基因工程菌大規(guī)模培養(yǎng)?一、引言基因工程菌是指通過基因工程技術(shù)將外源基因?qū)胨拗骷?xì)胞后所構(gòu)建的工程菌株。隨著生物技術(shù)的飛速發(fā)展，基因工程菌在生產(chǎn)各種生物制品，如重組蛋白、生物藥物、酶等方面展現(xiàn)出了巨大的潛力。然而，要實(shí)現(xiàn)基因工程菌的工業(yè)化生產(chǎn)，大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)是關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。大規(guī)模培養(yǎng)基因工程菌面臨著諸多挑戰(zhàn)，包括如何保證細(xì)胞的高密度生長、維持基因表達(dá)的穩(wěn)定性以及高效地獲取目標(biāo)產(chǎn)物等。本章將詳細(xì)介紹基因工程菌大規(guī)模培養(yǎng)的相關(guān)技術(shù)和要點(diǎn)。

二、基因工程菌大規(guī)模培養(yǎng)的基本要求（一）細(xì)胞生長特性1.生長速率基因工程菌應(yīng)具有較快的生長速率，以便在較短的時(shí)間內(nèi)達(dá)到較高的細(xì)胞密度。這需要通過優(yōu)化培養(yǎng)基配方、培養(yǎng)條件等因素來實(shí)現(xiàn)。不同的基因工程菌其生長速率可能存在差異，例如一些生長迅速的大腸桿菌菌株在合適條件下能夠在數(shù)小時(shí)內(nèi)實(shí)現(xiàn)細(xì)胞數(shù)量的大幅增長，而某些酵母工程菌的生長速率則相對較慢。2.代謝特性了解基因工程菌的代謝特性對于大規(guī)模培養(yǎng)至關(guān)重要。要明確其對營養(yǎng)物質(zhì)的需求，如碳源、氮源、維生素、氨基酸等的種類和濃度。同時(shí)，還需關(guān)注代謝產(chǎn)物的積累情況，避免某些代謝產(chǎn)物對細(xì)胞生長產(chǎn)生抑制作用。例如，某些基因工程菌在發(fā)酵過程中會產(chǎn)生酸性物質(zhì)，導(dǎo)致培養(yǎng)基pH值下降，影響細(xì)胞生長，此時(shí)就需要采取相應(yīng)的措施來調(diào)節(jié)pH值。

（二）基因表達(dá)穩(wěn)定性1.外源基因整合穩(wěn)定性外源基因?qū)胨拗骷?xì)胞后，需要保證其在細(xì)胞傳代過程中的穩(wěn)定性。防止外源基因發(fā)生丟失、重排或突變等現(xiàn)象，以免影響目標(biāo)產(chǎn)物的表達(dá)。可以通過優(yōu)化載體構(gòu)建、篩選合適的宿主細(xì)胞等方法來提高外源基因整合的穩(wěn)定性。例如，選擇具有穩(wěn)定遺傳特性的宿主細(xì)胞系，并使用整合效率高且穩(wěn)定的載體系統(tǒng)。2.誘導(dǎo)表達(dá)調(diào)控對于可誘導(dǎo)表達(dá)的基因工程菌，要確保誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)的可靠性。能夠精確控制誘導(dǎo)劑的添加時(shí)間、濃度等參數(shù)，實(shí)現(xiàn)目標(biāo)蛋白的高效表達(dá)。同時(shí)，要避免誘導(dǎo)劑的過早或過強(qiáng)誘導(dǎo)導(dǎo)致細(xì)胞生長受到抑制或目標(biāo)蛋白形成包涵體等問題。例如，使用異丙基βD硫代半乳糖苷（IPTG）作為誘導(dǎo)劑時(shí)，需要根據(jù)不同的基因工程菌和培養(yǎng)條件優(yōu)化其使用濃度和誘導(dǎo)時(shí)間。

