基因信息的傳遞基因重組與基因工程DNA重組接合作用(conjugation)轉化作用(transformation)轉導作用

(transduction)轉座

(transposition)同源重組

(homologousrecombination)位點特異的重組(site-specificrecombination)發生在同源序列間的重組稱為同源重組(homologousrecombination)，又稱基本重組。是最基本的DNA重組方式，通過鏈的斷裂和再連接，在兩個DNA分子同源序列間進行單鏈或雙鏈片段的交換。以E.coli的同源重組為例，了解同源重組機制的Holliday模型。一、同源重組Holliday模型中，同源重組主要4個關鍵步驟①兩個同源染色體DNA排列整齊②一個DNA的一條鏈斷裂、并與另一個DNA對應的鏈連接，形成Holliday中間體③通過分支移動產生異源雙鏈DNA④Holliday中間體切開并修復，形成兩個雙鏈重組體DNA，分別為：片段重組體(patchrecombinant)拼接重組體(splicerecombinant)片段重組體（見模型圖左邊產物）：切開的鏈與原來斷裂的是同一條鏈，重組體含有一段異源雙鏈區，其兩側來自同一親本DNA。拼接重組體（見模型圖右邊產物）：切開的鏈并非原來斷裂的鏈，重組體異源雙鏈區的兩側來自不同親本DNA。

內切酶

(recBCD)DNA侵擾(recA)分支遷移

(recA)

內切酶(recBCD)

DNA

連接酶5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′3′3′5′3′5′3′3′5′5′3′5′3′5′3′Holiday中間體5′3′5′3′5′3′5′3′目錄Holiday中間體5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′5′5′3′3′3′5′5′5′5′3′3′3′3′5′5′5′5′3′3′3′3′5′5′5′5′3′3′3′3′5′5′5′5′3′3′3′3′內切酶(ruvC)內切酶(ruvC)DNA連接酶DNA連接酶片段重組體拼接重組體二、細菌的基因轉移與重組（一）接合作用當細胞與細胞、或細菌通過菌毛相互接觸時，質粒DNA從一個細胞（細菌）轉移至另一細胞（細菌）的DNA轉移稱為接合作用(conjugation)。可接合質粒如F因子(Ffactor)質粒——細菌染色體外的小型環狀雙鏈DNA分子（二）轉化作用通過自動獲取或人為地供給外源DNA，使細胞或培養的受體細胞獲得新的遺傳表型，稱為轉化作用

(transformation)。

例：溶菌時，裂解的DNA片段被另一細菌攝取。（三）轉導作用當病毒從被感染的（供體）細胞釋放出來、再次感染另一（供體）細胞時，發生在供體細胞與受體細胞之間的DNA轉移及基因重組即為轉導作用(transduction)。λ噬菌體的生活史溶菌生長途徑(lysispathway)溶源菌生長途徑(lysogenicpathway)例三、位點特異重組位點特異重組(site-specificrecombination)

是由整合酶催化，在兩個DNA序列的特異位點間發生的整合。例（一）λ噬菌體DNA的整合λ噬菌體的整合酶識別噬菌體和宿主染色體的特異靶位點發生選擇性整合；反轉錄病毒整合酶可特異地識別、整合反轉錄病毒cDNA的長末端重復序列(longterminalrepeat,LTR)。

例（二）細菌的特異位點重組沙門氏菌H片段倒位決定鞭毛相轉變hix為反向重復序列，它們之間的H片段可在Hin控制下進行特異位點重組(倒位)。H片段上有兩個啟動子P，其一驅動hin基因表達，另一正向時驅動H2和rH1基因表達，反向(倒位)時H2和rH1不表達。rH1為H1的阻遏蛋白基因。H2鞭毛素

阻遏蛋白Hin重組酶轉位片段hinH2IH1H1鞭毛素hinH2IDNA啟動序列H1啟動序列沙門氏菌H片段倒位決定鞭毛相轉變例（三）免疫球蛋白基因的重排免疫球蛋白(Ig)，由兩條輕鏈(L鏈)和兩條重鏈(H鏈)組成，分別由三個獨立的基因族編碼，其中兩個編碼輕鏈(

