ICS65.150B52DB13河北省地方標準DB13/T1415—2011魚類寄生蟲性疫病診斷技術規程Diagnosisprotocalforparasiteepidemicsoffish河北省質量技術監督局發布DB13/T1415—2011前言本標準按照GB/T1.1—2009給出的規則起草。本標準由河北省水產局提出。本標準起草單位：河北省水產養殖病害防治監測總站。本標準主要起草人：張志華、侯金良、李同慶、康辰香、孫偉彬、石潔卿、馬瑞欣、邵鐵凡、寇景蓮。IDB13/T1415—2011魚類寄生蟲性疫病診斷技術規程1范圍本標準規定了魚類寄生蟲性疫病即小瓜蟲病、刺激隱核蟲病、粘孢子蟲病、三代蟲病、指環蟲病的診斷技術。本標準適用于小瓜蟲病、刺激隱核蟲病、粘孢子蟲病、三代蟲病、指環蟲病的診斷。2規范性引用文件下列文件對于本文件的應用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實驗室用水規格和試驗方法OIE《水生動物疾病診斷手冊》3通則普通光學顯微鏡、雙筒解剖鏡、放大鏡、載玻片、蓋玻片、鑷子、手術刀、手術剪、解剖針、吸水紙、培養皿、滴管、解剖盤等。3.1.2試劑0.85％生理鹽水、30‰人工配制海水、4％～5%和10％的福爾馬林、70％酒精、硝酸銀、甘油膠胨、肖氏液、聚乙烯醇。配置試劑用水應符合GB/T6682的要求。用于檢查診斷的魚應有一定數量，檢查時采集的樣品至少5尾~10尾。也可按照OIE《水生動物疾病診斷手冊》的采樣方法進行采樣，見附錄A。用于實驗室檢查的病魚應是活體，運輸時應在采集的病魚中加注原池水進行活體運輸。每個容器只裝運同一種病魚送至實驗室。運輸過程中應采取充氧、降溫等措施。按不同感染部位采集組織，進行觀察。記錄顯微鏡檢查時的倍數和該倍數下的蟲體數量。孢囊用數字說明，蟲體數為同一玻片中3個視野的平均數。1DB13/T1415—20114小瓜蟲病4.1病原種類特征見附錄B。4.2現場樣品目檢檢查魚體。病魚體色發黑，消瘦，游動異常，體表或鰓上可見1mm左右的小白點，病情嚴重時，魚體表伴大量粘液，用鑷子刮下白點或粘液，放在解剖盤上，滴一滴生理鹽水，靜置1min～2min，在光亮的地方仔細觀察，如果見到一個個白色小圓球在慢慢地游動，且大多數集中在水滴的邊緣，根據上述的癥狀可以初步確診。4.3實驗室檢測及標本保存4.3.1體表用解剖刀刮取體表兩側粘液，置于載玻片上，滴一滴生理鹽水，用鑷子將組織粘液分散，蓋上蓋玻片，用拇指輕輕壓片，在顯微鏡或解剖鏡下檢查。4.3.2鰭目檢正常的魚，剪下各鰭，置于載玻片上，滴一滴生理鹽水，解剖鏡下檢查。目檢魚體各鰭如有潰爛或白點，用鑷子刮取潰爛或白點部位，置于載玻片上，滴一滴生理鹽水，用蓋玻片蓋上輕壓，解剖鏡或顯微鏡下檢查。4.3.3鰓用剪刀將左右兩邊的鰓完整地取出，放在培養皿里（要分開放置），并附上左右標記。剪取一小塊鰓組織（應從每一邊鰓的第一片鰓片接近兩端的位置剪取），放在載玻片上，滴一滴生理鹽水，蓋上蓋玻片輕壓，在解剖鏡或顯微鏡下檢查。如鰓上肉眼可見白點或孢囊，則用鑷子刮取白點或孢囊，或取整片鰓絲壓片，顯微鏡下檢查。目檢癥狀結合鏡下觀察，40倍顯微鏡下平均每視野內小瓜蟲計數達到10個及10個以上時，判定為小瓜蟲病；小瓜蟲計數不足10個時，判定為小瓜蟲感染。2DB13/T1415—20115.3實驗室檢測及標本保存診斷時滴加試劑為30‰人工配制海水，其他步驟同4.3。5.4結果判定目檢癥狀結合鏡下觀察，40倍顯微鏡下平均每視野內刺激隱核蟲計數達到10個及10個以上時，判定為刺激隱核蟲病；刺激隱核蟲計數不足10個時，判定為刺激隱核蟲感染。6粘孢子蟲病6.1病原種類特征見附錄B。6.2現場樣品目檢粘孢子蟲的多數種類，寄生于魚的體表、鰓、腸道及體腔，都表現出肉眼可見的癥狀，即白點狀或白色的瘤狀孢囊，孢囊形狀和大小不規則，顏色灰白而不透明。用鑷子取下一個孢囊放在載玻片上，滴一滴生理鹽水，用蓋玻片蓋上輕壓，如孢囊破裂并流出乳白色液體，可初步診斷為粘孢子蟲病。