第2節

微生物的培養技術及應用一生物的基本培養技術（第1課時）第1章發酵工程在制作過程中有雜菌混入容器和原料滅菌接種純的菌種在無菌條件下操作思考1：失敗的原因是什么？思考2：怎樣才能保證無處不在的雜菌不混入發酵物中呢？避免雜菌進入①制作工具和原料進行消毒滅菌②接種純的單一菌種③控制發酵條件（如制作泡菜時創造無氧環境），避免雜菌繁殖從社會中來肉眼難以看清，需要借助光學顯微鏡或電子顯微鏡才能觀察到的一切微小生物的總稱，包括細菌、真菌和病毒等。無細胞結構原核細胞真核細胞微生物：單細胞真菌：酵母菌、毛霉等；原生生物：草履蟲、變形蟲等微生物的類群病毒：SARS病毒、新冠病毒等RNA病毒；噬菌體等DNA病毒細菌：藍細菌、大腸桿菌、乳酸菌、根瘤菌、硝化細菌；放線菌、支原體、衣原體等相關信息（P9）本章提及的微生物主要指用于發酵所用的細菌和真菌。

微生物結構簡單、形體微小，眼睛看不到，若想看某種純凈的微生物。我們該怎么做？若想通過肉眼能看到細菌，我們又該如何？

必須對其進行分離純化；分散的微生物在適宜的瓊脂固體培養基表面或內部生長，可以形成肉眼可見的菌落。

分散的微生物在適宜的固體培養基表面或內部可以繁殖形成以母細胞為中心的一團肉眼可見的、有一定形態結構的子細胞群體，這就是菌落。由單個微生物繁殖形成的純培養物就是一個單菌落；

一個單菌落就是一個種群501培養基的配置菌落是鑒定菌種的重要依據。細菌放線菌霉菌酵母菌特征：形狀、大小、顏色、光澤度、透明度等。單個或少數同種菌體在固體培養基上大量繁殖，形成肉眼可見的子細胞群體。實驗室培養微生物的條件:防止雜菌污染，獲得純凈的微生物培養物是研究和應用微生物的前提，也是發酵工程的重要基礎。——培養基——無菌技術一、要為人們需要的微生物提供合適的營養和環境條件；二、要確保其他微生物無法混入，并將需要的微生物分離出來。（一）培養基的配制1.什么是培養基？2.培養基的用途有哪些？培養基的種類有哪些？3.培養基的必備營養成分有哪些？4.配制培養基時，如何滿足不同微生物的特殊需求？舉例說明。【自主探究】請同學們閱讀教材P9-10，完成以下問題：

培養基的配置人們按照微生物對

的不同需求，配制出供其

的營養基質。營養物質生長繁殖①培養、分離、鑒定、保存微生物。②積累其代謝物。1.概念：2.作用：3.類型：（1）按物理性質分：液體培養基固體培養基不含瓊脂半固體培養基無動力含0.2%-0.5%瓊脂含1.5%-2.5%瓊脂擴大培養、工業生產觀察微生物的運動、分類鑒定（有無鞭毛）微生物分離、鑒定、活菌計數、保藏菌種瓊脂在98℃以上熔化，在44℃以下凝固有動力(彌散)凝固劑，不提供能量和營養3.類型：（2）按化學成分分：培養基的配置作用：用于實驗室中進行的營養、代謝、遺傳、鑒定和生物測定等定量要求較高的研究培養細菌常用的肉湯蛋白胨培養基:牛肉膏3g，蛋白胨5g，水1000mL。培養真菌的察氏培養基硝酸鈉3g，磷酸氫二鉀1g，硫酸鎂(MgSO4·7H2O)

0.5g，氯化鉀0.5g，硫酸亞鐵0.01g，蔗糖30g，瓊脂15~20g，蒸餾水1000mL，pH自然或7.0~7.2。作用：配制實驗室常用培養基和工業生產合成培養基：用已知的化學物質配制天然培養基：含有化學成分還不清楚或化學成分不明確的天然有機物。天然培養基合成培養基3.類型：（3）按用途分：培養基的配置選擇培養基：鑒別培養基：在培養基中加入某種化學物質，以抑制不需要的微生物的生長，促進所需要的微生物的生長。將某種類微生物從混雜的微生物群體中分離出來。加入能與目的菌的代謝產物發生顯色反應的指示劑。用于鑒別不同類型的微生物。基礎培養基：含一般微生物生長繁殖所需要的基本營養物質耐高濃度食鹽的金黃色葡萄球菌伊紅-美藍培養基能與大腸桿菌代謝物反應，出現帶金屬光澤的深紫色菌落標準培養基種類培養基特點作用物理性質固體培養基加凝固劑，如瓊脂、明膠