和

)，一個編碼重鏈。

輕鏈的基因片段：重鏈的基因片段：LVJCLVDJC重鏈(IgH)基因的V-D-J重排和輕鏈(IgL)基因的V-J重排均發生在特異位點上。在V片段的下游，J片段的上游以及D片段的兩側均存在保守的重組信號序列(recombinationsignalsequence,RSS)。此重排的重組酶基因rag(recombinationactivatinggene)共有兩個，分別產生蛋白質RAG1和RAG2。

CACAGTG(12/23)ACAAAAACCGTGTCCACTGTTTTTGG重組信號序列基因片段V片段J片段RSSRSS間插DNAOHOHVJ單鏈切開RAG1RAG2分子內轉酯反應單鏈切開轉移核苷酸修復、連接免疫球蛋白基因重排過程四、轉座重組由插入序列和轉座子介導的基因移位或重排稱為轉座(transposition)。插入序列(insertionsequences,IS)組成：二個分離的反向重復(invertedrepeats,IR)序列特有的正向重復序列一個轉座酶（transposase)編碼基因

IRTransposaseGeneIR發生形式：保守性轉座(conservativetransposition)復制性轉座(duplicativetransposition)（一）插入序列轉座插入序列的復制性轉座轉座子(transposons)——可從一個染色體位點轉移到另一位點的分散重復序列。

轉座子組成：反向重復序列轉座酶編碼基因抗生素抗性等有用的基因IRIRTransposaseGene有用基因（二）轉座子轉座由轉座子介導的轉座第二節

重組DNA技術DNARecombinationTechnique重組DNA技術的發展史年G.J.Mendel的豌豆雜交試驗1944年O.T.Avery的肺炎球菌轉化實驗1973年美國斯坦福大學的科學家構建第一個重組DNA分子1977年美國南舊金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遺傳工程公司，專門應用重組DNA技術制造醫學上重要的藥物。1980年開始建造第一家應用重組DNA技術生產胰島素的工廠1997年英國羅林研究所成功的克隆了多莉相關概念DNA克隆工具酶目的基因基因載體基本原理重組DNA技術與醫學的關系本節主要內容一、重組DNA技術相關概念克隆(clone)來自同一始祖的相同副本或拷貝的集合。獲取同一拷貝的過程稱為克隆化(cloning)，即無性繁殖。（一）DNA克隆技術水平：分子克隆(molecularclone)即DNA克隆

細胞克隆個體克隆（動物或植物）DNA克隆應用酶學的方法，在體外將各種來源的遺傳物質（同源的或異源的、原核的或真核的、天然的或人工的DNA）與載體DNA接合成一具有自我復制能力的DNA分子——復制子(replicon)，繼而通過轉化或轉染宿主細胞，篩選出含有目的基因的轉化子細胞，再進行擴增提取獲得大量同一DNA分子，也稱基因克隆或重組DNA(recombinantDNA)

。生物技術工程:

基因工程、蛋白質工程、酶工程、細胞工程等目的①分離獲得某一感興趣的基因或DNA②獲得感興趣基因的表達產物（蛋白質）基因工程(geneticengineering)

——實現基因克隆所用的方法及相關的工作稱基因工程，又稱重組DNA工藝學。（二）工具酶

限制性核酸內切酶

DNA聚合酶Ⅰ

逆轉錄酶

T4DNA連接酶堿性磷酸酶末端轉移酶

TaqDNA聚合酶重組DNA技術中常用的工具酶工具酶功能限制性核酸內切酶識別特異序列，切割DNADNA連接酶催化DNA中相鄰的5′磷酸基和3′羥基末端之間形成磷酸二酯鍵，使DNA切口封合或使兩個DNA分子或片段連接DNA聚合酶Ⅰ合成雙鏈cDNA分子或片段連接缺口平移制作高比活探針DNA序列分析填補3′末端Klenow片段又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的5

