蛋白質工程的原理和應用基因工程ThebasictoolsofrecombinantDNAtechnology從社會中來Fromsociety你見過用細菌畫畫嗎?右圖是用發出不同顏色熒光的細菌“畫”的美妙圖案。這些細菌能夠發出熒光，是因為在它們的體內導入了熒光蛋白的基因。最早被發現的熒光蛋白是綠色熒光蛋白，科學家通過改造它，獲得了黃色熒光蛋白等。這些熒光蛋白在細胞內生命活動的檢測、腫瘤的示蹤研究等領域有著重要應用。從社會中來Fromsociety熒光蛋白發出的光穿透性極強，即使蛋白質位于小動物體內深處，其發出的光也可以穿透生物體外界看到。在癌癥研究過程中，熒光蛋白的出現使得科學家們能夠觀測到腫瘤細胞的具體活動，比如癌細胞的成長、入侵、轉移和新生。那么，科學家是怎樣對蛋白質分子進行設計和改造的呢?從社會中來Fromsociety綠色熒光蛋白結構綠色熒光蛋白功能相互關系晶體學、分子生物學和計算機技術等掌握改造綠色熒光蛋白基因黃色熒光蛋白功能表達依據對蛋白質分子的設計和改造是通過蛋白質工程來實現的。蛋白質工程Proteinengineering指以蛋白質分子的結構規律及其與生物功能的關系作為基礎，通過改造或合成基因，來改造現有蛋白質，或制造一種新的蛋白質，以滿足人類生產和生活的需求。1.定義蛋白質發揮功能必須依賴正確的高級結構，而蛋白質的高級結構是十分復雜、難度很大的工程。2.困難蛋白質工程是在基因工程的基礎上，延伸出來的第二代基因工程，是涉及多學科的綜合科技工程。目錄蛋白質工程崛起的緣由Theriseofproteinengineering01蛋白質工程的基本原理Basicprinciplesofproteinengineering02蛋白質工程的應用Applicationofproteinengineering03Exercisestoconsolidate習題鞏固04蛋白質工程崛起的緣由Theriseofproteinengineering第一部分蛋白質工程崛起的緣由Theriseofproteinengineering1.緣由基因工程原則上只能生產自然界已存在的蛋白質(天然蛋白質)天然蛋白質不一定完全符合人類生產和生活的需要需要對天然蛋白進行改造產生更符合人類需要的蛋白質蛋白質工程崛起的緣由Theriseofproteinengineering2.實例賴氨酸合成調控達到一定濃度兩種酶的活性352位的蘇氨酸變成異亮氨酸二氫吡啶二羧酸合成酶天冬氨酸激酶+104位的天冬酰胺變成異亮氨酸賴氨酸含量抑制提高提高限制提高提高5倍提高2倍蛋白質工程Proteinengineering你知道人類蛋白質組計劃嗎？它與蛋白質工程有什么關系？我國科學家承擔了什么任務？

人類蛋白質組計劃是繼人類基因組計劃之后，生命科學乃至自然科學領域重大的國際合作科研項目。2001年，國際人類蛋白質組組織宣布成立。2003年，該組織正式提出啟動兩項重大國際合作項目：一項是由中國科學家牽頭執行的“人類肝臟蛋白質組計劃”；另一項是由美國科學家牽頭執行的“人類血漿蛋白質組計劃”，由此拉開了人類蛋白質組計劃的帷幕。“人類肝臟蛋白質組計劃”是國際上第一個人類組織器官的蛋白質組計劃，由我國賀福初院士牽頭，這是中國科學家第一次領銜重大國際科研協作計劃。蛋白質工程Proteinengineering

它的目標是通過對肝臟蛋白質高通量、規?；难芯?，解析肝臟蛋白質在生理、病理過程中的功能意義，為重大肝病的預防、診斷、治療和新藥的研發提供重要的科學依據。2010年，該計劃“兩譜、兩圖、三庫”的目標初步實現。我國科學家完成了人類肝臟蛋白質組表達譜和修飾譜，繪制了蛋白質相互作用連鎖圖和定位圖?！叭龓臁眲t是建立符合國際標準的肝臟標本庫、發展規?；贵w制備技術并建立肝臟蛋白質抗體庫和建立完整的肝臟蛋白質組數據庫。人類蛋白質組計劃取得的成果有力推動了蛋白質工程的發展，為它提供了重要的理論支持。2014年6月，中國人類蛋白質組計劃啟動。蛋白質工程的基本原理Basicprinciplesofproteinengineering第二部分蛋白質工程的基本原理Basicprinciplesofproteinengineering1.蛋白質工程的目標：

