園藝植物遺傳育種第一章

緒論第二章經典遺傳與細胞質遺傳第三章數量遺傳第四章園藝植物種質資源與引種馴化第五章選擇育種第六章有性雜交育種第七章雜種優勢利用第八章誘變育種第九章現代生物技術育種第十章新品種的審定與推廣繁育實訓1-15第九章現代生物技術育種9.1概述9.2分子育種的遺傳基礎

9.2.1兩種核酸及其結構9.2.2遺傳信息的傳遞規律9.3基因工程與育種

9.3.1基因工程的原理與技術9.3.2基因工程在園藝植物育種中的應用9.3.3轉基因植物的生物安全性及其對策9.4細胞工程與育種

9.4.1胚胎培養技術9.4.2加倍單倍體技術9.4.3原生質體培養和體細胞融合（雜交）技術9.4.4體細胞突變體篩選技術9.4.5植物快繁技術9.5分子標記輔助育種

9.5.1分子標記及其種類

9.5.2分子標記在育種中的應用

練習與思考

本章小結知識目標●了解分子育種的遺傳基礎●掌握細胞工程的技術方法●了解基因工程的原理與技術以及分子育種技術種類●理解基因工程和分子育種技術在育種實踐中的應用能力目標●能應用細胞工程技術進行育種實踐操作●能開展園藝植物轉基因操作●能正確進行轉基因植物的安全性評價9.1概述生物技術（biotechnology），也稱生物工程（bioengineering），是指以現代生命科學為基礎，結合先進的工程技術手段和其他基礎學科的科學原理，按照預先設計改造生物體或加工生物原料，為人類生產所需的產品或達到某種目的的一門新興、綜合性學科。該學科主要包括細胞工程（cellengineering）、基因工程（geneengineering）技術和分子標記輔助選擇育種（markerassistedselection,MAS）；內容主要涉及組織和器官培養（tissueandorganculture）、體細胞突變體的篩選（mutantsomaticselection）、原生質體培養（protoplastculture）與體細胞雜交（somatichybridization）、單倍體細胞培養（haploidcellculture）、體細胞胚胎發生與生物反應器（somaticembryogenesisandbioreactor）、基因分離和轉移（geneisolationandtransfer）以及分子標記輔助選擇育種（markerassistedselection，MAS）等技術。

以分子育種為前沿標志的生物技術育種在園藝植物育種領域已得到廣泛應用，并逐漸成為改良園藝植物品種、創造和擴繁新種質的捷徑。一批高產、優質、多抗、高效新品種脫穎而出。如黃瓜新品種‘北京206’生長勢較強，可持續結瓜，適于春、秋大棚及春、秋、冬溫室種植；蘋果新品種‘七月’適應性廣，品質優良，綜合經濟性狀優于‘遼伏’、‘貝拉’等早熟蘋果品種。9.2分子育種的遺傳基礎自ＤＮＡ雙螺旋結構被發現以來，隨著分子生物學理論與技術的發展，人們直接深入到ＤＮＡ分子水平改造園藝植物或其他動、植物，從而創造新的動、植物品種。這種通過直接或間接運用現代生物技術手段選育新品種的途徑，稱為分子育種。分子育種技術主要有以下３種：一是選擇優良基因進行ＤＮＡ標記；二是用轉基因方法轉入優良性狀的基因；三是通過計算機技術進行分子設計，以實現分子育種的最佳方法。我國的植物分子育種研究計劃在主要植物分子標記育種技術體系建設上已取得重要進展：科研人員精細定位、克隆了一批新基因，開發了一批功能標記，奠定了開展分子標記育種的技術基礎；獲得了調控植物重要性狀的遺傳網絡信息，初步構建了主要作物分子設計數據庫及分子模擬系統，并應用于品種分子設計育種；已經成功地創制出一批優異育種新材料和應用于生產的新種質。分子遺傳學是分子育種的理論基礎，下述內容主要介紹分子遺傳學的基礎知識。細胞核中的染色體是由核酸和蛋白質組成的，核酸是核苷酸的多聚體，因而它的構成單元是核苷酸。每個核苷酸包括３部分：五碳糖、磷酸和環狀的含氮堿基；堿基包括嘌呤和嘧啶。核酸有兩種：脫氧核糖核酸（ＤＮＡ）和核糖核酸（ＲＮＡ）。試驗證明：大多數生物體都以ＤＮＡ為遺傳信息的原初載體；少數ＲＮＡ病毒以ＲＮＡ為遺傳信息的原初載體；而蛋白質主要是生物體遺傳信息的體現者，與生物體遺傳信息所規定的功能息息相關。9.2.1兩種核酸及其結構兩種核酸的主要區別如下：ＤＮＡ含有的糖是脫氧核糖，ＲＮＡ含有的糖是核糖；ＤＮＡ含有的堿基是腺嘌呤（Ａ）、胞嘧啶（Ｃ）、鳥嘌呤（Ｇ）、胸腺嘧啶（Ｔ），ＲＮＡ含有的堿基前３個與ＤＮＡ完全相同，只有最后１個胸腺嘧啶被尿嘧啶（Ｕ）所代替；ＤＮＡ通常是雙鏈脫氧核糖核酸，ＤＮＡ分子是脫氧核苷酸多聚體。

