ICS11.080.030

CCSC31

團體標準

T/CAMDI009.3—2023

無菌醫療器械初包裝潔凈度

第3部分：微生物總數估計試驗方法

Cleanlinessofprimarypackageforsterilemedicaldevice–

Part3：Testmethodsforestimatingthetotalnumberofmicroorganisms

2023-04-20發布2023-04-20實施

中國醫療器械行業協會發布

T/CAMDI009.3-2023

目次

前言.................................................................................II

引言................................................................................III

1范圍...............................................................................1

2規范性引用文件.....................................................................1

3術語和定義.........................................................................1

4原理...............................................................................2

5儀器和設備.........................................................................2

6取樣...............................................................................3

7測試前準備.........................................................................3

8試驗步驟...........................................................................4

9計數方法...........................................................................6

10復檢方法..........................................................................6

11微生物總數估計的方法驗證..........................................................6

附錄A（規范性）回收率F...............................................................7

附錄B（資料性）生物負載技術的驗證.....................................................9

參考文獻.............................................................................11

I

前言

本文件按照GB/T1.1-2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結構和起草規則》的規定

起草。

本文件是T/CAMDI009系列標準的第3部分，T/CAMDI009系列標準已經發布了以下幾個部分：

——第1部分：微粒污染試驗方法氣體吹脫法；

——第2部分：微粒污染試驗方法液體洗脫法；

——第3部分：微生物總數估計試驗方法；

——第10部分：污染限量。

請注意本文件的某些內容可能涉及專利。本部分的發布機構不承擔識別專利的責任。

本文件由中國醫療器械行業協會醫用高分子制品專業分會提出。

本文件由中國醫療器械行業協會醫用高分子制品專業分會標準化技術委員會歸口。

本文件起草單位：安徽和美瑞醫用包裝材料有限公司、威海德生技術檢測有限公司、南微醫學科技

股份有限公司、上海建中醫療器械包裝股份有限公司、振德醫療股份用品有限公司、蘇州方位無菌包裝

有限公司、江西省醫療器械檢測中心、河南駝人貝斯特醫療器械有限公司、山東中保康醫療器具有限公

