第31章DNA的重組（自學）同源重組同源重組分子機制-----Holliday模型(Animation

）同源DNA的來源:真核生物：減數分裂時非姊妹染色單體原核生物：細胞間DNA（基因）轉移轉移方式：結合（Conjugation,需F因子介導），轉化（Transformation），轉導（Transduction），細胞融合（Cellfusion）主要的酶：RecA蛋白,RecBCD **DNA的重組的生物學意義(一)Holliday模型一、同源重組（自學）(二)細菌的基因轉移與重組細菌的結合作用致育因子（F因子）通過結合作用由F+細胞向F-細胞轉移，F質粒約1/3的基因與轉移有關，traS和traT基因編碼表面排斥蛋白，阻止F+細胞之間的轉移，F+細胞的性菌毛與F-細胞結合后收縮，使二者靠近，TraD蛋白構成轉移的通道，在TraI在TraY的幫助下結合到轉移起點oriT上，切開一條鏈，使其5?端進入受體細胞，并合成其互補鏈，使F-細胞轉化為F+細胞，給體細胞中的單鏈也可以合成互補鏈。(三)重組有關的酶RecBCD有依賴ATP的核酸外切酶、核酸內切酶和解螺旋酶活性，當DNA斷裂時，它結合在其游離端，使其解旋并降解，直至酶移動到chi位（GCTGGTGG)，在其3＇側4-6核苷酸處將鏈切斷，產生3＇游離單鏈，隨后單鏈與RecA結合，開始同源區重組。RecA蛋白的絲狀聚合體與DNA的相互作用RecA蛋白引起DNA同源重組的模型在大腸桿菌中由RuvA,RuvB和RuvC蛋白參與的同源重組。（a）

RuvA四聚體的圖解。四個亞基形成的結構像四個花瓣的花。（b）

RuvA/RuvB的作用：（左）RuvA四聚體結合到Holliday位點；（中）RuvB六聚體結合到雜合雙螺旋的兩對面，DNA穿過其中心，RuvB六聚體的作用像馬達，促進超螺旋分叉點通過復合體移動。（右）RuvC結合到Holliday位點，由其核酸酶活性切斷核酸鏈，切割位點由剪切體辨認。（c）

RuvA四聚體的電荷分布，藍色表示正電荷，紅色表示負電荷，注意正電荷位于四聚體的表面，有四個負電荷區域位于其中心。（d）假設的RuvA四聚體與Holliday位點結合的結構模型。幾個重要例子：1.

PhageDNA在細菌染色體DNA的特定位點上的整合或切除（開發：Invitrogen,GatewayTechnology)2.鼠寒沙門氏桿菌的鞭毛蛋白相變3.免疫球蛋白基因重排二、特異位點重組特異位點重組噬菌體的基因重組免疫球蛋白基因的重組IgG的分子結構（1）（2）（3）（4）（5）重組位點有7和9nt的信號序列,中間間隔12或23bp。在不同的核苷酸位點重組可以生成不同的蛋白質三、轉座重組McClintock的重要發現

轉座子具有反向末端重復序列以及在靶部位兩側產生的同向重復序列。在該例中靶序列為5bp，轉座子末端由9bp反向重復序列組成，數字1-9指序列重復堿基對。*兩側正向重復***末端反向重復**(一)細菌的轉座因子1.插入因子

兩個插入序列之間夾著一段序列（可以是某個基因，如抗性基因）。兩個插入序列可以同向或反向排列，有時均有轉座活性，有時只有一個有轉座活性。2.組合型轉座子

插入序列被轉座酶基因取代，圖示為Tn3(TnA家族）的結構。兩端為38bp的反向重復，其兩側為5bp的靶序列，tnpA編碼轉座酶，tnpR編碼的蛋白質可以作為解離酶（使轉座子與受體DNA形成的共整合體重組和解離），也可以作為阻丫啶類丫啶類丫啶類3.復合型轉座子