1953年，沃森和克里克根據Ｘ射線對ＤＮＡ的衍射研究結果以及查格夫（ChargaffE,1951）關于堿基互補配對的原則，闡明了ＤＮＡ分子的空間結構。一個ＤＮＡ分子有兩條多核苷酸鏈，這兩條鏈的走向是相反的，一條是從５′到３′，另一條是從３′到５′，二者呈逆平行狀態形成右手雙螺旋結構。在雙螺旋內側，腺嘌呤與胸腺嘧啶之間配對，形成兩個氫鍵（Ａ==Ｔ）；鳥嘌呤與胞嘧啶之間配對，形成３個氫鍵（Ｇ==Ｃ）。各對堿基之間的距離為0.34ｎｍ，每轉一圈長為3.4ｎｍ，包含10個堿基對，螺旋直徑２ｎｍ（圖9.2.1）。盡管絕大多數ＲＮＡ都是單鏈的，但在ＲＮＡ分子內某些片段也可通過腺嘌呤與尿嘧啶之間配對（Ａ==Ｕ），鳥嘌呤與胞嘧啶之間配對（Ｇ==Ｃ），形成“發夾”狀結構（圖9.2.2）。ＤＮＡ分子的物種特異性主要決定于ＤＮＡ分子中４種堿基的比例和排列順序。（１）不同生物的ＤＮＡ其堿基比例（Ａ＋Ｔ）／（Ｇ＋Ｃ）是不同的，雖然各種真核生物ＤＮＡ的堿基都是Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ４種，但（Ａ＋Ｔ）／（Ｇ＋Ｃ）比例卻不同：高等植物和動物往往Ａ＋Ｔ較多，而且在平均堿基組成上相對一致，但在較低等的真核生物中，（Ａ＋Ｔ）／（Ｇ＋Ｃ）比例的差異就比較大。（２）４種堿基在一條多核苷酸鏈上排列的形式是多種多樣的，組成ＤＮＡ的堿基盡管只有４種，但對任何一個ＤＮＡ堿基位點來說，均有４１＝４種排列方式，即Ａ—Ｔ、Ｔ—Ａ、Ｇ—Ｃ、Ｃ—Ｇ；對兩個堿基位點來說，就有４２＝１６種排列方式；由n個核苷酸連接的核苷酸鏈，就有４n