三、培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件（一）培養(yǎng)基1.基本成分培養(yǎng)基的基本成分包括碳源、氮源、無機(jī)鹽、維生素等。碳源：常用的碳源有葡萄糖、甘油、乳糖等。不同的碳源對基因工程菌的生長和代謝有不同的影響。例如，葡萄糖是一種快速利用的碳源，但過量使用可能導(dǎo)致代謝產(chǎn)物積累對細(xì)胞生長產(chǎn)生抑制；甘油則相對較為溫和，有利于維持細(xì)胞的生長環(huán)境。氮源：氮源可分為有機(jī)氮源和無機(jī)氮源。有機(jī)氮源如蛋白胨、酵母提取物等含有豐富的氨基酸等營養(yǎng)成分，能為細(xì)胞提供全面的營養(yǎng)；無機(jī)氮源如氯化銨、硫酸銨等則主要提供氮元素。無機(jī)鹽：包括鉀、鈉、鎂、鈣、磷等多種離子，它們參與細(xì)胞的生理代謝過程，維持細(xì)胞的滲透壓和酸堿平衡。維生素：提供細(xì)胞生長所需的各種維生素，如維生素B族等，對細(xì)胞的生長和代謝起到重要的輔助作用。2.培養(yǎng)基優(yōu)化為了滿足基因工程菌的特殊需求，常常需要對培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化。可以通過單因素實(shí)驗(yàn)或響應(yīng)面分析等方法，研究不同營養(yǎng)成分的濃度及其相互作用對細(xì)胞生長和目標(biāo)產(chǎn)物表達(dá)的影響，從而確定最佳的培養(yǎng)基配方。例如，通過優(yōu)化氨基酸的種類和濃度，可以提高某些重組蛋白的表達(dá)水平。

（二）培養(yǎng)條件1.溫度溫度是影響基因工程菌生長和代謝的重要因素之一。不同的基因工程菌有其最適生長溫度范圍。一般來說，大腸桿菌等常見的基因工程菌在37℃左右生長較好，但有些工程菌可能需要更低或更高的溫度。例如，某些嗜冷菌在低溫條件下能夠更好地生長和表達(dá)目標(biāo)產(chǎn)物，而一些嗜熱菌則需要在較高溫度下培養(yǎng)。溫度的變化會影響細(xì)胞內(nèi)酶的活性、代謝途徑以及基因表達(dá)水平等。2.pH值培養(yǎng)基的pH值對基因工程菌的生長和產(chǎn)物合成也有顯著影響。合適的pH值范圍能夠維持細(xì)胞的正常生理功能，促進(jìn)細(xì)胞生長和目標(biāo)產(chǎn)物的表達(dá)。通常需要通過添加酸堿調(diào)節(jié)劑來控制培養(yǎng)基的pH值。例如，在培養(yǎng)過程中可以使用氫氧化鈉或鹽酸來調(diào)節(jié)pH值，使其保持在最適范圍內(nèi)。不同的基因工程菌對pH值的要求有所不同，一般在6.57.5之間較為常見。3.溶解氧對于需氧型基因工程菌，溶解氧是影響細(xì)胞生長和代謝的關(guān)鍵因素之一。在大規(guī)模培養(yǎng)過程中，要保證充足的溶解氧供應(yīng)，以滿足細(xì)胞呼吸的需求。可以通過攪拌、通氣等方式來提高溶解氧水平。例如，采用機(jī)械攪拌式發(fā)酵罐時(shí)，攪拌速度和通氣量的合理控制能夠有效地提高溶解氧濃度，促進(jìn)細(xì)胞生長和目標(biāo)產(chǎn)物的合成。但過高的溶解氧水平也可能對細(xì)胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激等不利影響，因此需要找到一個合適的平衡點(diǎn)。4.培養(yǎng)方式基因工程菌的大規(guī)模培養(yǎng)方式主要有分批培養(yǎng)、補(bǔ)料分批培養(yǎng)和連續(xù)培養(yǎng)等。分批培養(yǎng)：是將細(xì)胞接種到一定體積的培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)過程中不添加新鮮培養(yǎng)基，直至營養(yǎng)物質(zhì)耗盡或達(dá)到培養(yǎng)終點(diǎn)。這種培養(yǎng)方式操作簡單，但細(xì)胞生長和產(chǎn)物合成受到營養(yǎng)物質(zhì)限制，難以達(dá)到很高的細(xì)胞密度和產(chǎn)物濃度。補(bǔ)料分批培養(yǎng)：在分批培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，根據(jù)細(xì)胞生長和代謝情況，適時(shí)補(bǔ)加新鮮培養(yǎng)基。通過補(bǔ)料可以延長細(xì)胞的對數(shù)生長期，提高細(xì)胞密度，同時(shí)有利于目標(biāo)產(chǎn)物的合成。補(bǔ)料的方式可以是連續(xù)補(bǔ)料、間歇補(bǔ)料或反饋補(bǔ)料等。例如，根據(jù)溶解氧、pH值、葡萄糖濃度等參數(shù)進(jìn)行反饋補(bǔ)料，能夠更精確地控制培養(yǎng)過程。連續(xù)培養(yǎng)：是在培養(yǎng)過程中不斷添加新鮮培養(yǎng)基，同時(shí)排出等量的培養(yǎng)液，使細(xì)胞在恒定的環(huán)境條件下持續(xù)生長。連續(xù)培養(yǎng)可以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的長期穩(wěn)定培養(yǎng)，提高生產(chǎn)效率，但對設(shè)備和操作要求較高，且容易受到污染等因素的影響。

