一、免疫學檢測技術（二）二、免疫學防治本次課教學內容P197第二十一章免疫學檢測及其應用教學要求：1、掌握體外抗原抗體反應的特點及影響因素；凝集反應、沉淀反應與免疫標記技術的原理和方法2、熟悉淋巴細胞的分離、鑒定及T細胞功能測定。3、了解B細胞功能測定；免疫學檢測方法的應用。第一節抗原抗體反應的特點及影響因素第二節檢測抗原抗體的體外試驗第三節免疫細胞功能的檢測本章教學內容BLOODTYPETEST抗原抗體反應：是指抗原和抗體之間所發生的特異性結合反應。可發生于體內（invivo），也可發生于體外（invitro）。簡介

在體內（invivo），抗原抗體反應是體液免疫的基礎Ag與Ab在體內結合可發生中和作用、調理吞噬、溶菌效應等

在體外（invitro）,Ag與Ab在體外結合，可出現凝集、沉淀、補體參與的溶血等反應。臨床上一般多采用血清作試驗。所以體外的抗原抗體反應又稱為血清學反應。體外抗原抗體反應的特點和影響因素1．高度特異性：結構基礎：由抗原表位與Ab

的CDR互補結合所決定。

----如抗白喉毒素只能與白喉毒素結合，不能與破傷風毒素結合。是一切血清學反應的基礎。

----臨床上通過檢測Ag或Ab可以診斷或輔助診斷疾病。

一、體外抗原抗體反應的特點

Ag+AbAg-Ab

非共價結合，保持動態平衡，在一定條件下是可逆的。Ag-Ab復合物的解離程度，除受環境條件（溫度、PH、離子強度）影響之外，通常主要取決于Ag-Ab的親和力。2.可逆性親和力（affinity)：抗體分子上一個抗原結合部位與相應抗原表位之間的互補結合的強度

抗原和抗體之間發生可見反應需遵循一定的量比關系，只有當二者的濃度比例適當時，才出現可見反應。3．適宜的抗原抗體濃度和比例前帶后帶等價帶

網格學說(latticetheory)cross-linking4.階段性反應階段特點①特異結合階段發生特異結合，但不出現可見反應;反應快，僅需幾秒至幾分。②可見反應階段可見的反應（凝集、沉淀、溶解細胞等），復合物受環境因素(pH、電解質、溫度)的影響；反應慢，常需數分鐘至數小時。在血清學反應中，兩階段往往不能嚴格分開。

適量電解質的存在，可使抗原抗體結合后呈現明顯的沉淀或凝集等反應現象。無電解質存在，不出現可見反應現象。如果電解質濃度過高，會出現鹽析現象。常用含生理鹽水(8.5g/L,0.9%NaCl)的溶液作為抗原和抗體的稀釋劑。1.電解質二、影響抗原抗體反應的因素

抗原抗體反應必須在合適的pH環境中進行，pH過高或過低，均可直接影響抗原抗體的反應性。血清學反應一般在pH6～8進行。補體結合反應及溶解反應最適為pH7.2～7.4。2.酸堿度（pH）一定范圍內，溫度升高可增加抗原與抗體分子碰撞的機會，加快二者結合速度。不宜過高過低，保持適當。

血清學反應一般以15～40℃為宜，最適為37℃。3.溫度

總之,血清學反應影響因素較多，因此必須十分注意實驗條件的選擇和穩定，必須做好嚴格的實驗對照

(例如，陽性對照positivecontrol、陰性對照negativecontrol、標準品對照standardcontrol等)，只有這樣才能保證結果準確。4.其它：震搖混勻等三、免疫學檢測技術的類型第2節檢測抗原和抗體的體外試驗在一定條件下（溫度、PH、離子強度適宜），抗原與相應抗體在體外可發生特異性結合，出現可檢測或觀測的現象。第2節檢測抗原和抗體的體外試驗1、定性檢測2、定量檢測一、概述據Ag性質、出現的現象、參與反應成分不同分：二、檢測抗原和抗體的體外試驗類型（三）免疫標記技術（一）凝集反應（二）沉淀反應（一）凝集反應（Agglutinationreactions）

顆粒性抗原（細菌、細胞或表面包被抗原的顆粒）與相應抗體在適當條件下特異性結合，出現肉眼可見的凝集團塊的現象。

適宜的溫度、酸堿度、電解質等顆粒性抗原直接與相應抗體反應出現的凝集現象，如紅細胞凝集或細菌凝集。包括玻片凝集和試管凝集兩種檢測方法。1、直接凝集反應玻片法：試管法：定性試驗半定量試驗，肥達氏反應ABO血型鑒定、細菌鑒定（一）凝集反應（Agglutinationreactions）將可溶性抗原或抗體先吸附在某些顆粒載體上，形成致敏顆粒，然后再與相應抗體或抗原進行反應出現的凝集現象。2、間接凝集反應正向間接凝集：反向間接凝集：抗體致敏顆粒，測抗原抗原致敏顆粒，測抗體RBC，乳膠顆粒，活性炭（一）凝集反應（Agglutinationreactions）（二）沉淀反應（Precipiationreactions）