種排列，即可以構成４n種不同性質的基因，從而使生物性狀表現得千差萬別。中心法則（geneticcentraldogmaｇ）是指遺傳信息從DNA傳遞給RNA，再從ＲＮＡ傳遞給蛋白質，即完成遺傳信息的轉錄和翻譯的過程；也可以從DNA傳遞給DNA，即完成DNA的復制過程。這是所有具細胞結構的生物所遵循的法則。在某些病毒（如煙草花葉病毒等）中的RNA自我復制和在某些病毒（某些致癌病毒）中能以RNA為模板逆轉錄成DNA的過程是對中心法則的補充。細胞的遺傳物質都是DNA，只有一些病毒的遺傳物質是RNA。這種以RNA為遺傳物質的病毒稱為反轉錄病毒（retrovirus），在這種病毒的感染周期中，單鏈RNA分子在反轉錄酶（reversetranscriptase）的作用下，可以反轉錄成單鏈DNA，然后再以單鏈DNA為模板生成雙鏈DNA。雙鏈DNA可以成為宿主細胞基因組的一部分，并同宿主細胞的基因組一起傳遞給子細胞。在反轉錄酶催化下，RNA分子產生與其序列互補的DNA分子，這種DNA分子稱為互補DNA（complementaryDNA），簡寫為ｃDNA，這個過程即為反轉錄（reversetranscription）。9.2.2遺傳信息的傳遞規律9.2.2.1中心法則及其發展朊粒是一種蛋白質傳染顆粒（Proteinaceousinfectiousparticle），它最初被認識到是羊瘙癢病的病原體。研究證明，朊粒不是病毒，而是不含核酸的蛋白質顆粒。一個不含ＤＮＡ或ＲＮＡ的蛋白質分子能在受感染的宿主細胞內產生與自身相同的分子，且實現相同的生物學功能，即引起相同的疾病，這意味著這種蛋白質分子也是負載和傳遞遺傳信息的物質。試驗證明，朊粒不是傳遞遺傳信息的載體，也不能自我復制，而仍是由基因編碼產生的一種正常蛋白質的異構體。因此中心法則可用下圖(圖9.2.3）表示。ＤＮＡ的復制過程非常復雜。首先，在復制起點處ＤＮＡ解旋酶將雙鏈ＤＮＡ解旋，形成復制叉，ＤＮＡ復制過程中，隨著兩條子鏈的延長，復制叉不斷前移。子鏈ＤＮＡ總是按５′向３′的方向進行合成，親鏈中原５′向３′的鏈復制時是連續合成的；而原３′向５′的鏈按岡崎片段復制，再由ＤＮＡ連接酶將其連接成子鏈。復制后每一個新的雙鏈ＤＮＡ分子都是由一條親鏈和一條新合成的子鏈組成（半保留復制）。由于ＤＮＡ的半保留復制是嚴格地按照堿基配對原則進行的，因此，新合成的子鏈ＤＮＡ忠實地保存了親鏈ＤＮＡ所攜帶的全部遺傳信息。通過這樣的復制，基因便能夠代代相傳，準確地保留下去。9.2.2.2

DNA復制與修復ＤＮＡ復制時可能由ＤＮＡ聚合酶引發偶然錯誤，或者由于環境因素（如輻射、致突變的化學物質誘發）致使ＤＮＡ產生序列上的錯誤，此時生物體內的修復系統就會對ＤＮＡ變異起保護修復作用。ＤＮＡ修復主要包括３個步驟：①ＤＮＡ修復核酸酶對ＤＮＡ鏈上不正常堿基的識別與切除；②ＤＮＡ聚合酶對已切除區域的重新合成；③ＤＮＡ連接酶對剩余切口的修補。但ＤＮＡ的損傷或突變也不可能全部被修復，否則就不存在變異，生物也就不可能進化了。因此遺傳是相對的，變異是絕對的，這是生物進化過程中的必然現象。ＤＮＡ結構在一些特殊的條件下（如高溫及強堿），雙鏈ＤＮＡ分子的氫鍵斷裂，兩條鏈完全分離，形成單鏈ＤＮＡ分子，這種情況稱為ＤＮＡ變性（denaturation）。變性的ＤＮＡ分子經處理又可重新形成正常的ＤＮＡ分子，這個過程稱為復性（renaturation）或退火（annealing）。降低溫度、ｐＨ及增加鹽濃度均可促進ＤＮＡ分子的復性（退火）。當復性的ＤＮＡ分子由兩條不同的單鏈形成時，這種復性稱為雜交（hybridization）。9.2.2.3