四、大規(guī)模培養(yǎng)設(shè)備（一）發(fā)酵罐1.攪拌式發(fā)酵罐攪拌式發(fā)酵罐是最常用的大規(guī)模培養(yǎng)設(shè)備之一。它通過機(jī)械攪拌裝置使培養(yǎng)基在罐內(nèi)充分混合，提高溶解氧水平，促進(jìn)細(xì)胞與營養(yǎng)物質(zhì)的接觸。攪拌式發(fā)酵罐具有結(jié)構(gòu)簡單、操作方便等優(yōu)點(diǎn)，適用于多種基因工程菌的培養(yǎng)。其攪拌槳的類型、轉(zhuǎn)速以及通氣方式等對培養(yǎng)效果有重要影響。例如，不同形狀的攪拌槳在混合效果和剪切力方面存在差異，需要根據(jù)具體的培養(yǎng)需求進(jìn)行選擇。2.氣升式發(fā)酵罐氣升式發(fā)酵罐利用氣體上升產(chǎn)生的動力使培養(yǎng)基循環(huán)流動。它具有溶氧效率高、剪切力小等優(yōu)點(diǎn)，有利于保護(hù)基因工程菌的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，減少因剪切力過大導(dǎo)致的細(xì)胞損傷。氣升式發(fā)酵罐通常由罐體、升氣管、降液管等部分組成，氣體通過升氣管進(jìn)入罐內(nèi)，帶動培養(yǎng)基上升，然后通過降液管返回罐底，形成循環(huán)流動。

（二）生物反應(yīng)器的監(jiān)測與控制為了保證基因工程菌大規(guī)模培養(yǎng)的順利進(jìn)行，需要對生物反應(yīng)器的各種參數(shù)進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測和精確控制。1.參數(shù)監(jiān)測溫度：通過溫度傳感器實(shí)時(shí)監(jiān)測發(fā)酵罐內(nèi)的溫度，并反饋給控制系統(tǒng)進(jìn)行調(diào)節(jié)。pH值：利用pH電極測量培養(yǎng)基的pH值，以便及時(shí)添加酸堿調(diào)節(jié)劑維持合適的pH范圍。溶解氧：采用溶解氧電極監(jiān)測溶解氧濃度，為通氣和攪拌操作提供依據(jù)。細(xì)胞密度：可以通過在線監(jiān)測細(xì)胞的光密度、濁度等參數(shù)來間接反映細(xì)胞密度的變化，也可以定期取樣進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)來準(zhǔn)確了解細(xì)胞生長情況。2.參數(shù)控制基于監(jiān)測到的參數(shù)，通過控制系統(tǒng)對發(fā)酵罐的攪拌速度、通氣量、補(bǔ)料速率等進(jìn)行自動控制。例如，當(dāng)溶解氧濃度低于設(shè)定值時(shí)，自動增加通氣量或攪拌速度；當(dāng)pH值偏離最適范圍時(shí)，自動添加酸堿調(diào)節(jié)劑進(jìn)行調(diào)節(jié)。先進(jìn)的控制系統(tǒng)能夠?qū)崿F(xiàn)多參數(shù)的協(xié)同控制，提高培養(yǎng)過程的穩(wěn)定性和可靠性。