可溶性抗原（毒素、組織浸液及血清中的蛋白等）與相應抗體在適當條件下特異性結合，出現肉眼可見的沉淀物。

原理和方法1、單向瓊脂擴散應用：Ig和補體C3的定量測定AFP或其他可溶性抗原測定抗原擴散、沉淀環的直徑與抗原含量成正相關Ab+瓊脂制板打孔AgNSAgAg加樣觀察（含量）（二）沉淀反應（Precipitationreactions）（二）沉淀反應（Precipitationreactions）原理和方法2、雙向瓊脂擴散應用：①檢測可溶性抗原或抗體②測定稀釋免疫血清的效價（半定量）③對復雜的抗原或抗體成分進行純度鑒定（三）免疫標記技術（immunolabelingtechniques）免疫標記技術是將抗原抗體反應與標記技術相結合，以檢測抗原或抗體的一類試驗方法。常用標記物：酶、熒光素、放射性核素、化學發光物質及膠體金等特點：敏感性高，定性、定量、定位1、酶免疫測定法酶免疫組化技術：酶聯免疫吸附試驗(ELISA)：測定可溶性抗原/抗體測定細胞表面或組織中的抗原Enzymelinkedimmunosorbentassay辣根過氧化物酶（HRP）、堿性磷酸酶（AP）將已知抗原或抗體吸附于固相載體表面，使抗原抗體反應在固相表面進行，用洗滌液將游離成分洗去；然后由酶標試劑作用于底物顯色，通過酶標儀測定有色產物光密度值（OD）對抗原抗體作定性定量檢測。方法：①雙抗體夾心法：圖ELISA原理：檢測抗原②間接法：圖檢測抗體③生物素-親和素系統—ELISA2、免疫熒光技術方法：應用：直接法和間接法標記物：異硫氰酸熒光素（FITC）圖藻紅蛋白（PE）傳染病診斷、測定CD分子、自身免疫病診斷每檢查一種抗原，須制備相應的熒光抗體一抗熒光素標記的二抗3、放射免疫測定法（RIA）應用：標記物：放射性核素131I和125I用于微量物質（激素、藥物）測定，達pg/ml缺點：放射性核素污染設備條件要求高4、化學發光免疫技術5、免疫膠體金技術圖

(Immunologicalcolloidalgoldsignature,ICS)主要利用了金顆粒具有高電子密度的特性，在金標蛋白結合處，在顯微鏡下可見黑褐色顆粒，當這些標記物在相應的配體處大量聚集時，肉眼可見紅色或粉紅色斑點，因而用于定性或半定量的快速免疫檢測。這一反應也可以通過銀顆粒的沉積被放大，稱之為免疫金銀染色。6、免疫印跡技術：可定性及定量分析蛋白質圖

FLASH第3節免疫細胞及其功能檢測（peripheralbloodmononuclearcells,PBMC）第3節免疫細胞及其功能檢測（一）外周血單個核細胞的分離一、免疫細胞的分離及數量測定FLASHPBMC：包括淋巴細胞和單核細胞Ficoll分離液法人靜脈血2ml/試管，抗凝每管加Hank’s液2ml，混勻是一種單次、差速、密度梯度離心的分離法。該法分離的單個核細胞純度可達95%，其中淋巴細胞約占90%~95%原理及方法：

根據表面標志分離。將抗細胞表面標志的抗體結合于固相載體結果：使具有相應表面標志的淋巴細胞與細胞懸液中其他細胞分開。CD4抗CD41．免疫吸附分離法（二）淋巴細胞及其亞群的分離原理：根據表面標志分離。磁珠表面包被免疫物質后稱免疫磁珠，可顯示免疫活性和磁性2．免疫磁珠分離法原理：根據表面標志分離。T細胞—CD3、CD4、CD8

，B細胞—mIgD、mIgM3．免疫熒光法與流式細胞術原理淋巴細胞DNA合成增加蛋白合成增加淋巴母細胞刺激物細胞變大細胞漿增多胞質空泡核仁明顯核染色質疏松二、免疫細胞的功能測定（一）淋巴細胞增殖或轉化試驗淋巴細胞轉化的刺激物非特異性刺激物：

PHA----------T細胞

ConA----------T細胞

PWM----------T、B細胞

特異性刺激物：

異種抗原同種組織抗原

方法②3H-TdR摻入法③MTT法①形態計數法（四）細胞毒試驗：（六）細胞因子檢測：ELISPOTCTL、NK（二）遲發型超敏反應（DTH）檢測：（三）抗體形成細胞測定：溶血空斑試驗圖（五）吞噬功能測定：2、簡述體外Ag-Ab反應的特點及影響因素。3、常用的免疫標記技術有哪些？4、ELISA的雙抗夾心法的原理及基本操作步驟5、簡述T淋巴細胞增殖試驗的基本原理。1、名詞：

