1T/FDSAXXXX.4—202X中成藥中添加吡羅昔康藥物的快速檢測(cè)拉曼光譜法本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了中成藥中添加吡羅昔康藥物的快速檢測(cè)方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于中藥粉、中藥制劑、中藥膠囊中添加吡羅昔康藥物的快速檢測(cè)。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成對(duì)本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法。3術(shù)語(yǔ)和定義本文件沒(méi)有需要界定的術(shù)語(yǔ)和定義。4原理不同物質(zhì)具有與其分子結(jié)構(gòu)相對(duì)應(yīng)的特征拉曼光譜。一般樣品經(jīng)稀釋，復(fù)雜樣品經(jīng)液液萃取，加表面增強(qiáng)試劑對(duì)信號(hào)增強(qiáng)，進(jìn)行拉曼光譜掃描。與標(biāo)準(zhǔn)譜圖庫(kù)中的吡羅昔康特征拉曼位移（827cm-1±3cm-1,876cm-1±3cm-1,1541cm-1±3cm-1）進(jìn)行匹配識(shí)別，對(duì)樣品中的吡羅昔康進(jìn)行定性判定。5試劑和材料5.1試劑除另有規(guī)定外，試劑均為分析純，水為GB/T6682規(guī)定的一級(jí)水。5.1.1乙酸乙酯，色譜純。5.1.2甲醇，色譜純。5.1.3色素凈化管：2mL離心管配比：0.12g無(wú)水硫酸鎂+0.04g石墨化炭黑。5.1.4堿化試劑：準(zhǔn)確稱取8g氫氧化鈉，用水定容至100mL5.1.5酸化試劑：0.5mol/L硫酸水溶液。5.1.6促凝劑：稱取5.85g氯化鈉，溶于100mL水中，搖勻，備用，或配制成其他相當(dāng)?shù)臒o(wú)機(jī)鹽溶液。5.1.7表面增強(qiáng)試劑：納米金溶膠或相當(dāng)者。避光，4℃~20℃保存，有效期6個(gè)月。2T/FDSAXXXX.4—202X注：表面增強(qiáng)試劑的參考配制方法：納米金溶膠：取100mL0.5.1.8吡羅昔康標(biāo)準(zhǔn)品：C15H13N3O4S，CAS號(hào)：36322-90-4，純度≥98%。5.1.9吡羅昔康標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確稱取標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)0.1000g，甲醇（HPLC）準(zhǔn)確定容至100mL。保證配制樣本濃度為1mg/mL，于4℃避光保存，有效期1個(gè)月。5.2材料5.2.1塑料具塞離心管：2mL和10mL。5.2.2移液吸頭：200μL，1000μL和5000μL。6儀器設(shè)備6.1便攜式拉曼光譜儀穩(wěn)頻激光光源：發(fā)射波長(zhǎng)為785±1nm，線寬<0.1nm，能量≥250mW；光譜分辨率≤10cm-1；光譜響應(yīng)范圍300cm-1~2700cm-1，或大于該響應(yīng)范圍。6.2移液器：100μL、1000μL和5000μL。6.3渦旋振蕩器。6.4離心機(jī)：轉(zhuǎn)速≥10000r/min。6.5電子天平：感量為0.01g和感量為0.0001g。7分析步驟7.1提取7.1.1膠囊、粉類樣品取待測(cè)樣品內(nèi)部粉末0.5g，倒入10mL離心管中；向離心管中加入3000μL乙酸乙酯，渦旋振蕩1分鐘，靜置1分鐘，取1500μL上清液于2mL離心管中，10000轉(zhuǎn)/分鐘離心30秒；取1000μL離心后清液于色素凈化管中，振蕩混勻，10000轉(zhuǎn)/分鐘離心30秒；取離心后液體800μL于2mL離心管，向其中加入600μL去離子水和200μL堿化試劑，振蕩10秒后，10000轉(zhuǎn)/分鐘離心10秒，取離心后下層液體600μL于2mL離心管，向其中加入400μL酸化試劑和500μL乙酸乙酯，振蕩混勻，10000轉(zhuǎn)/分鐘離心10秒，取上層清液待測(cè)。