免疫比濁分析第一節(jié)免疫比濁技術(shù)原理免疫比濁技術(shù)分類：透射免疫比濁法（turbidimetricimmunoassay）散射免疫比濁法（nephelometryimmunoassay）速率散射比濁法終點(diǎn)散射比濁法一、透射免疫比濁法

當(dāng)一定波長(zhǎng)的光通過(guò)抗原抗體反應(yīng)形成的免疫復(fù)合物時(shí)會(huì)因?yàn)榉瓷浜臀斩鴾p弱，一定范圍內(nèi)，透射光被吸收的量與復(fù)合物的量呈正相關(guān)關(guān)系，而復(fù)合物的量與抗原抗體量為一定的函數(shù)關(guān)系。（一）基本原理

在抗原或抗體量一定的條件下，可以利用比濁儀在光源的光路方向上測(cè)定透射光強(qiáng)度與入射光強(qiáng)度的比值或吸光度，來(lái)判斷待測(cè)抗原的量，這種方法稱為透射比濁法

。透射免疫比濁法光路圖待測(cè)的抗原抗體復(fù)合物分子量足夠大。抗原抗體復(fù)合物數(shù)量足夠多。具有充分的反應(yīng)時(shí)間。高親和力的抗體，并保證抗體過(guò)量。（二）技術(shù)要求

透射免疫比濁法的靈敏度是單向瓊脂擴(kuò)散方法的5～10倍，但其與標(biāo)記免疫分析技術(shù)相比還不夠高。因此，透射比濁類的自動(dòng)分析儀用于免疫測(cè)定已趨減少，該測(cè)定原理主要用于生化分析儀。（三）方法學(xué)評(píng)價(jià)抗原抗體反應(yīng)曲線二、散射免疫比濁法散射比濁法是指一定波長(zhǎng)的光沿水平軸照射，通過(guò)溶液時(shí)遇到其中的抗原抗體復(fù)合物，光線被粒子顆粒折射而發(fā)生偏轉(zhuǎn)，產(chǎn)生散射光。（一）基本原理

其中光線偏轉(zhuǎn)的角度與發(fā)射光的波長(zhǎng)和抗原抗體復(fù)合物的大小和多少密切相關(guān)。散射光的強(qiáng)度與復(fù)合物的含量成正比，即待測(cè)的抗原越多，形成的復(fù)合物越多，散射光就越強(qiáng)。散射免疫比濁法光路圖透射濁度法和散射濁度法的光路

應(yīng)選擇適當(dāng)?shù)墓庠磸?qiáng)度、反應(yīng)時(shí)間、測(cè)量角度及光源的波長(zhǎng)。另外，要注意保證抗原濃度合適。此外，還要選擇適宜的離子強(qiáng)度、pH值等。（二）技術(shù)要求

散射免疫比濁法是當(dāng)今免疫化學(xué)分析中比較有優(yōu)勢(shì)的方法。可以實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化管理，但用于免疫沉淀反應(yīng)有很多缺陷，如因?yàn)槭且淮涡詼y(cè)定光吸收值，沒(méi)有考慮單個(gè)待測(cè)樣本的散射效果，可能使測(cè)定結(jié)果不準(zhǔn)確。（三）方法學(xué)評(píng)價(jià)

測(cè)定的時(shí)間依然較長(zhǎng)，且隨時(shí)間延長(zhǎng)，抗原抗體復(fù)合物有重新結(jié)合的趨勢(shì)，可影響散射值的變化及存在反應(yīng)本底，在微量測(cè)定時(shí)，本底的干擾是影響測(cè)定準(zhǔn)確性的重要因素。速率散射免疫比濁法該法是抗原抗體結(jié)合反應(yīng)的一種動(dòng)態(tài)測(cè)定方法。將抗原抗體的沉淀反應(yīng)與散射比濁分析相結(jié)合，對(duì)單位時(shí)間內(nèi)抗原和抗體結(jié)合形成復(fù)合物的速度進(jìn)行動(dòng)力學(xué)測(cè)定即為速率散射免疫比濁法。（一）基本原理

當(dāng)抗體的濃度固定于一定范圍時(shí)，速度峰值的高低與抗原的含量成正比，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，免疫復(fù)合物的量逐漸增多，抗原抗體結(jié)合速度的峰值在一定的時(shí)間出現(xiàn)。通過(guò)微機(jī)處理即可得到待測(cè)蛋白成份的含量。累計(jì)時(shí)間復(fù)合物產(chǎn)生總量產(chǎn)生速率510152025303540455055608132560150230300360415450480500—512359080706055453020

抗原抗體復(fù)合物形成時(shí)間與速率的關(guān)系

速率散射比濁法峰值出現(xiàn)的時(shí)間與抗體濃度及純度直接相關(guān)，需選用抗體純度及親和力較高的試劑。此外，要保證待測(cè)樣本血清的性狀符合要求，如嚴(yán)重脂血等即為不合格樣本。（二）技術(shù)要求