3

聚合、35

外切活性，而無53

外切活性。常用于cDNA第二鏈合成，雙鏈DNA3末端標記等反轉錄酶合成cDNA替代DNA聚合酶I進行填補，標記或DNA序列分析多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸5′羥基末端磷酸化，或標記探針末端轉移酶在3′羥基末端進行同質多聚物加尾堿性磷酸酶切除末端磷酸基限制性核酸內切酶定義限制性核酸內切酶(restrictionendonuclease,RE)是識別DNA的特異序列,并在識別位點或其周圍切割雙鏈DNA的一類內切酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠ作用與甲基化酶共同構成細菌的限制修飾系統，限制外源DNA，保護自身DNA。分類Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ（基因工程技術中常用Ⅱ型）第一個字母取自產生該酶的細菌屬名，用大寫；第二、第三個字母是該細菌的種名，用小寫；第四個字母代表株；用羅馬數字表示發現的先后次序。命名HindⅢ

屬

系

株序Haemophilusinfluenzaed株流感嗜血桿菌d株的第三種酶Ⅱ類酶識別序列特點——

回文結構(palindrome)

切口：平端切口、粘端切口GGATCCCCTAGGBamHⅠGTCCAGGCCTAGGATCCG+GGATCCCCTAGGHindⅡGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口粘端切口同功異源酶來源不同的限制酶，但能識別和切割同一位點，這些酶稱同功異源酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠGGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BstⅠ同尾酶有些限制性內切酶雖然識別序列不完全相同，但切割DNA后，產生相同的粘性末端，稱為同尾酶。這兩個相同的粘性末端稱為配伍未端(compatibleend)。BamHⅠBglⅡGGATCCCCTAGGAGATCTTCTAGAGCCTAGGATCCG++ATCTAG

GATCTA（三）目的基因

cDNA(complementaryDNA)基因組DNA(genomicDNA)（四）基因載體定義為攜帶目的基因，實現其無性繁殖或表達有意義的蛋白質所采用的一些DNA分子。常用載體質粒DNA噬菌體DNA病毒DNA克隆載體(cloningvector)為使插入的外源DNA序列被擴增而特意設計的載體稱為克隆載體。表達載體(expressionvector)為使插入的外源DNA序列可轉錄翻譯成多肽鏈而特意設計的載體稱為表達載體。載體的選擇標準能自主復制；具有兩個以上的遺傳標記物，便于重組體的篩選和鑒定；有克隆位點（外源DNA插入點），常具有多個單一酶切位點，稱為多克隆位點；分子量小，以容納較大的外源DNA。1.質粒

(plasmid)特點能在宿主細胞內獨立自主復制；帶有某些遺傳信息,會賦予宿主細胞一些遺傳性狀。重組DNA技術中常用的工具酶hix為反向重復序列，它們之間的H片段可在Hin控制下進行特異位點重組(倒位)。原核表達體系（E.真核表達體系酵母、昆蟲、乳類動物細胞1997年英國羅林研究所成功的克隆了多莉重組DNA技術的發展史轉導作用(transduction)限制性核酸內切酶(restrictionendonuclease,RE)是識別DNA的特異序列,并在識別位點或其周圍切割雙鏈DNA的一類內切酶。λgt系列（插入型，適用cDNA克隆）（二）克隆載體的選擇和構建一、重組DNA技術相關概念沙門氏菌H片段倒位決定鞭毛相轉變λ噬菌體DNA改造系統λgt系列（插入型，適用cDNA克隆）EMBL系列（置換型，適用基因組克隆）2.噬菌體(phage)

M13噬菌體DNA改造系統（含lacZ基因）M13mp系列pUC系列3.粘性質粒(cosmid)酵母人工染色體

(yeastartificialchromosome,YAC)細菌人工染色體

(bacterialartificialchromosome,BAC)動物病毒DNA改造的載體（如腺病毒，腺病毒相關病毒，逆轉錄病毒）其他二、重組DNA技術基本原理基本原理目的基因的獲取DNA導入受體菌外源基因與載體的連接克隆載體的選擇和構建重組體的篩選克隆基因的表達

以質粒為載體的DNA

克隆過程（一）目的基因的獲取1.化學合成法要求：已知目的基因的核苷酸序列或其產物的氨基酸序列。2.基因組DNA文庫(genomicDNAlibrary)3.cDNA文庫(cDNAlibrary)4.聚合酶鏈反應(polymerasechainreaction,PCR)

