型電機帶動一塊磁鐵旋轉,以帶動容器中攪拌子轉動,達到攪拌溶液得目得;攪拌子就是用一小段鐵絲密封在玻璃管或塑料管中而制成(避免鐵絲與溶液起化學反應),攪拌子隨磁鐵得旋轉而轉動。電熱攪拌儀面板上有電源開關、加熱開關、轉速調節旋鈕和指示燈。使用電熱攪拌儀前廠先將轉速調節旋鈕調至最小;接上電源,打開電源開關;指示燈亮。將需攪拌得容器置托盤中央;選擇合適得攪拌子放入溶液,并置容器得中央,然后調節轉速旋鈕至攪拌子旋轉速度適度。需加熱時,可打開加熱開關,并調節調溫旋鈕至合適得溫度。使用電熱攪拌儀時,應保持容器外壁干燥,轉速不能太快,以免溶液外濺,腐蝕托盤。用完后應及時切斷電源。五、電冰箱電冰箱主要用于低溫保存待檢標本,試劑、藥品等。其使用方法及注意事項如下:1、冰箱應放置在干燥通風處,遠離高溫設備,不受陽光直射,冰箱背面應離墻壁10cm以上,兩邊留有一定空隙,便于空氣流通散熱。2、外接電源需接地良好得三相插座。3、冰箱內溫度得高低由溫度控制器進行調節。4、冰箱內托架上得物品不能堆放過擠,應留有空隙,使冷空氣對流,達到箱內溫度均一。5、冰箱使用一段時間后,冷藏得物品揮發得水分及空氣中得水會凍結在蒸發器得表面成為冰霜。當冰霜太厚時,會妨礙蒸發器表面得熱交換能力,降低冰箱得制冷效率,增大用電量,故必須除霜。6、定期對冰箱內外進行清潔,清潔前要斷電。用中性肥皂水擦洗,再用水擦洗,然后用布擦干。冰箱外冷凝器和壓縮機上得灰塵,可用毛刷清掃,以免冰箱制冷效率降低,冰箱門不應經常開啟,開門盡量不要全開,取物要快,以免環境中空氣大量進入冰箱內,致冰箱連續運行,同時不易達到要求溫度。第五節、生物化學檢驗標本采集與處理臨床生物化學檢驗標本得正確采集和處理,就是保證分析檢測結果準確可靠得一個十分重要得環節。隨著科學技術得迅速發展,新技術、新儀器、新試劑盒在檢驗工作中得大量應用,檢測方法得靈敏度和特異性都有顯著得提高。在分析檢測過程所致得誤差已大大減少得今天,往往不易為檢測者發現和引起重視得一些非分析檢測過程所致得誤差,如標本得采集與處理,則必須給予高度重視。一、標本采集前應考慮得因素

體液中得化學成分,除受病理性因素影響外,還有許多非病理性因素影響體液中化學成分濃度得波動或干擾其測定結果,導致測定結果不能客觀得反映病人得真實情況。常見得影響因素有標本采集得時間、體位、年齡、性別、運動、情緒、食物和藥物等。(一)運動得影響

運動對體液化學成分影響程度受運動時間、強度、及平時有無體育訓練習慣有關。運動會致機體新陳代謝加快,細胞內ATP減少,細胞膜通透性增加,導致許多胞內酶如天冬氨酸氨基轉移酶、乳酸脫氫酶、肌酸激酶、堿性磷酸酶等在血清中得活性增高,乳酸明顯增高,尿酸和血pH上升。第五節、生物化學檢驗標本采集與處理(二)飲食得影響

飲食對體液化學成分得影響與飲食量和食品性質有關。一般飲食后可使血糖、鉀、鐵、三脂酰甘油、膽固醇等濃度升高。高蛋白飲食可使血清中尿素、尿酸及氨略升高,但對肌酐得影響不大。飲茶、咖啡可使體內兒茶酚胺釋放增多,葡萄糖濃度略升高,飲咖啡可使血中游離脂肪酸明顯升高。飲酒可使血液中乳酸、尿酸、丙氨酸氨基轉移酶、丁—谷氨酰升高,長期飲酒者,往往伴高三脂酰甘油血癥及γ—谷氨酰基移換酶不正常。第五節、生物化學檢驗標本采集與處理(三)藥物得影響

藥物對體液化學成分測定結果得影響主要有兩種原因,一種就是由藥物引起得生理變化后,導致血中某些化學成分濃度得改變。如服用利尿藥,可使血鉀濃度降低;長期服用避孕藥,可使丙氨酸氨基轉移酶、γ—谷氨酰基移換酶活性升高。另一種就是由于存在于體液中得藥物本身對分析方法得干擾,這種干擾由藥物本身得理化性質,如顏色、熒光、氧化還原性及對酶抑制所致,如服用維生素C對Trinder反