基因治療分類體細胞(somaticcell)基因治療生殖細胞(germline)基因治療只限于某一體細胞的基因的改變只限于某個體的當代對缺陷的生殖細胞進行矯正當代及子代第二十三章基因治療

基因治療：指將目的基因通過基因轉移技術（病毒載體介導或者非病毒載體介導的基因轉移技術）導入靶細胞內，目的基因表達產物對疾病起治療作用。

狹義基因治療：指目的基因導入靶細胞后與宿主細胞內的基因發生整合、成為宿主基因組的一部分，目的基因表達產物起治療疾病的作用。廣義基因治療：①外源正常基因導入病變細胞，產生正常基因的表達產物以補充缺失的或失去正常功能的蛋白質；②采用適當的技術抑制細胞內過度表達的基因；③將特定的基因導入非病變細胞，在體內表達特定產物；④向功能異常的細胞（腫瘤細胞）中導入該細胞中本來不存在的基因（如自殺基因），利用這些基因的表達產物達到治療疾病的目的。基因治療的概念

一、基因治療的基本策略

二、基因治療的基本程序

三、基因轉移的方法

四、基因干預的方法第一節基因治療的策略和基本程序

1、基因置換（genereplacement）

定義：指將特定的目的基因導入特定細胞，通過定位重組，導入的正常基因，以置換基因組內原有的缺陷基因。目的：將缺陷基因的異常序列進行橋正。對缺陷基因的缺陷部位進行精確的原位修復，不涉及基因組的任何改變。

一、基因治療的策略第一節基因治療的策略和基本程序

定向整合的條件:轉導基因的載體與基因組DNA具有相同的序列。帶有目的基因的載體就能找到同源重組的位點，進行部分基因序列的交換。基因同源重組技術又稱為基因打靶。細胞內基因同源重組的發生率很低。基因同源重組技術一、基因治療的策略第一節基因治療的策略和基本程序

1、基因置換（genereplacement）

定義:

通過導入外源基因使靶細胞表達其本身不表達的基因。類型:在有缺陷基因的細胞中導入相應的正常基因，而細胞內的缺陷基因并未除去，通過導入正常基因的表達產物，補償缺陷基因的功能；向靶細胞中導入靶細胞本來不表達的基因，利用其表達產物達到治療疾病的目的。一、基因治療的策略

2、基因增補（geneaugmentation）

第一節基因治療的策略和基本程序

定義：采用特定的方式抑制某個基因的表達，或者通過破壞某個基因的結構而使之不能表達，以達到治療疾病的目的。一、基因治療的策略

3、基因干預（geneinterference）

第一節基因治療的策略和基本程序

定義：將“自殺”基因導入宿主細胞中，這種基因編碼的酶能使無毒性的藥物前體轉化為細胞毒性代謝物，誘導靶細胞產生“自殺”效應，從而達到清除腫瘤細胞的目的。應用：是惡性腫瘤基因治療的主要方法之一。一、基因治療的策略

4、自殺基因治療（suicidegenetherapy）

第一節基因治療的策略和基本程序

自殺基因的作用機制

第一節基因治療的策略和基本程序

?TK/GCV

單純皰疹病毒（herpssimplexvirus,HSV）Ⅰ型胸苷激酶（thymidine

kinase,tk）基因編碼胸苷激酶，特異性地將無毒的核苷類似物丙氧鳥苷（ganciclovir,GCV）轉變成毒性GCV三磷酸核苷，后者能抑制DNA聚合酶活性，導致細胞死亡。（1）.自殺基因系統一、基因治療的策略

4、自殺基因治療（suicidegenetherapy）

第一節基因治療的策略和基本程序

定義:“自殺基因”導入后，不僅使轉導了“自殺基因”的腫瘤細胞在用藥后被殺死，而且與其相鄰的未轉導“自殺基因”的腫瘤細胞也被殺死。

一、基因治療的策略

4、自殺基因治療（suicidegenetherapy）

（2）.旁觀者效應（bystandereffect)第一節基因治療的策略和基本程序

5、基因免疫治療通過將抗癌免疫增強的細胞因子或MHC基因導入腫瘤組織，以增強腫瘤微環境中的抗癌免疫反應。一、基因治療的策略

4、自殺基因治療（suicidegenetherapy）

3、基因干預（geneinterference）

2、基因添加（geneaugmentation）

1、基因置換（genereplacement）

第一節基因治療的策略和基本程序

載體目的基因invivoexvivo靶細胞目錄第一節基因治療的策略和基本程序二、基因治療的基本程序靶細胞在體外培養及進行基因修飾后再回輸體內用于血液或免疫系統疾病如：骨髓細胞

