第二章先進測量平臺色譜法：當流動相中攜帶的混合物流經固定相時，其與固定相發生相互作用。由于混合物中各組分在性質和結構上的差異，與固定相之間產生的作用力的大小、強弱不同，隨著流動相的移動，混合物在兩相間經過反復多次的分配平衡，使得各組分被固定相保留的時間不同，從而按一定次序由固定相中流出。與適當的柱后檢測方法結合，實現混合物中各組分的分離與檢測；兩相及兩相的相對運動構成了色譜法的基礎。色譜法分類:1)氣相色譜：流動相為氣體（稱為載氣）。按分離柱不同可分為：填充柱色譜和毛細管柱色譜；按固定相的不同又分為：氣固色譜和氣液色譜(2)液相色譜：流動相為液體（也稱為淋洗液）。按固定相的不同分為：液固色譜和液液色譜。電泳：在電解質溶液中，位于電場中的帶電離子在電場力的作用下，以不同的速度向其所帶電荷相反的電極方向遷移的現象，稱之為電泳。由于不同離子所帶電荷及性質的不同，遷移速率不同，可實現分離。樣品的遷移速度和方向由其電荷和淌度決定。利用電泳現象對化學或生物物質進行分離分析的方法和技術叫電泳法或電泳技術。按形狀分類：U型管電泳、柱狀電泳、板電泳；按載體分類：濾紙電泳、瓊脂電泳、聚丙烯酰胺電泳、自由電泳；傳統電泳分析：操作煩瑣，分離效率低，定量困難，無法與其他分析相比。1981年，Jorgenson等用75m內徑石英毛細管進行電泳分析，柱效高達40萬/m，促進電泳技術發生了根本變革，迅速發展成為可與GC、HPLC相媲美的嶄新的分離分析技術：高效毛細管電泳。高效毛細管電泳在技術上采取了兩項重要改進：一、采用了<0.1mm內徑的毛細管二、采用了高達數萬伏的電壓毛細管的采用使產生的熱量能夠較快散發，大大減小了溫度效應，使電場電壓可以很高。高效毛細管電泳的柱效遠高于高效液相色譜，理論塔板數高達幾十萬/米，特殊柱子可以達到數百萬。電場作用下，毛細管柱中出現：電泳現象和電滲流現象。帶電粒子的遷移速度=電泳+電滲流；兩種速度的矢量和。正離子：兩種效應的運動方向一致，在負極最先流出；中性粒子無電泳現象，受電滲流影響，在陽離子后流出；陰離子：兩種效應的運動方向相反。ν電滲流>ν電泳時，陰離子在負極最后流出，在這種情況下，不但可以按類分離，除中性粒子外，同種類離子由于受到的電場力大小不一樣也同時被相互分離。1937年，Tiselius(瑞典)將蛋白質混合液放在兩段緩沖溶液之間，兩端施以電壓進行自由溶液電泳，第一次將人血清提取的蛋白質混合液分離出白蛋白和α、β、γ球蛋白；1948年，獲諾貝爾化學獎；生物芯片--微量點樣原理將預先制備好的核酸、多肽或蛋白質燈生物大分子用特殊的自動化微量點樣裝置(精密機械手)以中等密度互不干擾地點印于經過特殊處理的基片上，并使之與支持物牢固結合。微量點樣法一般分接觸法和噴墨法(非接觸法)兩種。2-19質譜分析法是通過對被測樣品離子的質荷比（m/z）的測定來進行分析的一種分析方法。被分析的樣品首先要離子化，然后利用不同離子在電場或磁場的運動行為的不同，把離子按質荷比分開而得到質譜，通過樣品的質譜和相關信息，可以得到樣品的定性定量結果。1912年：Thomson研制了世界上第一臺質譜儀;1922年：Aston固用質譜法發現同位素并將質譜法應用于質量分析而獲得諾貝爾獎；2002年：Fenn和Tanaka發明了生物大分子的質譜分析法而獲得諾貝爾獎。單聚焦質譜儀雙聚焦質譜儀四極桿質譜儀飛行時間質譜儀離子阱質譜儀傅立葉變換質譜儀串聯質譜儀2-97Theligase-mediatedsequencingapproachoftheAppliedBiosystemsSOLiDsequencer.InamannersimilartoRoche/454emulsionPCRamplification,DNAfragmentsforSOLiDsequencingareamplifiedonthesurfacesof1-μmmagneticbeadstoprovidesufficientsignalduringthesequencingreactions,andarethendepositedontoaflowcellslide.Ligase-mediatedsequencingbeginsbyannealingaprimertothesharedadaptersequencesoneachamplifiedfragment,andthenDNAligaseisprovidedalongwithspecificfluorescentlabeled8mers,whose4thand5thbasesareencodedbytheattachedfluorescentgroup.Eachligationstepisfollowedbyfluorescencedetection,afterwhicharegenerationstepremovesbasesfromtheligated8mer(includingthefluorescentgroup)andconcomitantlypreparestheextendedprimerforanotherroundofligation.2-98Principlesoftwo-baseencoding.Becauseeachfluorescentgrouponaligated8meridentifiesatwo-basecombination,theresultingsequencereadscanbescreenedforbase-callingerrorsversustruepolymorphismsversussinglebasedeletionsbyaligningtheindividualreadstoaknownhigh-qualityreferencesequence.2-122Approachestonanoporesequencing.(a)Strand-sequencingusingioniccurrentblockage.Atypicaltraceoftheioniccurrentamplitude(left)throughanα-hemolysinporeclearlydifferentiatesbetweenanopenpore(topright)andoneblockedbyastrandofDNA(bottomright)butcannotdistinguishbetweenthe~12nucleotidesthatsimultaneouslyblockthenarrowtransmembranechanneldomain(redbracket).(b)Exonuclease-sequencingbymodulationoftheioniccurrent.Anexonuclease(paleblue)attachedtothetopofanα-hemolysinporethroughageneticallyencoded(deepblue),orchemical,linkersequentiallycleavesdNMPs(gold)offtheendofaDNAstrand(inthiscase,onestrandofadouble-strandedDNA).AdNMP’sidentity(A,T,GorC)isdeterminedbythelevelofthecurrentblockadeitcauseswhendrivenintoanaminocyclodextrinadaptor(red)lodgedwithinthepore.Afterafewmilliseconds,thedNMPisreleasedandexitsontheoppositesideofthebilayer.(c)NanoporesequencingusingsyntheticDNAandopticalreadout.EachnucleotideinthetargetDNAthatistobesequencedisfirstconvertedintoalongerDNAstrandcomposedofpairsoftwodifferentcode-units(coloredorangeandblueforillustration);eachcode-unitisa12-base-longoligomer.AfterhybridizingtheconvertedDNAwithmolecularbeaconsthatarecomplementarytothecodeunits,thesebeaconsarestrippedoffusingananopore.ThesequenceoftheoriginalDNAisreadbydetectingthediscreteshort-livedphoton-burstsaseacholigoisstripped.(d)Strand-sequencingusingtransverseelectroncurrents.DNAisdriventhroughananoporefunctionalizedwithembeddedemitterandcollectortunnelingprobes(orange)andabackgate(black).TheamplitudeofthetunnelingcurrentsthattraversethroughthenucleotidesisexpectedtodifferentiateeachnucleobaseastheDNAiselectrophoreticallydriventhroughthepore(arrow).2-125SNP同一物種不同個體間染色體上遺傳密碼單個堿基的變化，主要表現為基因組核苷酸水平上的變異引起的DNA序列多態性。SNP是人類可遺傳的變異中最常出現的一種，占所有已知多態性的90%以上，在人類基因組中廣泛存在，大約平均1000個堿基對就會出現一個SNP，估計整個人類基因組30億堿基中至少有300萬個SNP。

