3.2基因工程的基本操作程序“抗蟲棉之父”郭三堆蘇云金桿菌通過產生蘇云金桿菌伴胞晶體蛋白(Bt抗蟲蛋白)，破壞鱗翅目昆蟲的消化系統來殺死棉鈴蟲(P76)1.Bt抗蟲蛋白的抗蟲原理？2.抗蟲棉中的Bt抗蟲蛋白會不會對人畜產生危害？P77[相關信息]培育轉基因抗蟲棉一般需要哪些步驟？當Bt抗蟲蛋白被分解為多肽后，多肽與害蟲腸上皮細胞的特異性受體結合，導致細胞膜穿孔，最后造成害蟲死亡Bt抗蟲蛋白只有在某類昆蟲腸道的堿性環境中才能表現出毒性，而人和牲畜的胃液呈酸性，腸道細胞也沒有特異性受體，因此，Bt抗蟲蛋白不會對人畜產生上述影響1997年，我國政府首次批準商業化種植轉基因抗蟲棉。到2015年，我國已育成轉基因抗蟲棉新品種100多個，減少農藥用量40萬噸，增收節支社會經濟效益450億元。

從社會中來培育轉基因抗蟲棉的簡要過程與載體拼接

普通棉花（無抗蟲特性）棉花細胞抗蟲棉

（有抗蟲特性）導入抗蟲基因重組DNA分子1.目的基因的篩選與獲取2.基因表達載體的構建3.將目的基因導入受體細胞4.目的基因的檢測與鑒定表達Bt基因基因工程的基本操作程序將目的基因導入受體細胞目的基因的篩選與獲取基因表達載體的構建目的基因的檢測與鑒定有了目的基因，我們才能賦予一種生物以另一種生物的遺傳特性使目的基因在受體細胞中穩定存在，并可進行遺傳、表達和發揮作用載體進入受體細胞穩定表達，才能實現一種生物的基因在另一種生物中的轉化才能確定目的基因是否真正在受體細胞中穩定遺傳和正確表達（核心）一.目的基因的篩選與獲取(1)概念：在基因工程的設計和操作中，用于改變受體細胞性狀或獲得預期表達產物

等的基因。(2)種類：與生物抗逆性、生產藥物、毒物降解和工業用酶等相關的基因。主要指的是編碼蛋白質的基因，也可以是一些具有調控作用的因子。資料：蘇云金桿菌通過產生蘇云金桿菌伴胞晶體蛋白（Bt抗蟲蛋白），破壞鱗翅目昆蟲的消化系統來殺死棉鈴蟲。科學家將“殺蟲基因”轉入棉花中，棉花產生Bt抗蟲蛋白抵抗蟲害。目的基因(Bt抗蟲蛋白基因，簡稱:Bt基因)那么，如何篩選目的基因呢？1、目的基因用蘇云金桿菌制成的生物殺蟲劑廣泛用于防治棉花蟲害也對Bt基因的表達產物——Bt抗蟲蛋白有了較為深入的了解蘇云金桿菌的殺蟲作用與Bt基因有關不僅掌握了Bt基因的序列信息Bt基因是培育轉基因抗蟲棉較為合適的目的基因一.目的基因的篩選與獲取2、①篩選合適的目的基因從相關的已知結構和功能清晰的基因中進行篩選是較為有效的方法之一。測序技術測定核酸和蛋白質序列序列數據庫以堿基順序或氨基酸殘基順序為基本內容的分子生物信息數據庫序列比對工具把感興趣的序列跟已經存在的序列數據庫進行比較的工具。通過比對識別相關的序列，從而能獲得目的基因和蛋白質的功能認識基因結構和功能的技術方法:隨著測序技術的發展，以及序列數據庫(GenBank)、序列比對工具(如BLAST)、公共生物醫學數據庫、分析分子及基因組數據的軟件工具NCBI等的應用，越來越多的基因的結構和功能為人們所知，為找到合適的目的基因提供了更多的機會和可能。明確了目的基因后，該怎么獲得它呢？基因1基因2基因3基因通常是有遺傳效應的DNA片段DNA片段內含子外顯子非編碼區編碼區啟動子終止子真核生物基因放大啟動子終止子原核生物基因非編碼區非編碼區編碼區非編碼區知識鏈接②獲取目的基因的方法利用PCR獲取和擴增目的基因利用PCR獲取和擴增目的基因（常用）人工合成從基因文庫中獲取1.結合體內DNA復制過程，思考PCR的進行需要哪些條件？2.總結出PCR的概念、原理、目的、優點。3.構建出PCR的大致過程。4.PCR擴增為什么需要引物？5.如何對產物進行鑒定？6.PCR技術與DNA復制過程比較？合作探究：請同學們自主閱讀教材P76-77，小組合作思考討論完成問題。