兩個IS10組件構成一個復合轉座子，它能使位于他們之間的任何DNA易位。當Tn10是一個小的圓形分子的一部分時，IS10重復序列可轉座至環狀分子的任一側。轉座子可用不同的方式轉座，轉座因子插入基因后可使基因失活，也可引起染色體的斷裂、重復、缺失、倒位、易位等變化。4.轉座的方式插入序列使靶序列的數量增加，在插入序列兩側各有一個復制轉座作用產生了轉座子的一個拷貝，它插入到一個接受位點。給予位點保持不變，以致給予者和接受者都有轉座子的一個拷貝。非復制轉座作用在未被修復的情況下，可能造成致死突變轉座子引起DNA的重排，正向重復序列的重組引起其間序列的切除或插入。反向重復序列的重組能引起其間序列反向排列(二)真核生物的轉座因子原核生物的轉座酶主要作用于產生它的轉座因子，表現出順式顯性。真核生物的轉座酶可以作用于任何末端具有該酶所識別的反向重復順序的DNA,使其轉移到相應的靶位點。在玉米的激活-解離系統（activator-dissociationsystem,Ac-Ds)中，Ac編碼轉座酶(自主因子)，Ds（非自主因子）是Ac不同程度的缺失中間序列形成的，無轉座酶活性，但隨Ac轉座后可抑制鄰近基因的表達。在玉米的抑制-促進-增變系統（suppressor-promotor-mutator,Smp)中,Smp和En（增強子）序列相似，均為自主因子，與其對應的非自主因子dSmp為有缺陷的Smp因子，轉座后，若Smp插入靶基因附近的合適部位，可以促進靶位點基因的表達，若Smp插入外顯子，可抑制基因的表達。四、真核生物基因表達的轉錄前調控1.染色體丟失：如四膜蟲的大核為營養核，由小核發育而來，約10%的DNA在發育過程中被丟失。2.基因擴增：如非洲爪蟾卵母細胞的rDNA可以大量擴增，形成1000個以上的核仁。3.基因重排：重排可以使表達的基因發生切換，也可以產生新的基因。4.組蛋白的乙酰化和去乙酰化：組蛋白的乙酰化和基因表達的狀態相關。組蛋白H4的乙酰化不足(underacetylation)是雌性哺乳動物一條X染色體失活的原因之一。去乙酰化和基因活性的阻遏有關。5.染色體DNA的修飾和異染色質化：DNA的甲基化可以使其失去轉錄活性，高度甲基化的DNA可以形成高度壓縮的異染色質，異染色質的基因無轉錄活性。6.染色質結構改變模型-組蛋白置換

占先模型(pre-emptivemodel)：決定的因素是轉錄因子和組蛋白誰先占據調控位點。DNA復制時，組蛋白8聚體解離，轉錄因子乘機結合到調控位點上，一直持續到下一個復制周期，抑制了組蛋白和DNA的結合。

例1：當5SrRNA基因與組蛋白結合時TFⅢA不能激活此基因。而TFⅢA可與游離的5SrRNA基因結合，再加入組蛋白不能使此基因失活。例2：含腺病毒啟動子的質粒能被TFⅡD結合，再被RNApolⅡ轉錄，如先加入組蛋白，則不起始轉錄，如先加入TFⅡD則形成的染色質中，模板仍能轉錄。動態模型(dynamicmodel)：組蛋白置換需輸入能量。一些轉錄因子結合DNA時可裂解核小體，或建立一個可產生核小體定位結合位點的邊界。如果蠅Hsp70啟動子上的核小體在體外實行重建。GAGA(細胞核結合蛋白)轉錄因子與啟動子中4個富含(CT)n位點結合，破壞了核小體，形成一高敏感區，而且導致鄰接的核小體重排，這樣它們就優先插入到隨機位點。核小體打開的過程是需要水解ATP的耗能過程。(一)PCR技術（聚合酶鏈式原應,PolymerasechainReaction)以目的基因或DNA片段為模板，在引物介導及TaqDNA聚合酶催化下，在體外用核苷酸大量合成目的基因或DNA片段。快速、專一地擴增所希望得到的目的基因或DNA片段。五、DNA體外合成技術DNA的酶合成