微生物的分離與鑒定，活菌計數，保藏菌種半固體培養基加凝固劑，如瓊脂。容器放倒不致流出，劇烈震動則破散觀察微生物的運動、分類鑒定液體培養基不加凝固劑常用于擴大培養，工業生產用途選擇培養基允許特定種類的微生物生長，同時抑制或阻止其他種類微生物生長培養、分離出特定微生物鑒別培養基在培養基中加入某種指示劑或化學藥品,用以鑒別不同種類的微生物鑒別不同種類微生物成分來源天然培養基含化學成分不明確的天然物質工業生產合成培養基培養基成分明確分類鑒定人們按照微生物對

的不同需求，配制出供其

的營養基質。營養物質生長繁殖培養基：（2）異化作用（分解代謝）：是指生物體能夠把自身的一部分物質加以分解，

出其中的能量，并且把分解的終產物排出體外的變化過程。知識補充：代謝類型1.新陳代謝概念機體與內環境之間的物質和能量交換以及生物體內物質和能量的自我更新過程。是生物體內全部有序的化學變化的總稱。（1）同化作用(合成代謝)：是指生物體把從外界環境中獲取的營養物質轉變成自身的組成物質，并且

能量的變化過程。根據生物體在同化作用過程中能不能利用無機物制造有機物自養型：異養型：綠色植物、光合細菌、硝化細菌、鐵細菌、硫細菌等動物、大多數細菌和真菌等根據生物體在異化作用過程中對氧的需求情況需氧型：厭氧型：兼性厭氧型：絕大多數動植物、好氧型細菌、大多數真菌等乳酸菌、破傷風桿菌、及動物體內寄生蟲（蛔蟲）等酵母菌儲存釋放4.培養基的營養構成：無機碳源：（1）碳源（提供碳元素）（2）氮源（提供氮元素）氮是微生物合成蛋白質、核酸等物質的元素。有機碳源：糖類、脂質、蛋白質、有機酸、石油等CO2、CO32-、HCO3-等異養微生物有機氮源：牛肉膏、蛋白胨、尿素CO(NH2)2、氨基酸等

無機氮源：NH4＋、NO3-、N2、NH3等功能：①調節PH

功能：①良好的溶劑①構成細胞結構物質和一些代謝產物

②有機碳既是碳源又是能源物質（1）主要營養物質：碳源、氮源、水、無機鹽自養微生物（4）水（3）無機鹽功能：②維持滲透壓②維持生物大分子結構的穩定（結合水）功能：一般情況下一般情況下，不添加氮源培養基可用來培養固氮微生物有些無機鹽離子可以作為化能合成菌的能源（如鐵細菌）①

含有C、H、O、N的有機物可作為異養型微生物的碳源、氮源、能源。②

自養型微生物與異養型微生物培養基的主要差別在于碳源。自養型微生物所需的碳源來自無機碳源，異養型微生物所需的碳源來自有機碳源，因此可以根據培養基中營養物質判斷微生物的代謝類型。③無機氮源不但能給自養型微生物提供氮源，也能作為能源物質，如NH3既作為硝化細菌的氮源，也作為能源（NH3氧化釋放的化學能）。④微生物常用的碳源是糖類，尤其是葡萄糖；常用的無機氮源是銨鹽、硝酸鹽特別提醒3.含有C、H、O、N的有機物可作為

微生物的碳源、氮源、能源；微生物碳源氮源能源藍細菌硝化細菌根瘤菌大腸桿菌CO2NH4＋、NO3-等光能CO2NH3NH3氧化的化學能糖類等有機物N2有機物中的化學能糖類、蛋白質等有機物蛋白質、NH4＋、NO3-等有機物中的化學能1.自養型微生物與異養型微生物培養基的主要差別在于

；

自養型微生物所需的碳源來自

碳源，

異養型微生物所需的碳源來自

碳源2.無機氮源不但能給有些自養型微生物提供

，也能作為

，碳源氮源能源物質異養型NH3：既是硝化細菌的氮源，又是它的能源物質光能自養化能自養異養、固氮菌異養4.同一種物質不能既做碳源又做氮源（

）牛肉膏或蛋白胨，可為異養微生物提供碳源和氮源×思考討論無機有機（2）特殊需求：培養基還需要滿足微生物生長對pH、特殊營養物質以及氧氣的需求。④培養厭氧微生物時，需要提供