【重溫】DNA體內復制的過程及條件合成子鏈解旋形成新DNA參與的組分在DNA復制中的作用DNA母鏈4種脫氧核苷酸解旋酶DNA聚合酶引物提供DNA復制的模板合成DNA子鏈的原料打開DNA雙鏈催化合成DNA子鏈使DNA聚合酶能夠從引物的3’端開始連接脫氧核苷酸PCR技術：PCR是_______________的縮寫，是一項根據________________的原理，在_____提供參與DNA復制的_________與_________，對______________________進行_________的技術聚合酶鏈式反應DNA半保留復制體外各種組分反應條件目的基因的核苷酸序列大量復制聚合酶鏈式反應DNA半保留復制體外（PCR擴增儀/PCR儀）對目的基因的核苷酸序列進行大量復制原理操作環境目的全稱PCR擴增儀3.利用PCR獲取和擴增目的基因參與的組分在DNA復制中的作用打開DNA雙鏈提供DNA復制的模板合成DNA子鏈的原料催化合成DNA子鏈使DNA聚合酶能夠從引物的3’端開始連接脫氧核苷酸緩沖液（含Mg2+）DNA母鏈4種脫氧核苷酸90℃以上高溫耐高溫的DNA聚合酶引物激活真核細胞和細菌的DNA聚合酶（2種）（Taq酶）PCR技術課本P77-79①體外復制（PCR）的條件905072℃3`5`5`3`耐高溫的DNA聚合酶引物1引物24種脫氧核苷酸模板DNA目的基因主要是DNA單鏈或RNA思考：1、需要引物的原因？需要幾種？化學本質？DNA聚合酶不能從頭合成DNA，只能從引物的3′端開始延伸DNA鏈。2種。2、這2種引物的堿基序列有什么要求？①能與目的基因的一段堿基序列互補配對，通常為20-30個核苷酸；②每種引物內部不能發生局部堿基互補配對（防止環化、折疊等），2種引物之間不能發生局部堿基互補配對。②PCR過程905072℃延伸905072℃變性905072℃退火（復性）PCR儀實質上是一臺自動調控溫度的儀器。3’5’3’5’3’5’3’5’①變性

當溫度上升到90℃以上時，雙鏈DNA解聚為單鏈②復性當溫度下降到50℃左右時，兩種引物通過堿基互補配對與兩條單鏈DNA結合③延伸當溫度上升到72℃左右時，溶液中的4種脫氧核苷酸在耐高溫的DNA聚合酶的作用下，根據堿基互補配對原則合成新的DNA鏈3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’②PCR過程:第二輪循環的產物第三輪的產物3’5’3’5’3’5’3’5’第一輪循環的產物3’5’3’5’PCR擴增過程中引物、原料需要源源不斷的加入。

由于一個循環得到的產物又可以作為下一個循環的模板，因而每一次循環后目的基因的量可以增加一倍。

即成指數形式擴增（約為2n，其中n為擴增循環的次數）。思考:獲取目的基因時至少要經過幾次循環才能分離出目的基因？復性的過程此時會不會出現DNA解開的兩條鏈結合的情況？如何避免？PCR可以擴增mRNA嗎?會，但是概率較低。可以加入足夠多的引物降低概率。3次mRNA不可以直接擴增，需要將它逆轉錄成cDNA再進行擴增。①逆轉錄酶以RNA為模板合成一條與RNA互補的DNA鏈，形成RNA-DNA雜交分子；②核酸酶H降解RNA-DNA雜交分子中的RNA鏈，使之變成單鏈DNA；③以單鏈DNA為模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一條互補的DNA鏈，形成雙鏈DNA分子，即cDNA1、目標片段的DNA分子經PCR反應循環n次，DNA分子有