司、成都市新津事豐醫療器械有限公司。

本文件主要起草人：閆寧、宋蕾、李寧、汪友瓊、蔣水姣、方伯寧、丁琦、華俊娟、鞏家富、田興

龍。

本文件于2023年4月首次發行。

II

T/CAMDI009.3-2023

引言

無菌醫療器械的初包裝是無菌醫療器械的組成部分，因此其潔凈度直接影響無菌醫療器械的潔凈度。

這就要求初包裝要在足夠潔凈的條件下生產。對于某些特殊器械的初包裝，可能要求在與無菌醫療器械

同等潔凈度的生產環境下生產或進行末道清洗。

評價無菌醫療器械的初包裝的潔凈度可從以下幾個方面進行：

——微粒污染；

——生物負載；

注：初包裝材料自身脫落的材料顆粒物質（常稱為“落絮”），這也被視為無菌醫療器械的微粒污染源。

T/CAMDI009系列標準旨在對無菌醫療器械的初包裝的潔凈度給出相關評價和控制規范。隨著科

學發展和技術進步，相關評價試驗方法和技術指標將不斷得到改進和完善，本系列標準也將進行適時修

改和補充。

T/CAMDI009.3的本文件用于評價無菌醫療器械初包裝的生物負載的污染水平。該方法包括樣品

的選擇和收集、試樣洗脫和擦拭、薄膜過濾、移入培養基、培養、對培養的樣本進行計數和定性、數據

解釋等內容。

III

T/CAMDI009.3-2023

無菌醫療器械初包裝潔凈度

第3部分：微生物總數估計的試驗方法

1范圍

本文件描述了無菌醫療器械初包裝和/或初包裝材料上的微生物總數估計的測定方法。

本文件適用于無菌醫療器械初包裝和/或初包裝材料上的微生物總數估計的測定。

2規范性引用文件

下列文件中的內容通過文中的規范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文

件，僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用

于本文件。

GB4789.2食品安全國家標準食品微生物學檢驗菌落總數測定。

GB15979一次性使用衛生用品衛生標準。

GB/T19973.1醫療器械的滅菌微生物學方法第1部分產品上微生物總數的測定。

《中華人民共和國藥典》2020年版。

3術語和定義

GB/T19973.1-2015界定的以及下列術語和定義適用于本文件。

3.1

生物負載bioburden

一件產品和/或包裝上或其中存活的微生物總數。

［ISO/TS11139:2006,定義2.2］

3.2

培養條件cultureconditions

促進微生物復蘇、生長和/或繁殖所采用的培養基和培養方式。

注：培養方法可包括溫度、時間和其他規定用于培養的條件。

［ISO/TS11139:2006,定義2.10］

3.3

生物負載水平bioburdenlevel

100cm2被測試樣的表面上含有微生物的總數即微生物總數（cfu）×100/被測試樣的表面積（cm2）。

3.4

回收率Frecoveryefficiency

1

用某一特定技術從產品上采集和/或培養微生物能力的測量。

4原理

4.1一般微生物污染評估技術的主要流程圖如下：

4.2原理

本文件依據以上流程采樣處理后，采取清洗或擦拭的方法處理試樣，用孔徑不大于0.45μm的濾

膜，將來自試樣的洗脫液過濾后轉接至培養基上在規定溫度和時間培養,培養結束后，肉眼或儀器計數

濾膜上微生物菌落數，最終評估初包裝生物負載的污染程度。

5儀器和設備

5.1設備

5.1.1微生物限度儀（薄膜過濾器）

5.1.2壓力蒸汽滅菌器

5.1.3磁力加熱攪拌器

5.1.4超凈工作臺

5.1.5生物安全柜

5.1.6分析天平

5.1.7恒溫培養箱

5.1.8生化恒溫培養箱（霉菌培養箱）

2

T/CAMDI009.3-2023

5.1.9干燥箱

5.1.10電熱恒溫水浴鍋

5.1.11pH計

5.1.12菌落計數器等

5.2器具

燒杯、量筒、三角瓶(帶硅膠塞)、試管(帶硅膠塞)、酒精燈、手術剪刀、培養皿、刻度吸管、無菌

鑷子、無菌剪刀、放大鏡等。

5.3試劑

胰酪大豆胨瓊脂培養基、沙氏葡萄糖瓊脂培養基、0.9%無菌氯化鈉溶液、0.1%無菌蛋白胨水溶

液、pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液。

6取樣

6.1抽樣取決于許多因素，但首要條件是樣本必須盡可能代表無菌醫療器械初包裝生產過程和與醫療

器械直接接觸的部位。

6.2盡可能使用整個的產品進行生物負載評估，有些初包裝太大，如外科手術衣或外部引流配件的初

包裝，測試時不能裝入實驗室的玻璃器皿內，測試使用的部位應能最大限度代表整個產品的生物負載。

6.3抽取的樣品應保存在潔凈包裝袋內（潔凈包裝袋的生產環境應不低于樣品的生產環境）。