體外方法第一節基因治療的策略和基本程序

治療靶細胞不宜體外獲得、培養治療基因直接注入患者體內需要有效的輸入基因的方法治療基因：裸基因或病毒運載基因體內方法第一節基因治療的策略和基本程序

三、基因轉移(genetransfer)技術

（一）.病毒介導的基因轉移（二）.非病毒介導的基因轉移一、基因治療的策略第一節基因治療的策略和基本程序

二、基因治療的基本程序（一）.病毒介導的基因轉移第一節基因治療的策略和基本程序

三、基因轉移(genetransfer)技術

1、反轉錄病毒載體

（一）.病毒介導的基因轉移三、基因轉移(genetransfer)技術

病毒感染宿主細胞釋放RNA

ds-DNA

dsDNA整合到宿主基因組上mRNA病毒基因組合成病毒蛋白包裝成新的病毒顆粒，出芽。RTaseHostRNApol.II轉錄（前病毒）（1）反轉錄病毒的生活周期

兩端各有一長末端重復序列LTR。

LTR由U3、R和U5三部分組成。病毒有三個結構基因5ˊ端LTR下游有一段病毒包裝所必需的序列（ψ）及剪接供體位點(SD)和剪接受體位點(SA)。

含有負鏈DNA轉錄的引物結合位點(PBS)和正鏈DNA轉錄的引物結合位點。在U3內有增強子和啟動子；

U3和U5兩端分別有病毒整合序列(IS)

；

在R內還有poly(A)加尾信號。

gag基因，編碼核心蛋白和屬特異性抗原；pol基因，編碼反轉錄酶；env基因，編碼病毒外殼或包膜糖蛋白(包括外膜糖蛋白和穿膜蛋白)。

（2）反轉錄病毒前病毒結構特點

LTRgagpolenvψLTR調節和啟動轉錄產生病毒核心蛋白產生逆轉錄酶產生病毒外膜蛋白包裝信號LTRgagpolenvψLTR包裝信號

目的基因neo標記基因構建重組逆轉錄病毒載體

其基因組為缺陷型，保留了病毒的包裝信號ψ，而缺失病毒的結構基因；不能自我包裝成有增殖能力的病毒顆粒。

（3）反轉錄病毒載體

ψLTRLTRAmporiEr目的基因Neor輔助細胞株(如PA317)：由缺陷型反轉錄病毒感染構建而成。能合成結構蛋白，但本身卻不能包裝成完整的病毒顆粒。

（4）反轉錄病毒介導的基因轉移系統

LTRgagpolenvLTRGag蛋白PoL蛋白Env蛋白Packingcell包裝細胞（4）反轉錄病毒介導的基因轉移系統

①高效地進入靶細胞。反轉錄病毒包膜上env編碼的糖蛋白，能夠被許多哺乳動物細胞膜上的特異性受體識別。②缺失結構基因。gag、env和pol的不影響其他部分的活性。③高效整合到基因中。有利于外源基因在靶細胞中的永久表達。④易于分離制備。包裝好的假病毒顆粒（攜帶目的基因的重組反轉錄病毒載體）以出芽的方式分泌至輔助細胞培養的上清液中。

（5）反轉錄病毒載體的特點①隨機整合，有插入突變、激活癌基因的潛在危險；②反轉錄病毒載體的容量較小，只能容納7kb以下的外源基因。（6）反轉錄病毒載體的缺點（5）反轉錄病毒載體的特點1、反轉錄病毒載體

2、腺病毒載體三、基因轉移(genetransfer)技術

1、反轉錄病毒載體（一）.病毒介導的基因轉移腺病毒是一種大分子(36kb)雙鏈無包膜DNA病毒。它通過受體介導的內吞作用進入細胞內，然后腺病毒基因組轉移至細胞核內，保持在染色體外，不整合進入宿主細胞基因組中。腺病毒是人類呼吸道感染的病原體，但目前尚未發現與腫瘤發生有關聯。宿主細胞范圍廣，可感染分裂和非分裂終末分化細胞，如神經元等。

