ICS65.020.30CCSB4312TechnicalspecificationforparentageidentificationDB12/T1189—2023本文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結構和起草規則》的規定起草。本文件由天津市農業農村委員會提出并歸口。本文件起草單位：天津市農業科學院。本文件主要起草人：馬毅、趙欣、陳麗麗、張漫、譚冬飛、趙康、蘆娜、王麗學。IDB12/T1189—2023牛親子鑒定技術規程本文件規定了牛親子鑒定的技術方法。本文件適用于牛（Bostaurus）親子鑒定。2規范性引用文件下列文件中的內容通過文中的規范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實驗室用水規格和實驗方法GB/T27642牛個體及親子鑒定微衛星DNA法NY/T1672綿羊多胎主效基因FecB分子檢測技術規程SN/T1193基因檢驗實驗室技術要求3術語和定義下列術語和定義適用于本文件。3.1等位基因數allele，A反映群體遺傳變異大小的一個指標，其數值越接近所檢測到的等位基因的絕對數，表明等位基因在群體中分布越均勻。3.2期望雜合度heterogosity，He期望雜合度主要是根據種群內當前優勢等位基因的分布頻率來推算的，稀有基因的貢獻極其微弱。3.3多態信息含量polymorphicinformationcontent，PICDNA的多態性指標。Pi和Pj分別為第i個和第j個等位基因頻率，n為等位基因數。3.4排除概率PE在親子鑒定中一個隨機的個體被排除為親生父親的概率，是評價微衛星標記在親子鑒定中實用價值大小的一個指標。1DB12/T1189—2023(1)當沒有另一親本信息時，排除子代與假設親本是親子關系的排除概率：(2)累計排除概率：CPE=1-(1-P1)(1-P2)…(1-Pk)3.5微衛星DNAmicrosatellite又稱短串聯重復序列（STR）或簡單重復序列（SSR一類廣泛存在于真核生物基因組中的，核心序列為2～6bp，重復次數通常為15～30次的DNA串聯重復序列。3.6多重聚合酶鏈反應multiplexPCR又稱多重引物PCR或復合PCR，在同一PCR反應體系中加入兩對以上引物，同時擴增出多個核酸片段的PCR反應。4鑒定原理利用常染色體微衛星分型技術，選取不同染色體上的微衛星位點，采用多重PCR技術擴增微衛星標記，檢測微衛星位點的遺傳多態性，分型得出各位點等位基因的大小，通過軟件統計分析，確定或排除親子關系。5試劑配制水為符合GB/T6682的一級水；高壓滅菌條件為1.034×105Pa壓力，蒸汽滅菌20min。試劑配制如——ACD抗凝劑：檸檬酸0.48g、檸檬酸鈉1.32g、葡萄糖1.47g，定容于100mL水中，高壓滅菌；——10%SDS（十二烷基硫酸鈉）：100gSDS溶于90mL水中，加熱至68℃助溶，用HCl調pH至7.2，定容至1000mL，0.2μm的濾膜過濾，高壓滅菌；——PBS（磷酸緩沖液）：8gNaCl、0.2gKCl、1.44gNa2HPO4、0.24gKH2PO4溶于800mL蒸餾水中，用HCl調pH至7.4，加水定容至1000mL，高壓滅菌，室溫保存；——0.5mol/LNaCl（氯化鈉）：5.844gNaCl溶于雙蒸水中，加水定容至200mL，高壓滅菌；——蛋白酶K（20mg/mL）：200mg蛋白酶K定溶于10mL水中，以1mL分裝，-20℃冷凍保存；——氯仿：異戊醇（24：1）：異戊醇2mL加入到500mL的氯仿試劑瓶中，混勻；——1mol/LTris-HCl（pH=8）：將121.1gTris溶于800mL水中，加濃鹽酸調pH至8.0，