根據人們對蛋白質功能的特定需求，對蛋白質的結構進行設計改造。2.改造蛋白質的方法：改造或合成基因對天然的蛋白質進行改造，為什么不是直接對蛋白質分子進行操作，還是通過對基因的操作來實現的？①基因決定蛋白質的合成，改造基因即為改造蛋白質；②改造基因可以遺傳，改造蛋白質無法遺傳；③改造基因比改造蛋白質更容易操作。蛋白質工程的基本原理——基因工程的思路Basicprinciplesofproteinengineering——Geneticengineeringideas基因mRNA轉錄翻譯具有特定氨基酸序列的多肽鏈具有高級結構的蛋白質行使生物功能盤曲折疊按照中心法則進行蛋白質工程的基本原理——蛋白質工程的思路Basicprinciplesofproteinengineering——Proteinengineeringideas預期的蛋白質功能設計預期的蛋白質結構推測應有的氨基酸序列找到并改變相對應的脫氧核苷酸序列(基因)或合成新的基因獲得所需蛋白質創造出自然界不存在的蛋白質蛋白質工程的基本原理Basicprinciplesofproteinengineering預期功能生物功能分子設計折疊DNA合成翻譯轉錄基因DNA蛋白質結構氨基酸序列mRNA逆中心法則，與天然蛋白質合成的過程相反蛋白質工程的基本原理Basicprinciplesofproteinengineering比較項目蛋白質工程基因工程區別過程實質結果聯系從預期的蛋白質功能出發→設計預期的蛋白質結構→推測應有的氨基酸序列→找到并改變相對應的脫氧核苷酸序列（基因）或合成新的基因→獲得所需要的蛋白質目的基因的篩選與獲取→基因表達載體的構建→將目的基因導入受體細胞→目的基因的檢測與鑒定定向改造或生產人類所需的蛋白質定向改造生物的遺傳特性，以獲得人類所需的新的生物類型和生物產品創造出自然界不存在的蛋白質生產出自然界已有的蛋白質①蛋白質工程是在基因工程的基礎上延伸出來的第二代基因工程②基因工程中所利用的某些酶可以通過蛋白質工程進行修飾、改造蛋白質工程的基本原理Basicprinciplesofproteinengineering如何確定一個操作過程是基因工程技術還是蛋白質工程技術？是否合成新的基因蛋白質工程是否對原有基因進行改造是否是否蛋白質工程基因工程看蛋白質看基因是否為天然蛋白質是否蛋白質工程基因工程蛋白質工程基本思路的應用Applicationofbasicideasinproteinengineering某多肽鏈的一段氨基酸序列是：討論：1.怎樣得出決定這一段肽鏈的脫氧核苷酸序列？請把相應的堿基序列寫出來。每種氨基酸都有對應的密碼子，通過查密碼子表，就可以將編碼上述氨基酸的mRNA序列寫出來，然后根據堿基互補配對原則，就可以將決定這段多肽鏈的脫氧核苷酸的堿基序列寫出來。蛋白質工程基本思路的應用Applicationofbasicideasinproteinengineering第一個堿基第二個堿基第三個堿基UCAGU苯丙氨酸苯丙氨酸亮氨酸亮氨酸絲氨酸絲氨酸絲氨酸絲氨酸酪氨酸酪氨酸終止終止半胱氨酸半胱氨酸終止、硒代半胱氨酸色氨酸UCAGC亮氨酸亮氨酸亮氨酸亮氨酸脯氨酸脯氨酸脯氨酸脯氨酸組氨酸組氨酸谷氨酰胺谷氨酰胺精氨酸精氨酸精氨酸精氨酸UCAGA異亮氨酸異亮氨酸異亮氨酸甲硫氨酸(起始)蘇氨酸蘇氨酸蘇氨酸蘇氨酸天冬酰胺天冬酰胺賴氨酸賴氨酸絲氨酸絲氨酸精氨酸精氨酸UCAGG纈氨酸纈氨酸纈氨酸纈氨酸、甲硫氨酸(起始)丙氨酸丙氨酸丙氨酸丙氨酸天冬氨酸天冬氨酸谷氨酸谷氨酸甘氨酸甘氨酸甘氨酸甘氨酸UCAG蛋白質工程基本思路的應用Applicationofbasicideasinproteinengineering丙氨酸：CGA、CGG、CGT、CGC色氨酸：ACC賴氨酸：TTT、TTC甲硫氨酸：TAC苯丙氨酸：TTT、TTG由于上述氨基酸有多個密碼子，因此需要通過排列組合進行排列。GCU(或C，或A，或G)UGGAAA(或G)GAA(或G)UUU(或C)CGA(或G，或T，或C)ACCTTT(或C)CTT(或C)AAA(或G)mRNADNA編碼鏈蛋白質工程基本思路的應用Applicationofbasicideasinproteinengineering2.確定目的基因的堿基序列后，怎樣才能合成或改造目的基因。確定目的基因的堿基序列后，可以人工合成目的基因或從基因文庫中獲取目的基因。對基因的改造經常會用到基因定點突變技術來進行堿基的替換、增添等。蛋白質工程的技術手段Technicalmeansofproteinengineering借助計算機來建立蛋白質的三維結構模型;利用晶體學技術來獲得蛋白質的結晶體，然后通過X射線衍射技術，分析晶體的結構;用基因的定點突變技術來進行堿基的替換①計算機技術②晶體學、X射線衍射技術③基因定點突變技術蛋白質工程的應用Applicationofproteinengineering第三部分蛋白質工程的應用——在醫藥工業方面Applicationofproteinengineering——Inthepharmaceuticalindustry①實例1：研發速效胰島素類似物天然胰島素易形成二聚體或六聚體預期結構改造B28位脯氨酸替換為天冬氨酸或將它與B29位的賴氨酸交換位置新胰島素基因mRNA折疊預期功能行使功能降低胰島素的聚合作用設計結構改變B鏈第20～29位氨基酸組成推測序列翻譯多肽鏈有效抑制胰島素的聚合轉錄蛋白質工程的應用——在醫藥工業方面Applicationofproteinengineering——Inthepharmaceuticalindustry②實例2：延長干擾素體外保存時間天然干擾素（體外保存困難）改造后的干擾素（-70℃可保存半年）半胱氨酸絲氨酸干擾素在體外保存相當困難將干擾素分子上的一個半胱氨酸變成絲氨酸在-70℃下干擾素可保存半年蛋白質工程的應用——在醫藥工業方面Applicationofproteinengineering——Inthepharmaceuticalindustry③實例3：制備人鼠嵌合抗體醫學問題：小鼠單克隆抗體會使人體產生免疫反應，