PCR（PolymeraseChainReaction）①模板DNA（單鏈）②引物③DNA聚合酶④dATP、dGTP、dCTP、dTTP⑤一定濃度的Mg2+合成方向：5’→3’端

化學合成：方向3’→5’，不需酶和DNA模板。生物合成：方向5’→3’，需模板、引物和酶。反應物（1）模板單、雙鏈DNA或cDNA都可以作為PCR的模板，若以RNA為起始材料，則須經反轉錄，獲得第一條cDNA后才能用于PCR。（2）TaqDNA聚合酶

DNA聚合酶是進行PCR擴增的關鍵，從水生棲熱菌（ThermusaquaticnsVT-1）分離出來。TaqDNA聚合酶有很好的熱穩定性，92.5℃處理130min，仍保留50%的酶活性，在68-74℃活性最高，錯誤摻入核苷酸的比率為1/7500。（3）引物引物是決定PCR結果的關鍵，它由寡核苷酸組成，15-30b（4）核苷酸dNTPdNTP的濃度50-200umol/L。（5）鎂離子Mg2+

2.PCR原理

變性95℃

復性55℃

延伸72℃RT-PCR注意事項：1)防止RNA的降解，保持RNA的完整性。2)為了防止非特異性擴增，必須設陰性對照。3)內參的設定：用于靶RNA的定量。常用的內參β-Actin（β-肌動蛋白）等。避免RNA定量誤差、加樣誤差以及各PCR反應體系中擴增效率不均一各孔間的溫度差等所造成的誤差。4)PCR不能進入平臺期，對于每一個目標序列出現平臺效應的循環數，均應通過單獨實驗來確定。5)防止DNA的污染：A.采用DNA酶處理RNA樣品。B.將PCR引物置于基因的不同外顯子，以消除基因和mRNA的共線性。引物：特異性反應的關鍵，知道任何一段模板DNA序列-設計引物。設計引物：

①引物長度：15-30bp，常用為20-25bp左右。②引物擴增跨度：特定條件下可擴增長至10kb的片段。③引物堿基：G+C含量以40-60%為宜，太少--擴增效果不佳，過多--非特異條帶，避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。④避免引物內部出現二級結構，避免兩條引物間互補，特別是3‘端的互補，否則會形成引物二聚體；⑤引物3‘端的堿基（最末及倒數第二個堿基，應嚴格要求配對，末端堿基不配對--PCR失敗。⑥引物（可加合適的酶切位點--酶切分析或分子克隆）。⑦引物的特異性：與其它序列無明顯同源性。引物量：每條引物的濃度0.1～1

mol或10～100pmol，偏高--錯配和非特異性擴增；增加引物之間形成二聚體的機會。(二)cDNA合成(逆轉錄)以總mRNA為模板，用反轉錄酶合成第一鏈，去除mRNA，合成第二鏈。從而得到特定細胞中所有mRNA對應的cDNA。反轉錄的簡要過程表示如下：反轉錄酶的作用是以dNTP為底物，以RNA為模板，Oligo(dT)為引物，按5′→3′方向，合成一條與RNA模板互補的DNA單鏈，這條DNA單鏈叫做互補DNA(complementaryDNA,cDNA)，它與RNA模板形成RNA/DNA雜交體,隨后又在反轉錄酶的作用下，水解掉RNA鏈，再以cDNA為模板合成第二條DNA鏈。cDNA合成多數反轉錄酶都具有多種酶活性：1.DNA聚合酶活性；以RNA為模板，催化dNTP聚合成DNA的過程。以5′→3′方向合成DNA。反轉錄酶中不具有3′→5′外切酶活性，因此沒有校正功能，所以由反轉錄酶催化合成的DNA出錯率比較高。2.RNaseH活性；由反轉錄酶催化合成的cDNA與模板RNA形成的雜交分子，將由RNaseH從RNA5′端水解掉RN