DNA變性、雜交遺傳的穩定性對于維持生物的生存是很重要的，但生物體的生存必須適應環境變化，因此生物體的ＤＮＡ就會發生一些變異來適應新環境，這是生物進化的原動力。生物遺傳的變化來自ＤＮＡ的重新排列，即基因重組。基因重組具有重要的生物學意義。正是由于ＤＮＡ的變異、基因重組產生新的生物性狀甚至形成新物種，從而使人為地改變生物的遺傳特性成為可能，以獲得符合人類要求的生物新特性和生物新個體，這就是基因工程。9.2.2.4

基因重組9.3基因工程與育種植物基因工程（plantgeneticengineering）是指按照人們的愿望進行嚴密的設計，經過體外ＤＮＡ重組和轉移等技術，有目的地改造植物種性，使現有物種在較短時間內趨于完善，創造出新種質的過程。它是近30年來隨著ＤＮＡ重組技術、遺傳轉化技術及離體培養技術的發展而興起的生物技術。轉基因作物綜合其性狀表現為抗蟲、抗除草劑、抗逆境等，其品質得到改良、生長發育得到調控、產量潛力大幅度提高，產生了巨大的經濟、社會和生態效益。根據國際農業生物技術應用服務組織（ＩＳＡＡＡ）公布的數據，批準種植轉基因作物的國家從1996年（商業化的第１年）的６個增加到2003年的18個，2009年種植轉基因作物的國家達到25個，種植面積達1.34億公頃，比2008年增長７％。基因工程的４要素包括外源ＤＮＡ、受體細胞、載體分子和工具酶，它們是基因工程研究的主要內容。（１）外源ＤＮＡ從分子本質上講，所有的基因都具有相同的化學本質，因此無論是微生物、植物和動物的ＤＮＡ都可以作為另一種生物的外源ＤＮＡ。目前，目的基因主要來源于真核生物染色體組。原核生物的染色體組也有幾百上千的基因，也是目的基因的來源。此外，一些核外遺傳物質，如質粒基因組、病毒基因組、線粒體基因組和葉綠體基因組等也有少量基因，可作為進行與之相關研究時的目的基因。9.3.1基因工程的原理與技術9.3.1.1

基因工程的要素（２）受體細胞大腸桿菌、枯草桿菌、酵母等低等生物體以及各種植物、動物細胞都可以作為基因工程的受體細胞。但是需要這些受體細胞具備在試驗技術上能夠攝取外源ＤＮＡ，并使目的基因穩定存在下去；在試驗目的上是具有應用價值并具有高品質性狀的細胞；同時一個良好的受體細胞還應具有較高的安全性，能高效表達目的基因，便于篩選重組體等特點。（３）載體分子基因工程中，攜帶目的基因進入受體細胞進行擴增和表達的工具稱為載體。載體主要有以下幾類：質粒載體、病毒載體、酵母人工染色體（ＹＡＣ）載體。①限制性核酸內切酶限制性核酸內切酶是一類能夠識別雙鏈ＤＮＡ分子中的某種特定核酸序列，并由此切割ＤＮＡ雙鏈結構的酶。如：EcoＲⅠ、BamＨⅠ、BglⅡ等都是基因工程常用的限制性核酸內切酶。②ＤＮＡ聚合酶ＤＮＡ聚合酶的共同特點在于，它們都能夠以ＤＮＡ為模板，把脫氧核苷酸連續地加到雙鏈ＤＮＡ分子引物鏈的３′－ＯＨ末端，催化核苷酸的聚合作用。ＤＮＡ聚合酶Ⅰ、Ｋｌｅｎｏｗ聚合酶和耐熱的ＴａｑＤＮＡ聚合酶等都是常用的ＤＮＡ聚合酶。

③連接酶ＤＮＡ連接酶能夠催化在兩條ＤＮＡ單鏈之間形成磷酸二酯鍵。目前基因工程中常用的是大腸桿菌ＤＮＡ連接酶和Ｔ４連接酶。④反轉錄酶一種依賴于ＲＮＡ單鏈為模板，通過ＤＮＡ聚合作用形成的ＤＮＡ聚合酶類。基因工程的操作過程大體包括以下幾個主要步驟。（１）取得或制備目的基因獲得目的基因的途徑很多，如可以從植物基因組中利用限制性內切酶直接分離出帶有目的基因的ＤＮＡ片段；可以利用PCR技術從復雜的基因組擴增出基因；或者利用ＤＮＡ合成儀人工化學合成目的基因的ＤＮＡ片段，獲得ＤＮＡ片段完整的目的基因等。9.3.1.2