從而導致治療效果大大降低解決辦法：通過改造基因，將小鼠抗體上結合抗原的區域

（即可變區）“嫁接”到人的抗體（即恒定區）

上，經過這樣改造的抗體誘發免疫反應的強度就

會減低很多。蛋白質工程的應用——在醫藥工業方面Applicationofproteinengineering——Inthepharmaceuticalindustry鼠抗體人抗體恒定區恒定區可變區可變區嵌合抗體對人體的不良反應減少蛋白質工程的應用Applicationofproteinengineering1.醫藥工業方面①產生速效胰島素②產生易保存的干擾素③生產人鼠嵌合抗體通過基因定點突變一個氨基酸的改變或兩個氨基酸位置互換通過基因定點突變一個氨基酸的改變通過基因片段的拼接兩條多肽片段拼接蛋白質工程的應用——在其他工業方面Applicationofproteinengineering——Inotherindustries枯草桿菌蛋白酶突變體枯草桿菌蛋白酶具有水解蛋白質的作用，因此常被用于洗滌劑工業、絲綢工業等。廣泛用于改進酶的性能或開發新的工業用酶利用蛋白質工程獲得的該酶的突變體已有上百種，從中可能篩選出一些符合工業化生產需求的突變體，從而提高這種酶的使用價值。蛋白質工程的應用——在農業方面Applicationofproteinengineering——Inagriculture①改造某些參與調控光合作用的酶