6.4如果需要分割樣品，應在凈化工作臺或層流罩下進行，以免污染樣品。

6.5最少取樣數量：于同一批號中至少抽取12個樣品，1/4樣品用于測試，1/4樣品用于留樣，另1/2

樣品（可就地封存）必要時用于復檢。

6.6供試品的最少檢驗量：洗脫表面積應不小于100cm2。

注：當按6.5條取樣，樣品數量不能滿足供試品的最少檢驗量要求時，應適當增加取樣數量。

6.7供試液應在制備后2小時內完成測試，如不能完成測試，應重新制備試液測試。

7測試前準備

7.1培養基的制備

7.1.1胰酪大豆胨瓊脂培養基（TSA）制備

7.1.1.1按胰酪大豆胨瓊脂培養基產品說明書進行配制、滅菌，滅菌結束后搖勻，冷卻后分裝在潔凈

的無菌培養皿內，制備好的培養基若不及時使用，應置于無菌密閉容器中，在2?25°C、避光的環境下

保存，并在經驗證的保存期內使用。

7.1.1.2自制的培養基按以下方法配制：胰酪胨15.0g，瓊脂15.0g，大豆木瓜蛋白酶水解物5.0g，

水1000mL，氯化鈉5.0g。除瓊脂外，取上述成分，混合，微溫溶解，調節pH使滅菌后在25°C的

pH值為7.3±0.2，加入瓊脂，加熱溶化后，搖勻，分裝，滅菌。

7.1.1.3亦可直接使用一次性即用型培養基。

7.1.2沙氏葡萄糖瓊脂培養基（SDA）制備

7.1.2.1按沙氏葡萄糖瓊脂培養基產品說明書進行配制、滅菌，滅菌結束后搖勻，冷卻后分裝在潔凈

的培養皿內，制備好的培養基若不及時使用，應置于無菌密閉容器中，在2?25°C、避光的環境下保

3

存，并在經驗證的保存期內使用。

7.1.2.2自制的培養基按以下方法配制：動物組織胃蛋白酶水解物瓊脂15.0g，胰酪胨等量混合物10.0

g，水1000mL，葡萄糖40.0g，除葡萄糖、瓊脂外，取上述成分，混合，微溫溶解，調節pH使滅菌

后在25°C的pH值為5.6±0.2，加入瓊脂，加熱溶化后，再加入葡萄糖，搖勻，分裝，滅菌。

7.1.2.3亦可直接使用商業化預制培養基。

7.2洗脫液的制備

7.2.10.9%無菌氯化鈉溶液

稱取氯化鈉9g于1000mL純凈水中（可按比例增加或減少配制量），攪拌溶解后，分裝于容器中，

裝量不得超過容器容量的2/3，蓋上硅膠塞，包好，配制后應采用驗證合格的滅菌程序滅菌。

7.2.20.1%無菌蛋白胨溶液

取蛋白胨1.0g，加水1000mL，微溫溶解，必要時濾過使澄清，調pH值至7.1±0.2，按7.2.1

要求分裝，滅菌。

7.2.3pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液

取磷酸二氫鉀3.56g，無水磷酸氫二鈉5.77g，氯化鈉4.30g，蛋白胨l.00g，加水1000mL，微

溫溶解，必要時濾過使澄清，按7.2.1要求分裝，滅菌。

注：可采用上述任何一種配方配制洗脫液，洗脫液配制后應采用驗證合格的滅菌程序滅菌。根據供試品的特性，也

可選用其他經驗證的適宜溶液作為洗脫液，如需要，可在上述洗脫液的滅菌前或滅菌后加入表面活性劑或中和

劑等。

7.3無菌濾膜準備

準備獨立包裝的無菌濾膜備用，濾膜孔徑應不大于0.45μm。濾膜直徑一般為50mm。若采用其他

直徑的濾膜，沖洗量應進行相應的調整。過濾器、濾膜、鑷子以及無菌設備使用前應進行滅菌，使用時

應保證濾膜在過濾前的完整性。

7.4器具滅菌

與供試液接觸的所有器具（手術剪刀，培養皿、刻度吸管、帶塞的試管等）應保證無菌。

8試驗步驟

8.1試驗開始前應確保該材料或材料組合已按附錄A完成了回收率的驗證。回收率宜不小于50%，當

回收率小于50%，說明本試驗方法可能不適用于被測試樣品。

8.2試驗環境

本操作應在環境潔凈度10000級下的局部100級的超凈工作臺內進行。操作過程應在無菌條件下

進行，應盡量避免任何可能使結果發生偏差的污染。

8.3樣品消毒

用適宜的方法對供試品容器表面進行徹底消毒后放于經擦拭的超凈工作臺面，紫外燈照射0.5小時

以上，備用。

8.4供試液的制備

4

T/CAMDI009.3-2023

8.4.1初包裝和初包裝材料（卷筒狀的紙、涂布紙、膜、非織造材料、涂布非織造材料、表面積大于

50cm2蓋材、襯紙等單片材料和封邊內表面積大于25cm2的袋子）

在100級凈化條件下用無菌方法打開1個樣品，從卷筒狀的紙、涂布紙、膜、非織造材料、涂布非

織造材料或表面積大于50cm2蓋材、襯紙等單片材料的每個包裝中取樣，取50cm2±5cm2樣品（正反

面是100cm2±10cm2），袋子一般由兩層構成，每層取25cm2±2.5cm（合計兩層正反面是2100cm2±10

cm2），切碎至合適大小，放入100mL洗脫液中，充分振蕩(建議使用旋渦混合器或其它裝置進行振蕩)