基因工程的操作步驟（２）構建重組載體將要克隆的ＤＮＡ分子通過黏性末端連接、平整末端連接、同聚末端連接或人工分子連接等方法，與載體ＤＮＡ分子連接起來，形成重組ＤＮＡ分子。構建重組ＤＮＡ時應注意連接一個控制目的基因轉錄表達的啟動子、一個控制目的基因轉錄終止的終止子和一個編碼特殊性質蛋白質的選擇標記基因。（３）基因擴增將構建好的含有外源基因的重組載體導入對應細菌中，利用細菌擴增重組ＤＮＡ，達到基因擴增的目的。（４）重組ＤＮＡ分子導入受體細胞常用的方法有化學刺激法、電擊法、基因槍法、花粉管導入法、根瘤農桿菌Ｔｉ質粒介導法（圖9.3.1）、Ｒｉ質粒介導法及植物病毒載體介導法等。植物遺傳轉化中最常用的是基因槍法、農桿菌Ｔｉ質粒法。通過上述方法，將重組ＤＮＡ分子成功導入受體細胞。目標植物的細胞受體系統可以是植物組織、植物體細胞或原生質體甚至是花粉細胞、卵細胞等生殖細胞。（５）檢測和培養通過選擇標記基因可以檢測經過遺傳轉化的細胞和植物組織，在合適的培養基上培養這些細胞和組織，使之形成大量的轉基因小苗。轉基因小苗還需要進行檢測，目前對轉基因植株的鑒定有ＤＮＡ的Southern雜交（檢測外源基因是否整合到植物染色體上）、Northern雜交（檢測外源基因是否在轉錄水平上表達）以及Western雜交（檢測外源基因是否在翻譯水平上表達）或酶活性分析等方法，可根據目的和條件選用合適的方法。最好還要開展轉基因當代和后續世代的田間目標性狀的測定。檢測過程中均需設立對照。（６）轉基因植物的大規模種植從轉基因植物中選出目的基因表達量高、綜合性狀優良的品種進行大規模種植。9.3.2基因工程在園藝植物育種中的應用從1983年首例轉基因植質改良、生物反應器等方面。迄今國內、外批準商業化應用的各類轉基因植物已近90種，僅美國和加拿大就超過50種。全球種植的大豆、玉米、棉花和卡諾拉油菜中有１/５以上是轉基因作物。基因工程在園藝植物育種上的應用目前主要有以下幾個方面。9.3.2.1創造園藝植物新種質通過基因工程可創造常規育種手段難以獲得的園藝植物新種質。例如，通過揭示控制花瓣色彩的各種色素的生化合成過程，分離出與花色素合成有關的一些關鍵基因，并將其轉入觀賞園藝植物中，從而為創造園藝植物新種質開辟了道路。湖北大學生命科學院研制出一種熒光促進劑，通過科學“誘導”，激發植物體內潛在發光物質發出熒光。無論是名貴的蘭花，還是普通的月季或菊花，在花朵含苞待放時，只需將這種特制的熒光促進劑噴灑在花瓣上１次，這種花卉整個花期內都會在黑暗中發出熒光。另外，科學家對花瓣條紋、彩斑等方面的研究也取得很大進展。日本三得利（Ｓｕｎｔｏｒｙ）公司于２００４年６月３０日公布了世界首株成功開發的藍色玫瑰花的消息，該株玫瑰花的花瓣中所含的色素為藍色，純度接近１００％。9.3.2.2改良品質一般糧食種子的儲存蛋白質中幾種必需氨基酸的含量較低，直接影響到人類主食的營養價值。例如，禾谷類蛋白質的賴氨酸含量低，豆類植物的甲硫氨酸、胱氨酸、半胱氨酸含量低，將富含賴氨酸和甲硫氨酸的蛋白質編碼基因植入玉米中，可顯著提高其營養價值。目前已經推出‘ＧｏｌｄｅｎｒｉｃｅⅡ’，該品種是將水仙花中的兩個基因和細菌中的一個基因一起導入水稻基因組，使水稻中的鐵元素、鋅元素和維生素Ａ的含量提高，有效防止貧血和維生素Ａ缺乏癥。康乃馨花期較短，為了延長花期，澳大利亞的生物技術專家在康乃馨植株中引入一種基因，使花期延長１倍，提高了觀賞性。9.3.2.3提高抗病蟲能力用基因工程技術提高植物抗病蟲能力是十分有效的。荷蘭一家植物生物技術公司應用轉基因技術培育出一種抗真菌草莓新品種，減少了草莓病害，并延長了草莓保鮮期，經濟效益明顯增加。蘇云金芽胞桿菌（Bacillusthuringiensis，簡稱Bt）基因表達產物為毒性蛋白質，對鱗翅目和鞘翅目的昆蟲（如小菜蛾）有很強的殺傷作用，但對脊椎動物無毒，該基因被轉入棉花、楊樹、油菜等植物中，使植物的抗蟲能力極大提高。雪花蓮凝集素（galanthus