2、腺病毒載體三、基因轉移(genetransfer)技術

1、反轉錄病毒載體（一）.病毒介導的基因轉移基因導入效率高，對人類安全；宿主范圍廣；基因轉導與細胞分裂無關；重組腺病毒可通過口服經腸道吸收、或噴霧吸入或氣管內滴注；腺病毒載體容量較大，可插入7.5kb外源基因。目錄三、基因轉移(genetransfer)技術

（1）腺病毒載體的優點（一）.病毒介導的基因轉移

2、腺病毒載體不能整合到靶細胞的基因組DNA中。分裂增殖快的細胞，導入的重組病毒載體，隨分裂而丟失的機會增多，表達時間相對較短。宿主的免疫反應導致腺病毒載體表達短暫。可能產生復制型腺病毒。靶向性差。三、基因轉移(genetransfer)技術

1.病毒介導的基因轉移

（2）腺病毒載體的缺點

2、腺病毒載體三、基因轉移(genetransfer)技術

1.病毒介導的基因轉移（1）反轉錄病毒載體

（2）腺病毒載體（3）腺病毒相關病毒載體三、基因轉移(genetransfer)技術

1.病毒介導的基因轉移（1）反轉錄病毒載體

（2）腺病毒載體（3）腺病毒相關病毒載體一類單鏈線狀DNA缺陷型病毒。可以高效定點整合至人19號染色體的特定區域19q13.4中，并能較穩定地存在。外源基因可以持續穩定表達，并可受到周圍基因的調控，兼具反轉錄病毒載體和腺病毒載體兩者的優點。

常用基因治療載體

整合致病性感染細胞克隆容量反轉錄病毒載體隨機整合，效率高可能致病分裂細胞<7kb腺病毒載體不整合，可能丟失不致病分裂細胞、非分裂細胞

腺相關病毒載體定點整合(19號染色體特定區域)不致病分裂細胞、非分裂細胞<5kb<7.5kb三、基因轉移(genetransfer)技術

1.病毒介導的基因轉移三、基因轉移(genetransfer)技術

1.病毒介導的基因轉移（1）反轉錄病毒載體

（2）腺病毒載體（3）腺病毒相關病毒載體2.非病毒載體介導的基因轉移系統（1）脂質體介導的基因轉移技術（2）受體介導轉移技術（3）基因直接注射技術三、基因轉移(genetransfer)技術

一、基因治療的策略第一節基因治療的策略和基本程序

二、基因治療的基本程序四、基因干預（geneinterference）

（一）反義RNA（antisenseRNA）（二）RNA干擾四、基因干預（geneinterference）

（一）反義RNA（antisenseRNA）作為基因藥物，通過細胞內特異性mRNA互補，封閉特定基因的表達，達到治療疾病的目的。（1）體外合成反義RNA，直接作用于培養細胞，細胞吸收RNA后，發揮作用。（2）構建一些能轉錄反義RNA的重組質粒，將這些質粒轉入細胞中，轉錄出反義RNA而發揮作用。第一節基因治療的策略和基本程序

四、基因干預（geneinterference）

（一）反義RNA（antisenseRNA）反義RNA的關鍵技術問題?專一性轉移問題?反義RNA進入靶細胞前的降解問題受體介導反義RNA技轉移術①受體介導的RNA轉移十分專一，而且效率高；②被轉移的RNA是被保護的，與周圍環境之間存在多聚賴氨酸的保護層,可以抵抗環境中的核酸酶的降解作用。第一節基因治療的策略和基本程序

四、基因干預（geneinterference）

（二）RNA干擾1.RNA干擾現象RNA干擾（RNAinterference，RNAi）是一種由雙鏈RNA誘發的基因沉默現象。在此過程中，與雙鏈RNA有同源序列的信使RNA（mRNA）被降解，從而抑制該基因的表達。其抑制基因表達的效率比反義RNA至少高2個數量級。第一節基因治療的策略和基本程序

2.RNA干擾的機制RNA干擾過程主要有2個步驟：（1）小干擾性RNA（siRNA）（2）siRNA與細胞內的某些酶和蛋白質形成復合體，稱為RNA誘導的沉默復合體（RNA-inducedsilencingcomplex,RISC)。該復合體可識別與siRNA有同源序列的mRNA，并在特異的位點將該mRNA切斷長雙鏈RNA被細胞內的雙鏈RNA特異性核酸酶Dicer切成21~23個堿基對的短雙鏈RNA，稱為小干擾性RNA（smallinterferingRNA，siRNA）四、基因干預（geneinterference）

RNA干擾機制示意圖研究基因功能的新工具

由于RNA