混勻后，用無菌鑷子將試樣移除，得到供試液。其余兩個樣品按上述方法同樣操作，共得到三個供試液。

注：樣品面積不足時以多個樣品代表一個樣品。

8.4.2器械盒類初包裝

用洗脫液濕潤棉拭子擦拭樣品內表面，20cm2擦抹5次，換l支棉拭子再擦抹5次，每個位置用2

支棉拭子共擦抹10次，擦抹5個位置共100cm2。每支棉拭子擦抹完后立即剪斷(或燒斷)，投入盛有100

mL洗脫液的容器（錐形瓶或大試管)中。全部擦抹棉拭子投入容器后，充分振蕩，即得供試液。或先用

洗脫液濕潤樣品表面，然后用干棉拭子擦拭。隨后將棉拭放至100mL洗脫液中，充分振蕩從棉拭上取

下微生物，得到供試液。

注：充分振蕩時宜用旋渦混合器或其它裝置進行振蕩，不宜只使用人工振蕩。

8.4.3供試液使用

無菌操作法制備的供試液應在2小時內進行測試。

注1：若需要測試霉菌和酵母菌總數時，取樣量和供試液量均需要翻倍。

注2：必要時，供試液可做一個或多個稀釋度。

8.5過濾

用無菌鑷子夾持無菌濾膜置于微生物限度儀泵頭上，安裝濾杯（也可以使用一次性無菌濾杯），開

啟儀器電源后將制備好的供試液過濾，為發揮濾膜的最大過濾效率，應注意保持供試液及洗脫液覆蓋整

個濾膜表面。過濾后用適量的沖洗液沖洗濾膜。

8.6轉移

使用時應觀察濾膜在過濾后的完整性。用無菌鑷子取出濾膜。若測定需氧菌總數，轉移濾膜菌面朝

上貼于胰酪大豆胨瓊脂培養基平板上；若測定霉菌和酵母總數，轉移濾膜菌面朝上貼于沙氏葡萄糖瓊脂

培養基平板上，在平板蓋上面記錄試樣名稱、生產批號等信息。

8.7培養

8.7.1測定需氧菌總數

將胰酪大豆胨瓊脂培養基平板倒置于30°C~35°C的培養箱中，培養3-5天后取出平板計數。

8.7.2測定霉菌和酵母菌總數

將沙氏葡萄糖瓊脂培養基平板倒置于20°C~25°C的培養箱中，培養5~7天后取出平板計數。

8.8計數

8.8.1將平板置菌落計數器或從平板的背面直接以肉眼用標記筆點計，以投射光襯以暗色背景，仔細

觀察，計數。

8.8.2宜選取濾膜上的菌落數應不超過100cfu的稀釋級作為菌數報告的依據。

5

8.8.3當其中一個平板有較大片狀菌落生長時，則不宜采用，而應以無片狀菌落生長的平板作為該稀

釋度的菌落數，若片狀菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均勻，即可計算半個平板后乘

以2，代表一個平板菌落數。

8.8.4當平板上出現菌落間無明顯界限的鏈狀生長時，則將每條單鏈作為一個菌落計數。

8.9陰性對照

取供試液同體積的洗脫液作為陰性對照，其余步驟同供試液。陰性對照應無菌生長。如陰性對照有

菌生長，應進行偏差調查。

9計數方法

9.1達到培養時間后，觀察陰性對照，若陰性對照有菌，則實驗失敗，應重新進行；陰性對照無菌，

則可取出平板計數，記錄每個平板菌落數，單位為cfu/100cm2。

9.2菌落呈片狀生長的平板不宜采用；若培養基上有2個或2個以上菌落重疊，仍以2個或2個以上

計數。

9.3結果表示

9.3.1對于8.4.1初包裝和初包裝材料（卷筒狀的紙、涂布紙、膜、非織造材料、涂布非織造材料、

表面積大于50cm2蓋材、襯紙等單片材料和封邊內表面積大于25cm2的袋子），需氧菌總數估計為：測

試所得的平均菌落數計數值/F（單位：cfu/100cm2）。

9.3.2如果需要測定霉菌和酵母菌數量時，霉菌和酵母菌需單獨計數。

9.4如果每張濾膜菌落數大于100cfu，報告為菌落數“不可計”，如果需要計數，宜考慮其它測試方法。

9.5如果濾膜上無菌落生長，以小于1作為報告結果。

10復檢方法

將留存的復檢樣品依前法復測2次，2次結果平均值都達到本文件的規定，則判定被檢樣品合格；

其中有任何1次結果平均值超過本文件規定，則判定被檢樣品不合格。

11微生物總數估計的方法驗證

本文件未包含的初包裝產品的微生物總數估計的方法和有別于本試驗方法的初包裝上微生物總數

的估計方法可參見附錄B進行驗證。

6

T/CAMDI009.3-2023

附錄A

（規范性）

回收率F

A.1總則

通過向無菌包材內接種一定數量（10cfu～100cfu）的枯草桿菌黑色變種芽孢（ATCC9372或CICC