個。DNA鏈有_____條共需要消耗引物的數量為

個。n代后，完整的目的基因有

個2、運用PCR技術擴增DNA分子時，需經過變性→復性→延伸→重復過程，經過4輪循環后，得到的子代DNA分子中，不同時含有兩種引物的DNA分子占

。3、利用PCR技術可以擴增目的基因，PCR反應體系中除含緩沖液、模板DNA、dNTP、耐高溫的DNA酶、引物等。其中引物應選用圖中的

（填圖中標號）。PCR過程中關于引物的幾個問題：2n+1-21/8A、D2n2n+12n-2n②PCR技術擴增過程小結a、變性(超過90℃):雙鏈DNA模板在熱作用下，

斷裂，形成

。

b、復性(下降到50℃):系統溫度降低，引物與DNA模板通過堿基互補配對，

形成局部

。c、延伸(上升到72℃):以單鏈DNA為模板，溶液中的

在

的作用下，根據堿基互補配對原則，合成與模板

互補的

的新的DNA鏈。氫鍵單鏈DNA雙鏈4種脫氧核苷酸5′端→3′端耐高溫的DNA聚合酶⑤反應的結果：以_______方式擴增，即______（n為擴增循環的次數）

指數2n⑥采用

來鑒定PCR的產物。瓊脂糖凝膠電泳凝膠電泳原理與結果圖比較項目細胞內DNA復制PCR技術區別解旋方式場所酶溫度結果聯系解旋酶催化主要在細胞核內解旋酶、DNA聚合酶等細胞內溫和條件合成整個DNA分子①模板：均需要脫氧核苷酸雙鏈作為模板②原料：均為四種脫氧核苷酸③酶：均需DNA聚合酶④引物：都需要引物，使DNA聚合酶從引物開始進行互補鏈的合成DNA在高溫下變性解旋細胞外(主要在PCR擴增儀內)耐高溫的DNA聚合酶（TaqDNA聚合酶）控制溫度，需在不同溫度下進行擴增特定的DNA片段或基因在PCR過程中實際加入的為dNTP（即dATP、dGTP、dTTP、dCTP），既可提供合成DNA子鏈的原料，又可為DNA的合成提供能量脫氧核苷三磷酸PCR技術擴增時需要能量，所需要的能量可由dNTP提供，無需添加ATPPCR技術與細胞內DNA復制的比較PCR不需解旋酶、可在短時間內大量擴增目的基因（高效快速）、易于操作(1)PCR反應中溫度的周期性改變是為了DNA聚合酶催化不同的反應

（

）(2)PCR擴增技術中，需用解旋酶使雙鏈DNA解聚

（

）(3)PCR過程使用的DNA聚合酶的特點是耐高溫

（

）(4)PCR技術中，DNA模板鏈上堿基G和C的比例越高，DNA變性解鏈的溫度就越高

（

）(5)PCR擴增過程中，需要添加ATP為新鏈合成提供能量（）(6)PCR擴增過程中，通過溫度變化的控制為變性、復性和延伸等過程提供能量（）1.判斷常考語句，澄清易混易錯溫度不能為變性、復性和延伸等過程提供能量PCR技術擴增時需要能量，所需要的能量可由dNTP提供1.下圖表示利用PCR技術擴增目的基因的部分過程，其原理與細胞內DNA復制類似。下列敘述錯誤的是（）A.耐高溫的DNA聚合酶總將游離的脫氧核苷酸連接到3′端B.在第三輪循環產物中開始出現兩條脫氧核苷酸鏈等長的DNA片段C.引物之間或引物自身發生堿基互補配對，則不能有效擴增目的基因D.從理論上推測，第三輪循環產物中含有引物A的DNA片段占3/4D7/82.(2021·湖北卷)某實驗利用PCR技術獲取目的基因，實驗結果顯示除目的基因條帶(引物與模板完全配對)外，還有2條非特異條帶(引物和模板不完全配對)。為了減少反應中非特異條帶的產生，以下措施中有效的是()

