ICS65.020

B39

DB52

貴州省地方標準

DB52/T1445—2019

冬蓀液體菌種生產技術規程

Rulesofproduction-techniqueaboutliquidstrainofDongsun

2019-11-11發布2020-01-01實施

貴州省市場監督管理局發布

DB52/T1445—2019

冬蓀液體菌種生產技術規程

1范圍

本標準規定了冬蓀（Phallusimpudicus、Phallusfragrans、Phallusflavocostatus）液體菌種生產術語

和定義、搖瓶液體菌種生產技術、發酵罐菌種生產技術、放罐接種、記錄和存檔、液體菌種貯藏。

本標準適用于冬蓀液體菌種的生產。

2規范性引用文件

下列文件對于本文件的應用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文

件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。

GB150.2壓力容器第2部分:材料

GB5749生活飲用水衛生標準

GB/T12728食用菌術語

GB50073潔凈廠房設計規范

NY/T2375食用菌生產技術規范

3術語和定義

下列術語和定義適用于本文件。

3.1

冬蓀DongSun

是白鬼筆Phallusimpudicus、重脈鬼筆Phallusflavocostatus和香筆菌Phallusfragrans的統稱，又稱無

裙竹蓀，隸屬于真菌門（Eumycota）、擔子菌亞門（Basidiomycotina）、腹菌綱（Gasteromycetes）、

鬼筆科（Phallaceae）、鬼筆屬（Phallus）。

3.2

液體菌種liquidspawn

用于生產和銷售的菌絲體及其生長基質組成的液體繁殖材料，包括搖瓶液體菌種、發酵罐菌種。

3.3

液體菌種發酵罐cultivationapparatusforliquidspawn

進行液體菌種培養的專用設備。

1

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3.4

液體菌種接種器liquidinterfacetrapinoculator

將液體菌種從發酵罐中按無菌操作要求轉接到固體培養基物料上的設備。

3.5

固體專用種solidspecialspawn

在玻璃試管/平皿上固體培養基內生長的純菌絲體培養物，專供接入液體培養基使用。

4生產技術要求

4.1液體菌種生產廠房

4.1.1液體菌種生產場址要求

液體菌種生產廠房設計達到GB50073的規定。液體菌種生產場址應建在交通方便，水源和電源充足，

無有害氣體、煙霧、灰沙，遠離垃圾場、畜禽場舍等有污染的地方，且道路路面硬化、排水良好。

4.1.2液體菌種生產車間要求

4.1.2.1液體菌種生產車間地面應能防水、防滑、防腐蝕、防滲漏、易清洗，有適當的排水坡度（1.0%～

1.5%）和良好的排水系統，排水溝應是圓弧式的明溝。墻壁和天花板應能防潮、防霉、防水、易清洗。

門窗應設置防蚊蠅紗網。車間入口處應設置洗手、消毒和干手設施。車間安裝排氣管道或者排風設備，

設封閉式廢物桶。

4.1.2.2發酵間、接種間按照GB50073執行。液體菌種接種間應設置緩沖間。滅菌間、冷卻間、培養

間符合NY/T2375的規定。

4.2生產設備與設施

4.2.1主要生產設備

包括液體菌種發酵罐、空氣壓縮機、高效空氣過濾器、液體菌種接種器、高壓蒸汽滅菌鍋、蒸汽鍋

爐、凈化工作臺、恒溫搖床、恒溫培養箱、除濕機、玻璃三角瓶、玻璃平皿、自備電源（發電機）等。

液體菌種發酵罐、高壓滅菌鍋和蒸汽鍋爐應符合GB150.2的規定；高效空氣過濾器：對粒徑0.1μm～