科學家正在嘗試改造某些參與調控光合作用的酶，以提高植物光合作用的效率，增加糧食的產量。還有科學家將蛋白質工程作為設計優良微生物農藥的新思路，通過改造微生物蛋白質的結構，使它防治病蟲害的效果增強。②改造微生物蛋白質結構，防治害蟲蛋白質工程的難點Difficultiesinproteinengineering蛋白質工程是一項難度很大的工程。主要原因：蛋白質發揮功能必須依賴于正確的高級結構，而這種高級結構往往十分復雜。由計算機建立的血紅蛋白三維結構模型前景展望：科學家要設計出更加符合人類需要的蛋白質，還需要不斷地攻堅克難。隨著科技的深入發展，蛋白質工程將會給人類帶來更多的福祉。異想天開Whimsical能不能根據人類需要的蛋白質的結構，設計相應的基因，導入合適的宿主細胞中，讓宿主，細胞生產人類所需要的蛋白質食品呢?理論上講可以,但目前還沒有真正成功的例子。利用改造后的動物細胞、微生物細胞等可以生產人類需要的蛋白質,但這些蛋白質往往都是自然界中已經存在的蛋白質,并非完全是人工設計出來的、自然界中不存在的蛋白質。異想天開Whimsical主要原因是蛋白質的高級結構非常復雜,人類對大多數蛋白質的高級結構和蛋白質在生物體內如何行使功能了解得還不夠,很難設計出一個全新的而又具有功能的蛋白質。即使設計并獲得了一個全新的蛋白質,它的生理生化特性、用它生產的蛋白質食品的安全性等都需要長期深人的研究。蛋白質食品的工廠化生產想象圖到社會中去Gooutintotheworld酶制劑在食品工業、醫藥工業等方面都有廣泛的應用?，F在，酶制劑的生產已經形成一個市場可觀的新興產業。蛋白質工程的應用又為酶制劑產業的發展提供了強大助力。請查閱資料，了解我國酶制劑產業發展的現狀和趨勢，分析蛋白質工程在酶制劑產業中的作用。酶用作工業催化劑,比無機催化劑具有更大的優越性,主要體現在以下幾個方面。由于酶促反應能在常溫、常壓和中性歸條件下進行,因此可以節省大量的能源和設備投資;生產過程中不會造成嚴重的污染,符合環境保護的要求;生產過程簡單、效率高,產品質量好,生產成本低。因此,酶制劑在工業領域得到了廣泛的應用。到社會中去Gooutintotheworld近年來,通過引進國外先進設備、優良菌種以及開發新型酶制劑,我國酶制劑產業保持了較快的增長態勢,品種越來越豐富,產品的市場競爭力也在不斷提升。2016年,我國工業酶制劑年產量達120萬噸,年增長率保持在10%左右。在全球范圍內,我國酶制劑的市場份額已占到了30%左右,我國進人酶制劑生產大國的行列。在酶制劑產業中,蛋白質工程被廣泛用于開發酶的新品種或改進酶的性能,如提高酶的熱穩定性,增加某些被用作去污劑的酶的去污效率等。習題鞏固Exercisestoconsolidate第四部分習題鞏固Exercisestoconsolidate1.蛋白質工程可以說是基因工程的延伸，

判斷下列相關表述是否正確。(1)基因工程需要在分子水平對基因進行操作，

蛋白質工程不需要對基因進行操作。()(2)蛋白質工程需要改變蛋白質分子的所有氨基酸序列。()(3)蛋白質工程可以改造酶，提高酶的熱穩定性。()××√習題鞏固Exercisestoconsolidate2.蛋白質工程是在深入了解蛋白質分子的結構與功能關系的