6.3實驗室檢測及標本保存6.3.1鏡檢在400倍顯微鏡下，壓破的孢囊液體中清晰可見孢子，可診斷為粘孢子蟲病。一個孢囊中有成千上萬個孢子蟲。檢查體表，用解剖刀刮取鱗片下的瘤狀物，置于載玻片上，加一滴生理鹽水，蓋上蓋玻片輕壓，顯微鏡下檢查。打開魚體腹腔，仔細觀察顯露出的部位有無可疑病變。如發現白點，或較大孢囊，有可能是粘孢子蟲寄生。用鑷子刮取白點部位或孢囊置于載玻片上，滴一滴生理鹽水，蓋上蓋玻片輕壓，見孢囊破裂后，顯微鏡下檢查。將腸道外壁上所有脂肪去除干凈，把腸前后伸直擺在解剖盤上。將腸分為前、中、后三段，各取一段，用剪刀從與腸平行的方向剪開一個小小切口，用鑷子從切口上取一小滴內容物放在載玻片上，滴一滴生理鹽水，蓋上蓋玻片輕壓，顯微鏡下檢查，每段同時檢查兩片標本。3DB13/T1415—2011剪開腸道后，如見白點或孢囊附著，直接用解剖刀刮取白點或孢囊于在載玻片上，壓片后，顯微鏡下檢查。6.3.7蟲體收集保存見附錄C。6.4病原體記數及結果判定6.4.1病原體記數6.4.1.1計數符號用“+”表示：“+”表示有；“++”表示多；“+++”表示很多。6.4.1.2高倍顯微鏡400倍一個視野下，有1個～20個蟲體時記“+”，21個～50個蟲體時記“++”，50個以上的蟲體時記“+++”。6.4.2結果判定檢出粘孢子蟲則判定為粘孢子蟲病。7三代蟲病7.1病原種類特征見附錄B。目檢癥狀結合鏡下觀察，40倍顯微鏡下平均每視野內三代蟲計數達到5個及5個以上時，判定為三代蟲病；三代蟲計數不足5個時，判定為三代蟲感染。4DB13/T1415—20118.4結果判定目檢癥狀結合鏡下觀察，40倍顯微鏡下平均每視野內指環蟲計數達到5個及5個以上時，判定為指環蟲病；指環蟲計數不足5個時，判定為指環蟲感染。5DB13/T1415—2011AA附錄A（資料性附錄）采樣數量表A.1檢疫采樣數量表魚群大小502％感染率時取樣5％感染率時取樣10％感染率時取樣50354550555555606060602023252627272727273010075250110130140140145145145150500100015002000400010000100000或以上注：檢疫采樣應采集全部實驗室樣品。6DB13/T1415—2011BB附錄B（資料性附錄）病原種類特征B.1多子小瓜蟲B.1.1成蟲期蟲體一般呈卵形或球形，大小(350～800)μm×(300～500)μm，胞口在接近前端的腹面上。大核香腸狀或馬蹄狀，小核緊帖大核上，細胞質有很多小的伸縮泡和一些食物粒。B.1.2幼蟲期身體一般呈橢圓形，隨著發育時間的延長身體逐漸變長，變成扁鞋底狀，在前端有一乳頭狀突起，叫鉆孔器，前端較圓，除身體后端有1根特長的尾毛外，周身長著長短一致的纖毛。在腹面稍前的位置，有1個近似“6”字形的小胞口。在身體前半部有一個大的伸縮泡。B.1.3包囊期離開魚體的蟲體或越出囊泡的蟲體，可作3h～6h的游泳，然后沉入水底的物體上，靜止之后，分泌一層膠質厚膜將蟲體包圍即是包囊。包囊圓形或橢圓形，白色透明。成熟的蟲體呈球形或卵圓形，直徑約300μm～500μm，顯微鏡下常呈乳白色，體被纖毛，表面有脊狀突起，胞口位于身體的前端，體內有4個～8個卵圓形團塊連接成“Ｕ”字形排列的念珠狀大核。蟲體會隨運動改變形狀。蟲體從宿主體表脫落后，纖毛退化，表面的脊狀突起變平，形成厚壁胞囊，大小為94.5μm×170μm～252μm×441μm。卵圓形或紡錘型，前端稍尖，大小為20μm×30μm～50μm×70μm，其形態大小隨地域、宿主種7DB13/T1415—2011營養體外觀不規則，大小不一。成熟孢子殼面觀為橢圓形，前端較后端寬或鈍圓。后端殼緣光滑，或有4～5個V形皺褶。極囊2個，梨形或卵圓形，大小相等，平行排列于前方，約占孢子長的1/2。少數極囊不等，斜向排列于前。極絲在極囊內盤繞5～9圈。孢中質有圓形胚核2個。