凝集反應，沉淀反應，ELISA思考題*雙抗體夾心法：免疫教研室免疫檢測與防治免疫教研室免疫檢測與防治溶血空斑溶血空斑試驗：空斑數

=抗體生成細胞數空斑大小

=產生的抗體多少一個斑點表示一個分泌相應細胞因子的細胞教學要求：1、掌握人工主動免疫/人工被動免疫的概念、主要制劑；免疫治療的概念。2、熟悉疫苗的基本要求；計劃免疫的含義；免疫治療的基本手段。3、了解新型疫苗，疫苗的應用；免疫治療的發展前景、生物應答調節劑的概念。P209第二十二章免疫學防治

第1節免疫預防一、概述：始于接種“人痘”預防天花，死亡率從20％～30％降至1％～2％。是根據特異性免疫原理來預防疾病的方法。EdwardJenner接種“牛痘”成功，人類消滅了天花。免疫教研室免疫檢測與防治

自然免疫適應性免疫的獲得方式：人工免疫自然主動免疫自然被動免疫人工主動免疫人工被動免疫是根據適應性免疫原理，將疫苗、抗體、細胞因子等生物制品應用于人體，使其獲得適應性免疫，以預防某些疾病的方法。

二、人工主動免疫：概念：用（疫苗等）抗原物質接種機體，使之主動產生適應性免疫應答，從而預防或治療疾病的措施。疫苗：疫苗的要求：國際上將細菌性制劑、病毒性制劑、類毒素等統稱為疫苗。安全、有效、實用

（一）傳統疫苗1、滅活疫苗（死疫苗）：兩種疫苗特性比較

表選用免疫原性強的病原體，經人工大量培養后，用理化方法滅活制成。2、減毒活疫苗：將病原體在培養基或動物細胞中反復傳代，使其失去或降低毒力，但保留免疫原性。即由減毒或無毒的活病原微生物制成。

3、類毒素：細菌的外毒素經0.3%～0.4%甲醛處理，失去毒性而保留了免疫原性，接種后能誘導機體產生抗毒素。1、亞單位疫苗：（二）新型疫苗2、結合疫苗：3、合成肽疫苗：4、基因工程疫苗：保留有效免疫原成分，HBsAgTI-Ag（如莢膜多糖）+載體→TD-AgDNA疫苗，重組載體疫苗，轉基因植物疫苗

（三）疫苗的應用1、抗感染和計劃免疫我國計劃免疫程序表2、抗腫瘤3、計劃生育4、防治免疫病理損傷EB病毒疫苗，人乳頭瘤病毒疫苗抗HCG，抗ZP3是根據某些特定傳染病的疫情監測和人群免疫狀況分析，有計劃地用疫苗進行免疫接種，預防相應傳染病，最終控制乃至消滅相應傳染病的重要措施。

三、人工被動免疫：概念：給人體注射含有特異性抗體或細胞因子的制劑，使之被動獲得免疫應答，以治療或緊急預防疾病的措施。人工主動免疫和人工被動免疫特點比較

第2節免疫治療一、概述免疫增強療法免疫抑制療法特異性免疫治療非特異性免疫治療主動免疫治療被動免疫治療免疫治療的基本策略是從分子、細胞和整體水平干預或調整機體的免疫功能。是指利用免疫學原理，針對疾病發生機制，人為地干預或調整機體的免疫功能，達到治療疾病目的所采取的措施。

二、常用制劑：（一）抗原類：1、抗感染免疫血清微生物抗原疫苗、瘤苗（二）抗體類：導向治療(放射性核素、化療藥物、毒素)

2、抗淋巴細胞丙種球蛋白(ALG）3、抗腫瘤抗體制劑4、抗細胞因子抗體移植排斥、某些自身免疫病的治療抗TNF-α治療類風關等慢性炎癥pAbmAb5、抗細胞表面分子的單抗抗毒素血清、人Ig制劑抗CD20治療B淋巴細胞瘤

（三）細胞因子：1、造血干細胞移植骨髓移植、臍血轉輸：淋巴因子激活的殺傷細胞2、過繼免疫療法LAK：腫瘤浸潤性淋巴細胞TIL（四）免疫細胞類：：細胞因子誘導的殺傷細胞CIK3、細胞疫苗：腫瘤細胞疫苗，DC疫苗

（五）生物應答調節劑：1、卡介苗、短小棒桿菌、多糖成分

BRM，具有促進或調節免疫功能的制劑，通常對免疫功能正常者無影響，對免疫功能異常特別是免疫功能低下者有促進和調節作用2、胸腺肽、轉移因子、免疫核糖核酸環磷酰胺；環孢菌素A、FK-