容至1000mL，高壓滅菌；——0.5mol/LEDTA（pH=8）：800mL水中加入186.1gEDTA-Na2·2H2O（二水合乙二胺四乙酸二鈉），在磁力攪拌器上劇烈攪拌，用NaOH調節溶液pH至8.0，然后容至1000mL，高壓滅——TE緩沖液：取1mol/LTris-HCl（pH=8）10mL，0.5mol/LEDTA（pH=8）2mL，加水定容至1000mL，高壓滅菌，室溫保存；2DB12/T1189—2023——血樣裂解液：1mol/LTris-HCl（pH=8）1mL，0.5mol/LEDTA（pH=8）20mL，10%SDS5mL，雙蒸水74mL；——精子DNA抽提液：稱取二硫蘇糖醇0.06g與1mL0.5mol/LTris-HCl，0.5mol/LEDTA，0.5mol/LNaCl，2mL10%SDS混合后，補水至10mL；——50×TAE緩沖液：Tris-base242g，冰乙酸57.1mL，0.5mol/LEDTA（pH=8）100mL，加水定容至1000mL。使用時稀釋50倍或100倍即1×TAE；——2%瓊脂糖：2g瓊脂糖充分溶解于50×TAE，定容至100mL；——瓊脂糖電泳上樣緩沖液：0.25%溴酚藍；0.25%二甲苯菁FF；40%蔗糖水溶液；——10×Buffer：0.05%色素溴酚藍；——MgCl2（50mmol/L）：分子量為95.211，計算配制所需固體溶質的質量，用托盤天平稱取固體MgCl2加入一級水溶解；——dNTP（10mmol/L）：dNTP溶于pH為7.0的NaOH貯存液中，最初的貯存液可稀釋到10mol/L，分裝后存放在-20℃冰箱中；——TaqDNA聚合酶：TaqDNA聚合酶長為832個氨基酸,分子量為94Kd。該酶可以廣泛用于PCR、RT-PCR和加尾反應等；——GoldView：可代替溴化乙錠（EB）的新型核酸染料；——6×DNALoadingBuffer：0.05%色素溴酚藍；0.05%二甲苯菁FF；——2000bpDNAMarker：2000DNAMarker是由2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp以及100bp共6條線狀雙鏈DNA片段組成，保存于1×DNALoadingBuffer中，可直接用于電泳分析；——去離子甲酰胺：產品規格：100mL，分子式：CH3NO，分子量：45.04；——四甲基羅丹明（TAMRA）：溶劑：DMSO，儲存條件20。C干燥避光保存有效期為12個月。6儀器設備6.1單道可調移液器0.25～2.5μL、1～10μL、2～20μL。6.2基因擴增儀溫度范圍0～99℃,樣品規格96×0.2mL，反應體積10～100μL。6.3離心機最高轉速12000r/min，最大容量24×1.5mL。6.4恒溫振蕩器0～200r/min，0～60℃。6.5電子天平萬分之一精度。6.6旋渦混合器轉速2800r/min，工作臺直徑110mm。3DB12/T1189—20236.7手持式均質器轉速范圍5000～35000rpm，處理量0.05～100ml。6.8紫外分光光度計波長范圍200～1000nm。6.9凝膠成像分析系統有膠像素1280×1024，檢測靈敏度DNA≥0.05ng。6.10穩壓穩流電泳儀輸出電壓0～600V，輸出電流0～100mA。6.11水平電泳槽外形尺寸182mm×85mm×5mm，凝膠板面積60mm×60mm。6.12高壓滅菌鍋使用溫度范圍45～135℃,最高使用壓力0.255Mpa。6.13自動雙重純水蒸餾器功率3000W，出水量2500mL/h。6.14微波爐容積20L。6.15干燥箱溫控范圍50～300℃,箱內尺寸350mm×350mm×450mm。