該法具有快速、敏感度及精密度高的特點(diǎn)，其最大優(yōu)點(diǎn)在于快速，檢測(cè)不必等到抗原抗體達(dá)到平衡，檢測(cè)的是抗原抗體反應(yīng)的第一階段，大大節(jié)省反應(yīng)時(shí)間，每小時(shí)可檢測(cè)標(biāo)本數(shù)十份；敏感度高，最小檢出量達(dá)微克/升水平。（三）方法學(xué)評(píng)價(jià)三、免疫膠乳比濁法將抗體吸附在大小適中、均勻一致的膠乳顆粒上，制成致敏的膠乳顆粒，當(dāng)遇到相應(yīng)抗原時(shí)，發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)，形成抗原抗體復(fù)合物，膠乳顆粒發(fā)生凝集。（一）基本原理

單個(gè)膠乳顆粒在入射光波長(zhǎng)之內(nèi)并不阻礙光線透過(guò)，兩個(gè)及其兩個(gè)以上膠乳顆粒凝聚時(shí)則使透過(guò)的光減少，其減少的程度與膠乳顆粒凝聚的程度呈正比，即與待測(cè)抗原量呈正比，由此可檢測(cè)樣本中的特定抗原含量。

膠乳顆粒的均一性將直接影響光散射作用，影響檢測(cè)結(jié)果，因此需要選擇均勻一致的膠乳顆粒。此外，試劑需要加保護(hù)劑以提高其穩(wěn)定性，所用器皿要潔凈，避免雜質(zhì)微粒的干擾。（二）技術(shù)要求

該法敏感度高，試劑穩(wěn)定，個(gè)體免疫復(fù)合物對(duì)結(jié)果影響也小，因此結(jié)果穩(wěn)定、可靠，特異性好，精確度高，且不需要特殊的儀器設(shè)備，一般分光光度計(jì)、自動(dòng)化生化分析儀或散射比濁儀均可使用。（三）方法學(xué)評(píng)價(jià)（一）BN特種蛋白分析測(cè)定系統(tǒng)該系統(tǒng)的測(cè)定方法是散射免疫比濁法的一種改良。以發(fā)光二極管作為光源，檢測(cè)前向角13～24度的散射光，然后利用硅化光電二極管接收散射光信號(hào)，經(jīng)過(guò)微電腦處理，與標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比較，最后轉(zhuǎn)換成待檢物質(zhì)的濃度。第二節(jié)自動(dòng)化免疫比濁分析一、主流免疫比濁設(shè)備概況1.測(cè)定原理

系統(tǒng)由分析儀、計(jì)算機(jī)、條碼讀取器、打印機(jī)四部分組成，其中分析儀是主要組成部分，包括散射測(cè)濁儀、自動(dòng)加樣系統(tǒng)、運(yùn)輸裝置和比色杯裝置。

2.儀器基本組成BN100、BNⅡ特種蛋白分析分析系統(tǒng)本系統(tǒng)屬于速率散射比濁分析法，在抗體過(guò)量的前提下，光束通過(guò)抗原抗體復(fù)合物時(shí)所產(chǎn)生的散射光速率變化大小與抗原濃度成正比。速率的峰值通過(guò)電腦處理系統(tǒng)轉(zhuǎn)換成待測(cè)抗原的濃度。1.測(cè)定原理（二）ARRAY分析系統(tǒng)ARRAY系統(tǒng)由分析儀、電腦處理系統(tǒng)、打印機(jī)構(gòu)成，其主要構(gòu)成部分為分析儀，由加液系統(tǒng)、散射測(cè)濁儀、40孔樣本轉(zhuǎn)盤、20孔試劑轉(zhuǎn)盤、軟盤驅(qū)動(dòng)器等組成。2.儀器基本組成Array360、IMMAGE特種蛋白分析分析系統(tǒng)二、免疫比濁分析的主要影響因素1．抗原抗體比例抗原抗體比例要適當(dāng)。2．抗體的純度與效價(jià)診斷試劑應(yīng)盡可能選擇高純度與高效價(jià)的抗體。3．免疫復(fù)合物的大小及穩(wěn)定性溶液中免疫復(fù)合物顆粒的分散度盡可能相同，顆粒應(yīng)該不容易相互聚集。4．增濁劑利用增聚劑破壞抗原抗體的水化層，促進(jìn)反應(yīng)的進(jìn)行。5.離子強(qiáng)度PBS是較好的反應(yīng)液。。。。。。。小結(jié)

經(jīng)典的免疫沉淀反應(yīng)通常是在抗原抗體反應(yīng)的終點(diǎn)