0.2μm粒子的捕集效率在99.999%以上，且所有材質應耐126℃高溫滅菌；玻璃三角瓶容積

250ml～5000ml、耐126℃高溫滅菌。

4.2.2主要基礎設施

液體菌種生產車間應包含配料間、滅菌室、冷卻間、接種間、培養間、發酵間、化驗室、菌種室等，

并配備相應設施設備。

4.3培養原料

化學試劑類、生物制劑及天然材料類應符合NY/T2375要求，同時水不溶物物料需過100目篩。

4.4生產菌種

生產菌種符合NY/T2375要求，術語符合GB/T12728的規定。

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4.5液體菌種生產工藝流程

冬蓀液體菌種生產工藝流程見圖1。

木材粉碎

原料貯存配料拌料裝袋

采購輔料

檢驗檢測

滅菌

冷卻

10-15天10-15天

固體專用種搖瓶搖瓶種發酵罐接種栽培種

檢驗檢測（菌棒）

冷卻冷卻

滅菌滅菌

分裝分裝

配料配料

圖1冬蓀液體菌種生產工藝流程

5搖瓶液體菌種生產技術

5.1液體培養基配方及制作

5.1.1液體培養基配方

液體培養基配方見附錄A：葡萄糖10g、磷酸二氫鉀0.9g、硫酸鎂1.8g、馬鈴薯360g（切薄片煮汁）、

酵母粉0.5g、蛋白胨2.5g、VB10.03mg，自來水補足至1L。

5.1.2分裝

搖瓶液體培養基分裝量應為搖瓶容積的60%。

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5.1.3滅菌

液體培養基配制分裝后應立即滅菌。滅菌條件：0.120Mpa～0.140Mpa、溫度達121℃時，高壓蒸

汽滅菌30min。

5.1.4冷卻

冷卻室使用前要進行清潔和除塵處理。將滅菌后搖瓶液體培養基放置在冷卻室中，冷卻到液體培養

基降溫至室溫（≤25℃）。

5.1.5接種

在凈化工作臺上嚴格按無菌操作規程，將合格的冬蓀固體專用種接種到搖瓶液體培養基中（接種量

的質量比為1%～3%）。接種完成后及時貼好標簽。

5.2培養

5.2.1培養條件

在使用培養室的前兩天，采用藥物或者紫外燈消毒。搖瓶液體菌種應置于搖床上震蕩培養，震蕩頻

率150r/min，恒溫25℃。

5.2.2培養期檢查

搖瓶液體菌種培養期間應定期檢查，及時揀出不合格菌種。

5.2.3入庫與記錄

10d～15d后，完成培養的搖瓶液體菌種應登記入庫。搖瓶液體菌種生產各環節應詳細記錄。

5.3留樣

冬蓀固體專用種應留樣備查，留樣的數量應以每個批號3～5支，于4℃下貯存，貯存至經發酵罐菌

種轉接的栽培種（菌棒）出菇結束。

6發酵罐菌種生產技術

6.1空氣過濾器的檢查與滅菌

6.1.1檢查

使用前應拆分檢查空氣過濾器濾芯，要求無油污、料污、無破損，外殼內外壁要求無污物、光亮潔

凈。

6.1.2滅菌

檢查完后空氣過濾器應高壓蒸汽滅菌，滅菌條件：0.120Mpa～0.140Mpa、溫度達121℃時，高壓

蒸汽滅菌30min。

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6.2發酵罐檢查與清洗

6.2.1檢查

檢查罐上全部閥門，安全閥、壓力表、要求完好，工作正常。

6.2.2清洗

對罐體內、外和全部閥門用流水進行沖洗，達到無死角、內壁無任何培養料殘余物的潔凈程度。

6.2.3空消

發酵罐初次使用、出現染菌、長期放置、更換品種時，都要求利用外源蒸汽空消進行滅菌。滅菌條

件：發酵罐罐體壓力0.120Mpa～0.140Mpa、溫度達121℃時，高壓蒸汽滅菌30min。

6.3發酵罐菌種培養基要求與制作

6.3.1原料要求

發酵罐菌種培養基原料應符合NY/T2375要求，同時水不溶物物料應過100目篩。推薦使用5.5.1液