的條件。①培養乳酸桿菌時，需要在培養基中添加

；②培養霉菌時，需要將培養基調至

；③培養細菌時，需要將培養基調至

；維生素酸性中性或弱堿性無氧主要指生長因子：維生素、氨基酸、嘌呤、嘧啶等思考：所有微生物是否都可以用培養基進行培養?否。病毒是沒有細胞結構的微生物,必須在活細胞內寄生并以復制的方式增殖,因此不能用培養基進行培養。生長因子：通常是指微生物自身不能合成或合成量不足，但又是微生物生長和代謝所必需的小分子。4.培養基的營養構成：5.培養基的配制原則目的要明確：根據培養的微生物種類、培養的目的等確定培養基的類型和配置量。營養要協調：培養基中各營養物質的濃度和比例要適宜碳氮比為4:1時，谷氨酸棒狀桿菌大量繁殖，谷氨酸產量少；碳氮比為3:1時，菌體繁殖受抑制，谷氨酸合成量大增。物理、化學條件要適宜：要先考慮培養基的pH和滲透壓。為維持pH的相對恒定，可在培養基中加入緩沖劑，常用K2HPO4－KH2PO4細菌培養基呈中性或微堿性；霉菌培養基呈酸性。考慮培養目的：考慮是要培養菌體還是要積累菌體代謝物，是實驗室培養還是大規模發酵等問題。培養基的配置培養基的配置01(1)牛肉膏和蛋白胨來源于動物，含有糖、維生素和有機氮等營養物質()(2)所有微生物在培養時，培養基中都需加入氮源()(3)培養不同微生物的培養基成分完全一樣()√××培養不同微生物的培養基成分不完全一樣：如：①培養自養微生物的培養基不需要碳源；

②培養固氮菌的培養基中可以不添加氮源；培養固氮菌（可以利用空氣中的N2）的培養基中可以不添加氮源；具體處理原理目的選擇培養基加入青霉素青霉素能抑制細菌生長，對真菌無作用不加氮源固氮微生物能利用空氣中的氮氣不加有機碳源自養型微生物能利用無機碳源鑒別培養基加入酚紅培養基尿素被分解產生氨，培養基呈堿性，酚紅指示劑變紅。加入剛果紅剛果紅與纖維素能形成紅色復合物，當纖維素被分解后，復合物就無法形成，培養基中會出現以菌落為中心的透明圈。分離酵母菌、霉菌等真菌分離固氮菌分離自養微生物鑒別分解尿素的細菌鑒別纖維素分解菌

對培養基的成分進行控制可以起到不同的作用：名稱主要用途主要化學物質特征性變化伊紅-亞甲藍瓊脂培養基鑒別大腸桿菌伊紅、亞甲藍出現金屬光澤的深紫色菌落剛果紅培養基鑒別纖維素分解菌剛果紅、纖維素纖維素被分解后出現透明圈油脂培養基鑒別產脂肪酶菌株食用油、吐溫、中性紅指示劑由淡紅色變成深紅色淀粉培養基鑒別產淀粉酶菌株可溶性淀粉淀粉被分解后出現淀粉水解圈酚紅指示劑鑒別分解尿素菌株酚紅產生紅色（拓展）鑒別培養基的類型（二）無菌技術1.獲得純凈的微生物培養物的關鍵？2.無菌技術包括什么？消毒和滅菌的概念？

消毒和滅菌都能殺死所有的微生物嗎？3.消毒和滅菌的原理有哪些？常用的消毒和滅菌方法？3.已滅菌的材料用具應注意什么？如何避免周圍環境微生物的污染？4.(旁欄思考)無菌技術除用來防止培養物被污染外，還有什么作用？【自主探究】請同學們閱讀教材P10-11，完成以下問題：

獲得純凈的微生物培養物的關鍵是什么？思考防止雜菌污染。無菌技術應圍繞著如何避免雜菌的污染展開，主要包括消毒和滅菌。兩個方面：消毒對操作的空間、操作者的衣著和手進行清潔和消毒滅菌將用于微生物培養的器皿、接種用具和培養基等進行滅菌。1.獲得純凈的微生物培養物的關鍵是2.無菌技術應圍繞著如何避免雜菌的污染展開，主要包括

防止雜菌污染。消毒和滅菌。無菌技術無菌技術除用來防止實驗室的培養物被其他外來微生物污染外，還有什么作用？無菌技術還能有效避免操作者被微生物感染。【注意事項】p10最后一段①實驗操作時應避免已經滅菌處理的材料用具與周圍的物品