五、基因工程菌大規(guī)模培養(yǎng)過程中的問題及解決策略（一）細(xì)胞生長抑制1.營養(yǎng)物質(zhì)限制在培養(yǎng)過程中，隨著細(xì)胞的生長和代謝，培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)逐漸消耗，可能會限制細(xì)胞的進(jìn)一步生長。通過補(bǔ)料分批培養(yǎng)等方式適時(shí)補(bǔ)充營養(yǎng)物質(zhì)，可以緩解營養(yǎng)物質(zhì)限制的問題。例如，根據(jù)細(xì)胞生長曲線和營養(yǎng)物質(zhì)消耗情況，精確控制葡萄糖、氨基酸等營養(yǎng)成分的補(bǔ)加速率，以維持細(xì)胞的生長需求。2.代謝產(chǎn)物積累基因工程菌在生長過程中會產(chǎn)生一些代謝產(chǎn)物，如有機(jī)酸、乙醇等。當(dāng)這些代謝產(chǎn)物積累到一定濃度時(shí)，會對細(xì)胞生長產(chǎn)生抑制作用。可以通過優(yōu)化培養(yǎng)條件，如調(diào)節(jié)pH值、控制溶解氧等，促進(jìn)代謝產(chǎn)物的排出或降低其生成速率。例如，通過提高通氣量促進(jìn)乙醇等揮發(fā)性代謝產(chǎn)物的揮發(fā)，或利用緩沖體系維持合適的pH值來減少酸性代謝產(chǎn)物的抑制作用。

（二）目標(biāo)產(chǎn)物表達(dá)問題1.包涵體形成在基因工程菌表達(dá)目標(biāo)蛋白時(shí)，有時(shí)會形成包涵體。包涵體的形成會導(dǎo)致目標(biāo)蛋白失去活性，且難以純化。可以通過優(yōu)化培養(yǎng)條件，如降低培養(yǎng)溫度、調(diào)整誘導(dǎo)劑濃度等，減少包涵體的形成。例如，對于一些容易形成包涵體的蛋白，采用較低的培養(yǎng)溫度（如20℃左右）進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，有助于提高目標(biāo)蛋白以可溶形式表達(dá)的比例。2.表達(dá)水平不穩(wěn)定基因工程菌的目標(biāo)產(chǎn)物表達(dá)水平可能會出現(xiàn)不穩(wěn)定的情況。這可能是由于外源基因整合不穩(wěn)定、培養(yǎng)條件波動等原因?qū)е碌摹榱颂岣弑磉_(dá)水平的穩(wěn)定性，可以通過篩選穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞株、優(yōu)化載體構(gòu)建以及加強(qiáng)培養(yǎng)過程的監(jiān)控和控制等措施來解決。例如，在構(gòu)建載體時(shí)選擇合適的啟動子和增強(qiáng)子元件，提高外源基因的轉(zhuǎn)錄效率；在培養(yǎng)過程中嚴(yán)格控制溫度、pH值等參數(shù)，減少環(huán)境因素對基因表達(dá)的影響。