6.16冰箱7檢測方法7.1樣本采集與保存靜脈采集血樣3～5mL，復方枸櫞酸鈉注射液（ACD）抗凝，4℃可以保存3～5d，-20℃可以保存一個月，-80℃可以保存一年。對公牛，亦可采集2～3劑細管精液，液氮保存。7.2DNA提取按GB/T27642規定的方法執行。7.3DNA濃度和純度檢測按NY/T1672的規定執行。4DB12/T1189—20237.4引物序列引物序列參考聯合國糧農組織（FAO）和國際動物遺傳學會（ISAG）的推薦引物。9個微衛星標記分為4個擴増組合，具體按照附錄A。7.5PCR擴増7.5.1多重PCR擴増體系產物擴增分4次PCR反應完成。同一擴増組合的引物加入同一PCR反應管中，25μL反應體系：10×Buffer2.5μL、50mmol/LMgCl21.2μL、10mmol/LdNTP0.6μL、TaqDNA聚合酶2μL、10μmol/L引物（擴増組合）各1.0μL、待測個體模板DNA（或者陽性對照DNA）100ng、加一級水至反應總體積為25μL。PCR擴增時設計陰性對照（一級水作為模板）。7.5.2PCR擴増條件94℃預變性5min；94℃變性30s，57～60.5℃退火30s，35個循環；72℃延伸5min，4℃保存。7.6PCR產物瓊脂糖凝膠電泳檢測7.6.1先用水清洗制膠板，再用1×TAE沖洗一次，水平放置。7.6.2根據電泳膠板的規格和檢測樣品的數量，配制2%的瓊脂糖溶液，在微波爐中加熱融化至溶液澄清透明，室溫下冷卻至60℃時，加入goldview并混勻，使goldview的終濃度為0.5μg/L。7.6.3將混合液緩慢倒入制膠板中，排除氣泡，插入多齒梳子。待凝膠凝固后，拔出梳子，將凝膠轉移至水平電泳槽中，往電泳槽中加入1×TAE緩沖液，使電泳緩沖液沒過膠面。7.6.4將待檢PCR產物5μL和上樣緩沖液（6×DNALoadingBuffer）以5：1的比例混合均勻，加入點樣孔；同時選擇點樣孔點上5μL2000bpDNAMarker作參照。恒壓100V，電泳30min。電泳結束后于凝膠成像系統觀察，并分析記錄。7.7微衛星DNA多態性分析PCR產物、去離子甲酰胺和TAMRA內標按0.5μL：10μL：0.5μL比例混合，95℃變性15min，遺傳分析儀測序，配套軟件分析微衛星的基因型。FAM、HEX和TANRA分別表示藍色、綠色和黑色。8結果判定8.1多重PCR產物檢測若多重PCR均出現清晰條帶，表明產物擴增成功，可以進行測序，見圖1。5DB12/T1189—2023圖1多重PCR產物2%瓊脂糖凝膠電泳圖8.2微衛星標記分型利用遺傳分析儀對微衛星標記進行基因分型。檢測個體的9個微衛星標記的基因分型結果，根據相對熒光強度和片段大小，可獲得待測個體不同STR標記的基因型。不同親緣關系的個體，其微衛星標記的等位基因大小不同，表現出不同的基因型，陽性對照樣品9個STR標記不同等位基因的大小按附錄B所示。8.3親子關系判定根據待檢個體STR標記的基因型，計算其等位基因數（A）、期望雜合度（He）和多態信息含量（PIC）等指標分析微衛星標記多態性，計算累積非父排除概率（CPE）分析標記的親子鑒定效力（按照附錄C）。根據孟德爾遺傳定律以及STR位點分型來判斷親子關系，如果兩者之間孟德爾錯誤的位點數是0，則判斷為親子關系。9廢棄物處理按照NY/T1672的規定執行。10交叉污染防止措施按照SN/T1193的規定執行。6DB12/T1189—2023（規范性）微衛星基因座及其引物序列微衛星基因座及其引物序列見表A.1。表A.1微衛星基因座及其引物序列1GCTTTCAGAAATAGTTTGCATCTTCACATGATATTACAGCAGAGTAGAGCTACAAGATAATAACTACAGGGTGTTAGATG2AATCACATGGCAAA