基礎上進行的，它最終要達到的目的是()A.分析蛋白質的三維結構B.研究蛋白質的氨基酸組成C.獲取編碼蛋白質的基因序列信息D.改造現有蛋白質或制造新的蛋白質，滿足人類的需求D習題鞏固Exercisestoconsolidate3.水蛭素是一種蛋白質，可用于預防和治療血栓。研究人員發現，用賴氨酸替換水蛭素第47位的天冬酰胺可以提高它的抗凝血活性。在這項替換研究中，目前可行的直接操作對象是()A.基因B.氨基酸C.多肽鏈D.蛋白質A習題鞏固Exercisestoconsolidate4.T4溶菌酶是一種重要的工業用酶，但是它在溫度較高時容易失去活性。為了提高T4溶菌酶的耐熱性，科學家首先對影響T4溶菌酶耐熱性的一些重要結構進行了研究。然后以此為依據對相關基因進行改造，使T4溶菌酶的第3位異亮氨酸變為半胱氨酸。于是，在該半胱氨酸與第97位的半胱氨酸之間形成了一個二硫鍵，T4溶菌酶的耐熱性得到了提高。這項工作屬于什么工程的范疇?在該實例中引起T4溶菌酶空間結構發生改變的根本原因是什么?如果要將該研究成果應用到生產實踐，還需要做哪些方面的工作?習題鞏固Exercisestoconsolidate這項工作屬于蛋白質工程的范疇。引起T4溶菌酶空間結構發生改變的根本原因是基因的堿基序列發生了變化。如果要將改造后的T4溶菌酶應用于生產實踐,還有很多工作需要做。例如,由于改造后酶的空間結構發生了變化,因此它的一些基本特性需要重新明確,包括它能耐受的溫度范圍、催化反應的最適溫度、酶活力的大小等;需要建立規模化生產該酶的技術體系,評估生產成本等。習題鞏固Exercisestoconsolidate1.某動物體內含有研究者感興趣的目的基因，研究者欲將該基因導入大腸桿菌的質粒中保存。該質粒含有氨芐青霉素抗性基因(AmpR)、LacZ基因及一些酶切位點,其結構和簡單的操作步驟如下圖所示。習題鞏固Exercisestoconsolidate請根據以上信息回答下列問題。（1）在第②步中,應怎樣選擇限制酶？應選擇用相同的限制酶或切割能產生相同末端的限制酶切割質粒和含有目的基因的DNA片段，并且注意限制酶的切割位點不能位于目的基因的內部，以防破壞目的基因，限制酶也不能破壞質粒的啟動子、終止子、標記基因、復制原點等結構。（2）在第③步中，為了使質粒DNA與目的基因能連接，還需要在混合物中加入哪種物質？加入DNA連接酶習題鞏固Exercisestoconsolidate（3）選用含有AmpR和LacZ基因的質粒進行實驗有哪些優勢？該質粒便于進行雙重篩選。標記基因AmpR

基因可用于檢測質粒是否導入了大腸桿菌，一般只有導入了質粒的大腸桿菌才能在添加了青霉素的培養基上生長。而由于LacZ

基因的效應，這些生長的菌落可能出現兩種顏色：含有空質粒(沒有連接目的基因的質粒)的大腸桿菌菌落呈藍色；含有重組質粒的大腸桿菌菌落呈白色。習題鞏固Exercisestoconsolidate（4）含有重組質粒的大腸桿菌菌落將呈現什么顏色？為什么？含有重組質粒的大腸桿菌菌落呈白色。

因為目的基因的插入破壞了LacZ基因的結構，使其不能正常表達，形成B-半乳糖苷酶，底物X-gal也就不會被分解。2.科學家將Or3/4、

Sox2、

c-Myc和KIf4

基因通過逆轉錄病毒轉入小鼠成纖維細胞中，然后在培養ES細胞的培養基上培養這些細胞。2-3周后,這些細胞顯示出ES細胞的形態、具有活躍的分裂能力，它們就是iPS細胞。請回答下列問題。習題鞏固Exercisestoconsolidate（1）在這個實驗過程中，逆轉錄病毒的作用是什么？逆轉錄病毒是載體，能將外源基因Oct3/4、Sox2、c-Myc和KIf4送入小鼠成纖維細胞。（2）如何證明iPs細胞的產生不是由于培養基的作用？可以設置對照組。將轉入外源基因和