（三）污染問題大規(guī)模培養(yǎng)過程中，基因工程菌容易受到雜菌污染。雜菌的污染會與目標(biāo)菌競爭營養(yǎng)物質(zhì)，影響細(xì)胞生長和產(chǎn)物合成，甚至可能導(dǎo)致培養(yǎng)失敗。為了防止污染，需要嚴(yán)格控制發(fā)酵罐的滅菌條件，確保設(shè)備和培養(yǎng)基的無菌狀態(tài)。在培養(yǎng)過程中，要保持發(fā)酵罐的密封性，防止外界微生物進(jìn)入。同時(shí)，定期對培養(yǎng)體系進(jìn)行無菌檢測，一旦發(fā)現(xiàn)污染及時(shí)采取措施進(jìn)行處理，如重新滅菌、更換培養(yǎng)基等。

六、基因工程菌大規(guī)模培養(yǎng)的實(shí)例分析（一）重組胰島素的生產(chǎn)重組胰島素是基因工程菌大規(guī)模培養(yǎng)生產(chǎn)生物藥物的典型例子。1.基因工程菌構(gòu)建將胰島素基因?qū)氪竽c桿菌等宿主細(xì)胞中，構(gòu)建重組基因工程菌。通過優(yōu)化載體設(shè)計(jì)和表達(dá)調(diào)控元件，使胰島素基因能夠在大腸桿菌中高效表達(dá)。2.培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件優(yōu)化采用含有合適碳源（如甘油）、氮源（如蛋白胨）、無機(jī)鹽和維生素的培養(yǎng)基。培養(yǎng)條件方面，控制溫度在37℃左右，pH值維持在7.0左右，通過攪拌和通氣保證充足的溶解氧。采用補(bǔ)料分批培養(yǎng)方式，根據(jù)細(xì)胞生長和胰島素表達(dá)情況適時(shí)補(bǔ)加營養(yǎng)物質(zhì)，促進(jìn)細(xì)胞生長和目標(biāo)產(chǎn)物合成。3.培養(yǎng)過程控制利用發(fā)酵罐進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)，實(shí)時(shí)監(jiān)測溫度、pH值、溶解氧、細(xì)胞密度等參數(shù)，并通過控制系統(tǒng)自動調(diào)節(jié)攪拌速度、通氣量和補(bǔ)料速率。在誘導(dǎo)階段，精確控制誘導(dǎo)劑IPTG的添加時(shí)間和濃度，實(shí)現(xiàn)胰島素的高效表達(dá)。4.產(chǎn)物分離與純化培養(yǎng)結(jié)束后，通過離心、過濾等方法收集細(xì)胞，然后采用破碎細(xì)胞、層析等一系列分離純化技術(shù)，從細(xì)胞裂解液中獲得高純度的重組胰島素。

（二）重組酶的工業(yè)生產(chǎn)1.重組酶基因工程菌的構(gòu)建選擇合適的酶基因，將其克隆到表達(dá)載體上，并導(dǎo)入合適的宿主細(xì)胞（如畢赤酵母）中，構(gòu)建重組酶基因工程菌。畢赤酵母具有真核表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)勢，能夠?qū)Ρ磉_(dá)的蛋白進(jìn)行正確的折疊和修飾。2.培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件培養(yǎng)基以甘油為碳源，添加酵母提取物、蛋白胨等有機(jī)氮源以及適量的無機(jī)鹽和維生素。培養(yǎng)溫度一般控制在30℃左右，pH值保持在6.06.5之間。通過控制通氣量和攪拌速度維持合適的溶解氧水平。采用補(bǔ)料分批培養(yǎng)，根據(jù)細(xì)胞生長和酶表達(dá)情況補(bǔ)加甘油等營養(yǎng)物質(zhì)。3.培養(yǎng)過程管理在發(fā)酵罐中進(jìn)行培養(yǎng)，實(shí)時(shí)監(jiān)測各種參數(shù)并進(jìn)行調(diào)控。通過優(yōu)化誘導(dǎo)條件，如甲醇的添加濃度和時(shí)間，實(shí)現(xiàn)重組酶的高效表達(dá)。培養(yǎng)結(jié)束后，通過離心收集細(xì)胞，然后采用超濾、離子交換層析等方法純化重組酶，獲得滿足工業(yè)生產(chǎn)需求的酶制