體培養基配方。用水符合GB5749的規定。

6.3.2投料與定容

將配制好的液體培養基原料充分溶解，加適量溫水攪拌均勻，倒入或用泵抽入發酵罐中，加水定容

至所需體積（液體培養基占罐體總容積的60%～70%），擰緊上料口蓋。

6.3.3發酵罐實消

投料定容完成后，利用外源蒸汽實消滅菌。滅菌條件：發酵罐罐體壓力0.120Mpa～0.140Mpa、培

養基溫度達到121℃時，高壓蒸汽滅菌30min（發酵罐容積50L～100L）。

6.3.4冷卻降溫

實消滅菌結束后將冷水通入發酵罐夾層或者內置冷卻系統中循環，使液體培養基降溫至

24℃～26℃。降溫過程中及時向發酵罐內通無菌空氣防止罐壓回零。

6.4接種

利用火焰保護接種法。把火圈放在投料口的上方點燃，此時打開進料口蓋，把搖瓶液體菌種迅速投

入罐中（接種量的體積比為1%～3%），迅速蓋好進料口蓋、擰緊。移走火焰圈，液體菌種進入培養階段。

6.5發酵罐菌種培養條件

培養時控制進氣閥的無菌空氣通風量至0.5m3/h（發酵罐容積50L～100L）、罐壓保持在0.03Mpa～

0.05Mpa之間、培養溫度24℃～26℃范圍內。培養10d～15d后，發酵罐菌種即可達到放罐指標。

6.6留樣及檢測

6.6.1留樣

6.6.1.1搖瓶液體菌種樣品。

6.6.1.2發酵罐滅菌后的空白培養基樣品。

6.6.1.3培養過程中定期從發酵罐中取出的樣品，均用作鏡檢和無菌檢測。

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6.6.1.4上述樣品應放4℃冰箱內保存一周以上。

6.6.2無菌檢測

6.6.2.1搖瓶液體菌種樣品、發酵罐滅菌后的空白培養基樣品應在無菌檢測瓊脂平板上25℃恒溫培養

2d～5d，及時觀察有無細菌、霉菌、酵母菌等雜菌生長。

6.6.2.2培養過程中定期從發酵罐中取出的樣品應及時鏡檢與無菌檢測，同時確定菌絲生長發育狀態

與排除雜菌污染。

6.7發酵罐菌種放罐指標

6.7.1菌種感官指標

發酵罐菌種感官指標見表1。

表1感官指標

項目指標

菌液色球狀菌絲體呈白色或者棕色，濾液呈半透明狀。

澤

菌液形菌液稍粘稠，有大量球狀菌絲體懸浮、分布均勻、不上浮、不下沉、不迅速分層，菌球間液不渾濁。冬蓀液

態體菌種見附錄B。

菌液氣除濃烈的菌香味外無異味，如酸、臭味等。

味發酵罐排氣口氣味正常，無明顯改變。

6.7.2菌種理化指標

發酵罐菌種理化指標見表2。

表2理化指標

項目指標

pH值3.0～4.5

菌絲濕重（g／100ml）＞8

顯微鏡下菌絲形態和雜菌鑒別可見冬蓀菌種液體培養中特有的菌絲形態，球狀和叢狀菌絲體大量分布，菌絲

粗壯。無霉菌菌絲、酵母和細菌菌體。

留存樣品無菌檢查平板有冬蓀菌絲生長，無霉菌、酵母菌、細菌等雜菌生長。

7放罐接種

7.1接種環境

按照GB50073的規定。

7.2接種程序

開啟液體菌種接種器，進入自動消毒程序。消毒完后將待接種的栽培種（菌棒）放置于接種器輸送

帶，輸送至接種器的接種艙內。在接種器接種艙內，用接種槍將冬蓀液體菌種注入栽培種（菌棒）。執

行接種器接種規程，接種動作迅速、準確，接種量為15ml～30ml/栽培種（菌棒）。

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8記錄和存檔

發酵罐菌種生產的每個環節都要有詳實的生產記錄，由具體操作人員現場記錄填寫，定期由主管領

導審核，簽字后歸檔保存。

9液體菌種貯藏

在發酵罐內通入無菌空氣，保持罐壓0.04Mpa～0.05Mpa時，料溫6℃～10℃可保存3d，

11℃～15℃可保存2d。

7

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AA

附錄A