nivalisagglutining，GNA）是目前與害蟲治理有關且研究得比較多的一種單子葉植物甘露糖結合凝集素，GNA對同翅目的蚜蟲、葉蟬和稻飛虱表現出一定的毒殺作用，對咀嚼式口器的害蟲表現出中等毒殺作用，但對哺乳動物基本無毒。近年來，人們采用基因工程的方法，將GNA基因導入水稻、煙草、小麥、玉米、萵苣、棉花、番茄、甘蔗、大白菜、油菜、新疆甜瓜等糧食或經濟作物中，結果表明，轉基因植株對同翅目的蚜蟲表現出較好的防治效果。9.3.2.4改善抗逆性植物對外部環境的適應能力可通過基因工程技術大幅度提高。將熱激蛋白質基因經過一定改造后導入植物，可大幅度提高其抗熱性，拓展種植范圍。常用耐受脅迫相關的基因有編碼甘露醇的mtID

基因和編碼山梨醇的gutD

基因；真核生物的海藻糖合成酶基因Tps１和Tps２；催化谷氨酸合成脯氨酸的P5CS基因；合成甘氨酸甜菜堿的膽堿脫氫酶（ＣＤＨ）和膽堿氧化酶（ｃｏｄＡ）的基因等。這些基因的產物都能提高植物細胞的滲透壓，提高植物抗寒、抗凍、耐旱、耐鹽的能力。據報道，哈爾濱師范大學將深海魚美洲擬鰈的抗凍基因通過柱頭導入番茄，獲得可耐受-５～-４℃低溫的轉基因番茄。9.3.2.5提高光合作用和固氮效率通過提高二氧化碳固定反應中的二磷酸核酮糖羧化酶（Rubisco）的活性，降低其加氧酶活性，可顯著提高光合生產率。Rubisco是由葉綠體基因編碼的８個大亞基（ｒｂｃＬ）和由核基因編碼的８個小亞基（ｒｂｃＳ）組成的，將不同植物的Rubisco導入植物細胞形成雜合亞基酶分子或誘導點突變，修飾酶活性可達到提高光合效率的目的。把生物固氮的基因工程運用于農業生產，目標主要有兩個：一是把非豆科作物，尤其是禾谷類作物轉變成固氮作物；二是提高現有固氮作物的固氮能力。1982年，Dwjong等率先把根瘤菌共生質粒（攜有共生基因）的轉移應用到育種中去，他們將豌豆根瘤菌128Ｃ53中的共生質粒ｐＩＪ1008導入豌豆根瘤菌300菌株中，經盆栽結瘤試驗證明可使后者接種植株的固氮量增加３０％、干重增加１５％。此后，在大豆、菜豆、紫云英等植物中都進行了類似的研究，發現接受了外源共生基因的根瘤菌的競爭結瘤能力及固氮酶活性的確有明顯變化，有的提高，有的降低。因此，闡明外源共生基因的作用機制以及尋找合適的外源共生基因的供體和受體是很有必要的。9.3.2.6創建雄性不育材料