10316）芽孢，形成人工生物負載，用來建立回收率，進而估算出產品的生物負載。生物負載測定只是

對產品上生物負載的一個估計。對特定技術而言，提高回收率時，能增加生物負載測定的準確度。由于

存在多種能用于采集微生物的技術，通過某一特定技術才能得到的回收比率是決定要使用的技術的一個

因素。若發現回收率低于50%，宜考慮技術改進或使用替代技術。對于初包裝而言，材料和形狀千差

萬別，就某一采集微生物的技術而言，很難滿足其能用于所有初包裝的微生物的采集，因此，應注意存

在回收率不可能高于50%的情況。

注1：本文件所規定的建立回收率的方法不是唯一方法，可能的其他方法也可以使用。

A.2實驗材料

A.2.1試劑

表A.1試劑

試劑名稱

培養基胰酪大豆胨瓊脂培養基

洗脫液應用與本文件正文相同的洗脫液見標準正文7.2

試驗菌株10cfu~100cfu萎縮芽孢桿菌（ATCC9372或CICC10316）

A.2.2設備

生物安全柜，其它同本文件正文6.1內容。

A.2.3器具

同本文件正文6.2內容。

A.3測定前準備

A.3.1洗脫液的制備

洗脫液：制備方法同本文件正文7.2內容。

A.3.2培養基的制備

同本文件正文7.1內容。

A.3.3菌懸液制備

7

可根據中國藥典無菌檢查法菌液制備或使用商業定量菌。

A.4測定步驟

A.4.1樣品制備

樣品接種前需經過滅菌處理，如果采用化學氣體滅菌或消毒時需要確保殘留不產生抑菌性，應慎重

使用化學氣體滅菌的方式。在生物安全柜下將制備好濃度不大于100cfu的菌懸液均勻滴加到包裝材料

內表面（必要時用涂布棒將菌懸液均勻涂抹至包裝材料內表面，為避免涂布棒移除時降低菌懸液數量，

第一片涂抹的樣品棄之不用），晾干。

注：在做回收率之前可先對產品的微生物總數進行評估，如果微生物總數小于直接接種活菌計數的10%時，可直接

接種。

A.4.2供試液的制備

同本文件正文8.4內容。

A.4.3過濾轉移培養計數

同本文件正文8.5、8.6、8.7、8.8內容，肉眼觀察5個樣品菌落數R1、R2······R5.

A.4.4菌懸液計數

將試驗用的濃度不大于100cfu不小于10cfu的菌懸液，同時接種到2個胰酪大豆胨瓊脂平板，重

復標準正文8.7、8.8部分操作，肉眼觀察2個樣品菌落數N1、N2。

A.4.5陰性對照

同本文件正文8.9內容。

A.4.6回收率F

回收率F為

（R1+R2+R3+R4+R5）/5

（N1+N2）/2

式中：

Rn—n號樣品的計數結果；

Nn—n號菌懸液計數結果；

F—回收率。

A.5回收率應用

A.5.1測試初包裝微生物總數修正為：試驗所得數據除以回收率。

A.5.2初包裝產品初次微生物總數估計試驗應確認其回收率。

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T/CAMDI009.3-2023

附錄B

（資料性）

生物負載技術的驗證

B.1總則

生物負載評估方法的最終確認應考慮存在于產品的微生物群。為了使生物負載評估更加可信，

GB/T19973.1要求確認所有用于驗證的技術和回收效率。

B.2收集微生物技術的驗證

B.2.1方法

B.2.1.1從無菌醫療器械初包裝上采集檢測微生物的有效性驗證有兩種方法

a)樣本產品的重復處理；

b)已知微生物數量的生物接種。

第一種方法的優勢在于利用自然形成污染的微生物，但它需要相對較高的初始生物負載。后一種方

法是建立了一個模型系統，此系統使用的問題是它能否與實際自然狀態相符，但該方法可以用于自然污

染水平較低的產品。

B.2.1.2重復提取法

這種方法的原則是必須不斷重復生物負載評估方法，直至被回收的微生物累計數沒有明顯的增加為

止。每重復一次后，將產品上或產品部分上的洗脫液全部回收并計數。比較連續回收得到累計結果。但

是宜注意，本方法未必精確。產品上回收的微生物數量及實際存在的微生物數量之間的確切關系永遠無

法驗證。

B.2.1.3產品接種法

通過向產品接種一定數量選定的微生物，形成人工生物負載，用來建立回收率。微生物可以為細菌

繁殖體，但最常用的方法是使用需氧菌芽孢。但實際上使用細菌繁殖體會有些困難，常因干燥失去活性。

用于驗證研究的微生物應選