7.1.2藥丸類樣品將待測(cè)樣品用潔凈容器破碎后取0.5g，倒入10mL離心管中；向離心管中加入3000μL乙酸乙酯，渦旋振蕩1分鐘，靜置1分鐘，取1500μL上清液于2mL離心管中，10000轉(zhuǎn)/分鐘離心30秒；取1000μL離心后清液于色素凈化管中，振蕩混勻，10000轉(zhuǎn)/分鐘離心30秒；取離心后液體800μL于2mL離心管，向其中加入600μL去離子水和200μL堿化試劑，振蕩10秒后，10000轉(zhuǎn)/分鐘離心10秒，取離心后下層液體600μL于2mL離心管，向其中加入400μL酸化試劑和500μL乙酸乙酯，振蕩混勻，10000轉(zhuǎn)/分鐘離心10秒，取上層3T/FDSAXXXX.4—202X清液待測(cè)。7.1.3液體類樣品用移液器（或潔凈滴管）吸取1000μL待測(cè)樣品，加入到10mL離心管中；向離心管中加入2000μL乙酸乙酯，渦旋振蕩1分鐘，靜置1分鐘，取1500μL上清液于2mL離心管中，10000轉(zhuǎn)/分鐘離心30秒；取1000μL離心后清液于色素凈化管中，振蕩混勻，10000轉(zhuǎn)/分鐘離心30秒；取離心后液體800μL于2mL離心管，向其中加入600μL去離子水和200μL堿化試劑，振蕩10秒后，10000轉(zhuǎn)/分鐘離心管，向其中加入400μL酸化試劑和500μL乙酸乙酯，振蕩混勻，10000轉(zhuǎn)/分鐘離心10秒，取上層清液待測(cè)。7.2測(cè)定7.2.1拉曼光譜儀器分析參考條件激光能量≥250mW，數(shù)據(jù)采集時(shí)間≥4s。7.2.2表面增強(qiáng)和測(cè)定混勻后立即置于檢測(cè)池中檢測(cè)。7.3質(zhì)控試驗(yàn)每批樣品應(yīng)同時(shí)進(jìn)行陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照試驗(yàn)。7.3.1陰性對(duì)照稱取空白試樣，按照7.1和7.2步驟與樣品同法操作。7.3.2陽(yáng)性對(duì)照準(zhǔn)確稱取空白試樣10g置于15mL具塞離心管中，加入100μL吡羅昔康標(biāo)使待測(cè)樣本濃度為10mg/kg，按照7.1和7.2步驟與樣品同法操作。8結(jié)果計(jì)算和表達(dá)8.1定性儀器軟件將測(cè)試結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)譜圖庫(kù)中的吡羅昔康類進(jìn)行匹配識(shí)別，根據(jù)譜圖827cm-1±3cm-1,876cm-1±3cm-1,1541cm-1±3cm-1處特征拉曼光譜，對(duì)樣品中的吡羅昔康進(jìn)行結(jié)果判定，當(dāng)樣品的拉曼峰包含該目標(biāo)物的2個(gè)以上特征峰判定為陽(yáng)性。陰性代表該樣品不含有吡羅昔康或者低于檢出限，陽(yáng)性則代表該樣品含有吡羅昔康且大于等于檢出限。吡羅昔康表面增強(qiáng)拉曼光譜圖見附錄A.1。8.2確證本方法為初篩方法，當(dāng)檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性時(shí)，應(yīng)用其他技術(shù)手段進(jìn)行確證。9方法性能指標(biāo)4T/FDSAXXXX.4—202X9.1檢出限本方法檢出限為10mg/kg。9.2靈敏度靈敏度應(yīng)≥95%。9.3特異性特異性應(yīng)≥95%。9.4假陰性率假陰性率應(yīng)≤5%。9.5假陽(yáng)性率假陽(yáng)性率應(yīng)≤5%。性能指標(biāo)計(jì)算方法見附錄B中表B.1。5T/FDSAXXXX.4—202X吡羅昔康標(biāo)準(zhǔn)溶液表面增強(qiáng)拉曼光譜圖法圖A.1給出了吡羅昔康標(biāo)準(zhǔn)溶液表面增強(qiáng)拉曼光譜圖及特征位移（827cm-1,876圖A.1吡羅昔康標(biāo)準(zhǔn)溶液表面增強(qiáng)拉曼光譜圖6T/FDSAXXXX.4—202X快速檢測(cè)方法性能計(jì)算表快速檢測(cè)方法性能指標(biāo)計(jì)算表見表B.1。表B.1性能指標(biāo)計(jì)算方法樣品情況a檢測(cè)結(jié)果b總數(shù)N11N12N1.=N11+N12N21N22N2.=N21+N22總數(shù)N.1=N11+N12N.2=N21+N22N=N1.+N2.或N.1+N.2顯著性差異(х2)x2=(|N12-N21|-1)2/(N12+N21),自由度（df）=1靈敏度（p+，%）p+=N11/N1.特異性（p-，%）p-=N22/N2.假陰性率（pf-，%）pf-=N12/N1.=100-靈敏度假陽(yáng)性率（pf+，%）pf+=N21/N2.=100-特異性相對(duì)準(zhǔn)確度，%c（N11+N22）/(N1.+N2.)注：N：任何特定單元的結(jié)果數(shù)，