SNP大都表現為二等位基因多態性，即在該位置只存在兩種不同的堿基。

SNP作為一種堿基的替換，大多數為轉換(C-T，G-A)，也可能是顛換。在CG序列上出現最為頻繁，多發生C-T轉換，原因是CG中C是甲基化的，它能自發的脫氨基而替換為胸腺嘧啶。

SNP在基因組中可被人為的劃分為兩種形式：一是分布在基因編碼區的功能性突變，稱為cSNP；二是處于非編碼區的大量單堿基變異。從對生物的遺傳性狀的影響來看，cSNP又可分為兩種：同義cSNP、非同義cSNP。2-126以熒光共振能量傳遞(FRET)為基礎的檢測方法。在PCR反應中，將供者-受者染料對分別結合到Taqman探針的兩端，探針未與目標序列結合時，通過FRET作用使供者不發熒光；完全互補配對后，由于TaqDNA聚合酶具有5‘核酸酶的活性，可將供者從探針上切下來從而發出熒光。如果探針與目標序列中存在錯配堿基，會減少探針與目標序列結合的緊密程度及TaqDNA聚合酶切割供者的活性，也就影響了供者的熒光釋放量，從而使堿基突變鏈和正常鏈得以區分。2-127分子信標是一個U型的單鏈核苷酸探針(探針序列內部可有一定程度的互補配對)，在探針兩端也加上供者-受者染料對，U型探針使兩染料靠近，通過FRET作用使供者不發熒光。當探針與目標序列完全互補配對后，兩染料分離，使得供者的熒光亮增加，如果目標序列中存在錯配堿基，就會影響探針與其結合，從而影響到供者的熒光亮，使堿基突變鏈和正常鏈得以區分。2-186Currently,therearetwomainapproachesforSCP.Oneisflowcytometry.Scientistcollectprimarycellsfromhumantissue,thenmaketheproteinslabeling.Allthecellsonbyonepassthruthedetectionwindowofflowcytometry.Fromthedata,scientistcanmapoutthepotentialsignaltransductionpathwayandnetwork.Itisbiologist’sapproach.2-187Almostatthesametime,Dovichiproposedanotherapproach,calledchemicalcytometry.Theydevelopedaverysmart2DCEsystemsandgaveafingerprintofasinglecell.Theadvantageofthisapproachisobvious…However,identificationofproteinisverydifficultbecausetheamountofproteininsinglecellisreallyrear,anditseemsnowaytobecoupledtomassspectrometry.2-189Atthebiochemicallevel,proteinsrarelyactalone,butratherinteractwithoneanother,sometimesincomplexes,tocarryoutspecificcellularprocesses.Twohybridsystems:(+)pairwise/binaryinteractionsbetweenproteins;transientassociatio