A.增加模板DNA的量B.延長熱變性的時間

C.延長延伸的時間D.提高復性的溫度D3（2021·全國甲卷·高考真題）PCR技術可用于臨床的病原菌檢測。為檢測病人是否感染了某種病原菌，醫生進行了相關操作：①分析PCR擴增結果；②從病人組織樣本中提取DNA；③利用PCR擴增DNA片段；④采集病人組織樣本。回答下列問題：（1）若要得到正確的檢測結果，正確的操作順序應該是

（用數字序號表示）。（2）操作③中使用的酶是____________________________。PCR反應中的每次循環可分為變性、復性、

三步，其中復性的結果是

。（3）PCR（多聚酶鏈式反應）技術是指________________________________________________________________________________________________________________________________。該技術目前被廣泛地應用于疾病診斷等方面。PCR過程每次循環分為3步，其中溫度最低的一步是______________。

一項根據DNA半保留復制的原理，在體外參與DNA復制的各種組分與反應條件，對目的基因的核苷酸序列進行大量復制的技術④②③①Taq酶(耐高溫的DNA聚合酶）延伸

引物通過堿基互補配對與單鏈DNA結合復性(或退火)獲得足量的目的基因后，能否直接將目的基因導入受體細胞呢？思考討論就算可以進行轉錄和翻譯成蛋白質，游離的DNA片段也無法隨著細胞分裂進行復制，導致子代細胞不再含有目的基因游離的DNA片段進入受體細胞，一般會直接被分解

不能原因那怎樣才能讓基因在受體細胞中穩定存在，并且遺傳給下一代呢？確保基因在受體細胞中穩定存在，并且遺傳給下一代；使目的基因能夠表達和發揮作用。1、目的：——基因工程的核心P80思考：要想目的基因實現以上功能，載體還需要哪些結構？2、基因表達載體的組成思考：各個元件有什么作用？二.基因表達載體的構建①目的基因：③啟動子：④終止子：②標記基因：控制特定性狀或表達特定產物。位于基因的首端,是RNA聚合酶結合位點，啟動轉錄位于基因的末端，終止轉錄。用來鑒別或篩選含有重組DNA分子的細胞⑤復制原點：DNA聚合酶結合位點。二.基因表達載體的構建目的基因該插入什么位置？啟動子和終止子之間的部位啟動子與終止子位于DNA分子中，作用：起始和終止轉錄過程。啟動密碼子與終止密碼子位于mRNA分子中，作用：起始和終止翻譯過程。問題：辨析“啟動子與終止子”和“起始密碼子與終止密碼子”小組活動：請文字和箭頭表示基因表達載體的構建過程？載體（質粒）DNA分子（含目的基因）或產生相同黏性末端的限制酶處理質粒帶有黏性末端或平末端的切口帶有相同的黏性末端或平末端的目的基因片段DNA連接酶重組DNA分子（重組質粒）同一種問題：使用一種DNA限制酶進行切割，是否只會得到一種重組DNA？有何缺點？怎么改進？3、基因表達載體的構建過程使用一種限制酶進行切割Bt基因和pBI121質粒，共有幾種連接情況？請大家嘗試用膠帶模擬DNA連接酶進行操作。探究?活動：載體與目的基因反向連接載體與目的基因正向連接目的基因與目的基因之間的連接目的基因自身環化載體自身環化載體與載體之間的連接二.基因表達載體的構建載體目的基因自連兩個片段間的連接目的基因自連質粒自連目的基因與質粒連接目的基因與目的基因連接質粒與質粒連接正向連接反向連接11’22’122’1’22’1’1選擇兩種不同的限制酶同時對目的基因和質粒切割GATCT-A-AATTC-G-如何防止目的基因和質粒的自身環化以及目的基因的反向連接？-A-TCTAG-G-CTTAA1.某目基因兩側的DNA序列所含的限制酶酶切位點如圖所示,下列可作該目的基因最佳載體的是 (

)

A

BC

DA2.構建基因表達載體：為使目的基因與載體正確連接，應用_______________兩種不同限制酶的來分別切割載體和目的基因。PvitⅡ和EcoRⅠ3.(2021·全國乙卷，38)用DNA重組技術可以賦予生物以新的遺傳特性，創造出更符合人類需要的生物產品。在此過程中需要使用多種工具酶，其中4種限制性內切核酸酶的切割位點如圖所