。②為避免周圍環境中微生物的污染，實驗操作應在：

。超凈工作臺上并在酒精燈火焰附近進行相接觸煮沸消毒法巴氏消毒法化學藥物消毒法紫外線消毒100℃煮5~6min。可殺死微生物的營養細胞和一部分芽孢。62~65℃煮30min或72~76℃下處理15S或80~85℃處理10~15S。可殺死絕大部分微生物，不破壞食物的營養成分。用75%酒精擦拭雙手、用氯氣消毒水源等。對接種室、接種箱或超凈工作臺用紫外線照射30min，以殺死物體表面或空氣中的微生物。3常用的消毒方法無菌技術利用高溫導致蛋白質變性，從而導致微生物死亡。利用化學藥物殺死各種微生物紫外線破壞微生物的DNA結構生物消毒法：指利用微生物或其代謝物除去環境中的部分微生物的方法。

例如，有的微生物能夠寄生于多種細菌體內，使細菌裂解，因此可以用它們來凈化污水、污泥。操作的空間、操作者的衣著和手指使用強烈的理化方法殺死物體內外所有的微生物，包括芽孢和孢子。芽孢：有些細菌在一定的條件下，細胞里面形成一個橢圓形的休眠體，叫做芽孢。孢子：某些生物的繁殖體細菌、原生動物、真菌和植物等產生的一種有繁殖作用的無性生殖細胞。能直接發育成新個體。芽孢和孢子具有高度的耐熱性，可抗化學藥物和抗輻射滅菌1.概念：常用的消毒和滅菌方法4常用的滅菌方法無菌技術①濕熱滅菌：利用沸水、流通蒸汽或高壓蒸汽進行滅菌的方法。高壓蒸汽滅菌：（效果最好）實驗室常用高壓蒸汽滅菌鍋，在壓力100kPa、溫度121℃條件下，維持15-30min原理：對象：優點：高溫蒸汽破壞蛋白質、核酸等結構使其變性操作簡便，效果可靠，可以殺滅所有的生物，包括最耐熱的某些微生物的休眠體。基本保持培養基的營養成分不破壞。培養基、部分塑料制品高壓蒸汽滅菌鍋用于培養微生物的器皿、接種用具和培養基注：使用后的培養基必須滅菌后才能丟棄，以免污染環境。②干熱滅菌：干熱滅菌箱內，在160-170℃的熱空氣中維持下2-3h達到滅菌目的原理：使微生物細胞膜破壞、蛋白質變性和原生質干燥等對象：耐高溫，需保持干燥的物品玻璃器皿（如試管、培養皿、吸管、注射器等）金屬器具（如針頭、鑷子、剪刀等）4常用的滅菌方法無菌技術干熱滅菌箱③灼燒滅菌：4常用的滅菌方法無菌技術

酒精燈火焰灼燒最徹底充分燃燒層

（外焰）使微生物燃燒a.接種工具如接種環、涂布器b.接種過程中的試管口或瓶口等易被污染部位效果：原理：對象：涂布器類型適用范圍操作方法消毒較為溫和理化生方法，殺死部分微生物（不包括芽孢、孢子）。煮沸消毒法日常生活（如家庭餐具）100℃煮沸5～6min巴氏消毒法不耐高溫的液體（如：牛奶、啤酒、果酒、醬油等）62～65℃消毒30min或80～90℃消毒30s～1min化學藥物用于皮膚、傷口、動植物組織表面；空氣、手術器械、塑料或者玻璃器皿等用體積分數為70%-75%酒精擦拭雙手、用氯氣消毒水源紫外線照射紫外線照射30min接種室、接種箱，超凈工作臺。常用的消毒方法小結類型適用范圍操作方法滅菌強烈的理化方法，殺死所有微生物（包括芽孢、孢子）。灼燒滅菌接種的金屬工具、接種時用的試管口或瓶口等直接在酒精燈火焰的充分燃燒層灼燒干熱滅菌耐高溫、需要保持干燥的物品,如玻璃器皿和金屬用具等物品放入干熱滅菌箱,160～170℃加熱2～3h濕熱滅菌培養基、培養皿等，生產和實驗室常用高壓蒸汽滅菌鍋內,100kPa，溫度121℃,15～30min。常用的滅菌方法小結項目消毒滅菌作用強度較為____

的物理、化學因素消滅微生物的數量物體表面或內部

微生物物體內外的

微生物能否消滅芽孢、孢子消滅

芽孢能消滅

芽孢和孢子適用對象操作空間、操作者的衣著和手等接種環、接種針、玻璃器皿、培養基等常用方法溫和強烈一部分所有比較：消毒與滅菌部分全部