（見第22章）*化學合成法獲取目的基因由已知氨基酸序列推測可能的DNA序列組織或細胞染色體DNA基因片斷克隆載體重組DNA分子含重組分子的轉化菌限制性內切酶受體菌基因組DNA文庫存在于轉化細胞內由克隆載體所攜帶的所有基因組DNA的集合*從基因組DNA文庫獲取目的基因這兩個相同的粘性末端稱為配伍未端(compatibleend)。hix為反向重復序列，它們之間的H片段可在Hin控制下進行特異位點重組(倒位)。重組DNA技術操作過程可形象歸納為三、重組技術與醫學的關系位點特異的重組(site-specificrecombination)由平端加上新的酶切位點，再用限制酶切除產生粘性末端，而進行粘端連接。Holliday模型中，同源重組主要4個關鍵步驟一、重組DNA技術相關概念coli表達體系的不足例（二）細菌的特異位點重組不同限制酶切位點（非配伍末端）的連接感染(infection)此重排的重組酶基因rag(recombinationactivatinggene)共有兩個，分別產生蛋白質RAG1和RAG2。質粒(plasmid)缺口平移制作高比活探針顯微注射為攜帶目的基因，實現其無性繁殖或表達有意義的蛋白質所采用的一些DNA分子。（三）外源基因與載體的連接1.粘性末端連接方式：(1)同一限制酶切位點連接(2)不同限制酶切位點連接配伍末端連接非配伍末端連接（二）克隆載體的選擇和構建BamHⅠ切割反應

GGATCCCCTAGGT4

DNA連接酶15oCGATCCGGCCTAG+目的基因用BamHⅠ切割載體DNA用BamHⅠ切割重組體載體自連目的基因自連同一限制酶切位點連接不同限制酶切位點（非配伍末端）的連接EcoRⅠ切割位點Bg

lⅡ切割位點+EcoRⅠ+Bg

lⅡ雙酶切EcoRⅠ+Bg

lⅡ雙酶切T4

DNA連接酶15oC重組體配伍末端的連接情況和同一限制酶切位點連接相似。2.平端連接適用于：限制性內切酶切割產生的平端粘端補齊或切平形成的平端目的基因載體限制性內切酶限制性內切酶T4DNA連接酶15oC重組體載體自連目的基因自連3.同聚物加尾連接在末端轉移酶(terminaltransferase)的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再進行粘端連接。5′3′3′5′載體DNA5′3′3′5′目的基因限制酶或機械剪切限制酶5′3′3′5′5′3′T(T)nT

T(T)nT3′5′5′

3′3′5′5′3′A(A)nA

A(A)nA3′5′λ-核酸外切酶λ-核酸外切酶末端轉移酶+dATP末端轉移酶+dTTPT(T)nTA(A)nAA(A)nAT(T)nTT4

DNA連接酶15oC重組體4.人工接頭(linker)連接由平端加上新的酶切位點，再用限制酶切除產生粘性末端，而進行粘端連接。

人工接頭及其應用CCGAATTCGGGCTTAAGC5′-3′-EcoRⅠEcoRⅠEcoRⅠEcoRⅠ受體菌條件安全宿主菌限制酶和重組酶缺陷處于感受態(competent)

導入方式轉化(transformation)轉染(transfection)感染(infection)（四）重組DNA導入受體菌（五）重組體的篩選

1.直接選擇法(1)

抗藥性標記選擇(2)標志補救(markerrescue)(3)分子雜交法原位雜交Southern印跡

2.免疫學方法如免疫化學方法及酶免檢測分析等(插入失活法)抗藥性標記選擇α互補α互補的檢測原位雜交Southern印跡雞的β肌球蛋白的克隆和檢出重組DNA技術操作過程可形象歸納為小結分分離目的基因切限制酶切目的基因與載體接拼接重組體轉轉入受體菌篩篩選重組體重組DNA技術操作的主要步驟載體質粒噬菌體病毒目的基因（外源基因）基因組DNAcDNA人工合成PCR