無嗜碘泡。頂面觀紡錘形。縫面觀亦為紡錘形，縫脊直或稍彎曲。孢子長9μm～13μm，寬6μm～8.5μm。孢囊形狀大小不一，有橢圓形、扇形塊狀、長條形或分枝不規則等。B.3.2中華粘體蟲（M.sinensisNie&Lee,1964)成熟的孢子圓形，前方稍尖，后方鈍圓，縫脊直。兩個梨形極囊同等大小。無嗜碘泡。感染的魚腸道內壁或外壁形成乳白色芝麻狀孢囊。B.3.3鰱碘泡蟲（M.drjagini）(1954)(Schulman,1962)營養體直徑4.8μm～16.0μm.。孢子殼面觀橢圓或倒卵形，前寬而后稍狹。殼面光滑或有4～5個V形的褶皺，囊間有明顯V形小塊。孢子長12.3μm，寬9.0μm。極囊2個，梨形，通常大極囊傾斜地位于孢子前方。B.3.4餅形碘泡蟲（M.artuaAchmerov,1960)孢囊白色，圓形或橢圓形，長42μm～89.2μm，寬31.5μm～73.5μm。孢子殼面觀為圓形，縱軸小于橫軸，孢子后方有不甚明顯的褶皺。縫面觀紡錘形。孢子長4.8μm～6.0μm。2個卵圓形的極囊大小相等，呈八字形排列。B.3.5異型碘泡蟲（M.disparTheolohan,1895)孢子橢圓形，縫脊直而明顯，兩個梨形極囊大小不等，彼此有一定間隔，有一個明顯的嗜碘泡。孢囊大小為29.7μm～39.2μm×195.8μm～230μm。著生于魚體鱗片下，白色或蠟黃色，孢囊大小形狀不一，有圓形、橢圓形、長方形或多角形，其長可達32mm，短的有5mm。孢子長29.8μm～35μm，寬7μm～12.3μm，極囊長19μm～25μm，寬為7μm，呈長卵形，約占孢子長的1/3～1/2。嗜碘泡1個。孢子外面常被有一層無色透明的薄膜。B.4.1鰱三代蟲（G.hypopthalmichthysiLing）主要寄生于鰱、鳙的皮膚、鰭、鰓及口腔。無眼點，體長0.32mm～0.51mm，寬0.07mm～0.14mm前端有頭器1對。后吸器上的8對邊緣小鉤排列呈傘狀，中央大鉤1對，2片聯結片。口在身體前端腹面，呈管狀或漏斗狀。咽由16個大細胞構成，葫蘆狀。食道很短，腸支伸至體后的4/5處。睪丸位于體后部中間。交配囊卵圓形，由1根大而彎曲的大刺和8根刺組成。卵巢單個，呈新月形，在睪丸之后。主要寄生于鯉、鯽及金魚。無眼點，在蟲體的中部，可見到胚胎，有時甚至可見到“連續四代”在8DB13/T1415—2011B.4.3鯇三代蟲（G.ctenopharyngodontisLing）主要寄生于草魚皮膚和鰓上。無眼點，蟲體較大，為0.33mm～0.57mm×0.09～0.15mm，兩端的前緣常各具有一尖刺狀的突起。B.5指環蟲指環蟲屬的主要特征：后吸器具7對邊緣小鉤，1對中央大鉤。聯結片存在，輔助片存在或缺失。體前端具眼點2對，具貯精囊，前列腺儲囊1對。主要致病種類有：B.5.1頁形指環蟲（DactylogyruslamellatusAchmerov）主要寄生于草魚鰓、皮膚和鰭。蟲體扁平，大小為0.192mm～0.529mm×0.072mm～0.136mm，具眼點及頭器各2對。B.5.2鳙指環蟲（DactylogyrusaristichthysLong&Yu）主要寄生于鳙魚鰓部。具7對邊緣小鉤，中央大鉤基部較寬，內外突明顯。聯結片略呈倒“山”字形，輔助片稍似菱角狀，左右兩部分較細長。B.5.3小鞘指環蟲（DactylogyrusvaginulatusTchang&Niu）主要寄生于鰱魚鰓上，為較大型的指環蟲，可達0.98mm～1.4mm×0.233mm～0.344mm。中央大鉤粗壯，全長0.054mm～0.066mm。B.5.4壞鰓指環蟲（DactylogyrusvastatorNybelin）9DB13/T1415—2011CC附錄C（資料性附錄）蟲體標本收集方法及保存C.1小瓜蟲、刺激隱核蟲C.1.1用4％～5％福爾馬林保存帶有蟲體的組織。C.1.2制備干片保存：將有病原體的含有物涂在載玻片上，空氣中干燥后進行染色（硝酸