1992年，Ｗorral等用編碼β－１，３－萄聚糖水解酶基因轉化煙草、矮牽牛獲得雄性不育植株。1993年，LeemansＪ將核糖核酸酶基因嵌合到油菜染色體中，使其只在花藥的氈絨層中專性表達引起油菜雄性不育。目前，已發現許多可導致植物雄性不育的基因，正在進行開發利用。9.3.2.7延遲成熟與保鮮果實細胞壁降解與果膠酶（多聚半乳糖醛酸酶ＰＧ和果膠甲酯酶ＰＥ）活性有關，通過ＰＧ和ＰＥ的克隆和反義遺傳轉化所獲得的番茄轉基因植株，其果實中ＰＧ和ＰＥ的活性受到顯著抑制，從而延遲果實的成熟。美國Ｃａｌｇｅｎｅ公司將ＰＧ反義基因導入番茄，培育成轉基因新品種‘Ｆｌａｖｓａｖｒ’于1994年被批準上市。1996年，葉志彪等通過用反義基因抑制ＡＣＣ合成酶的表達活性，抑制乙烯的合成，從而育成耐貯藏的轉基因番茄。9.3.2.8選育抗除草劑品種

1987年，科學家成功地從矮牽牛中克隆出在芳香族氨基酸生物合成中起關鍵作用的ＥＰＳＰ合成酶的基因，轉入油菜后，其葉綠體中ＥＰＳＰ合成酶的活性大大提高，對ＥＰＳＰ合成酶起抑制作用的高效廣譜滅生性除草劑草甘膦產生有效抗性。通過把降解除草劑的蛋白質編碼基因導入宿主植物，從而保證宿主植物免受其害的方法已引起重視，并在煙草、番茄、馬鈴薯、油菜、大豆、楊樹中獲得轉基因抗磷酸麥黃酮類除草劑的品種等。美國一家生物技術公司推出了轉基因的匍匐翦股穎對草甘膦具有抗藥性，種植者可以完全放心地將草甘膦噴灑在抗性翦股穎草坪上，在殺死雜草的同時，不用擔心翦股穎會受到傷害。轉基因作物耐農達ＲＲＲ除草劑甜菜在美國和加拿大已經實現了商業化。9.3.2.9植物生物反應器

利用轉基因植物作為生物反應器生產藥用蛋白質的研究逐漸受到各國的重視，研究探索的熱點之一是利用轉基因植物生產口服疫苗。中國農業科學院生物技術研究所的科研人員將乙型肝炎病毒表面抗原基因導入馬鈴薯和番茄，通過飼喂小鼠試驗檢測到較高的保護性抗體，濃度足以對人類產生保護作用。該所還進行了利用植物葉綠體作為生物反應器生產藥用蛋白質的探索，目前已將丙肝病毒（ＨＣＶ）抗原基因導入衣藻葉綠體。利用轉基因植物生產口服疫苗可以大大降低疫苗的生產成本，在發展中國家更有良好的發展前景。隨著我國1986年11月啟動實施了“高技術研究發展計劃”（863計劃），轉基因的研究步伐加快。21世紀植物轉基因技術對于我國農業的可持續發展和食物安全將發揮重要的作用。從目前情況看，抗蟲、抗除草劑基因工程產品開發較快，抗病基因工程的研究開發需要進一步深入，抗逆、改良品質、生長發育等基因工程還有待基礎研究及取得新的突破。9.3.3轉基因植物的生物安全性及其對策轉基因作物在進行商品化生產之前，必須進行轉基因生物安全性評價，必須完成各種安全評價程序和試驗環節。研發單位在申請安全性評價時提交該轉基因作物詳盡的分子生物學資料，并通過國家指定的具有資質的機構進行食品安全性評價；同時還要通過中間試驗、環境釋放、生產性試驗等一系列田間試驗，獲得生態環境安全性的資料，全過程一般需要６～８年。全部項目通過安全委員會綜合評價以后須經農業部批準商品化生產，確保轉基因作物的食品和生態環境安全。9.3.3.1轉基因植物的環境安全性環境安全性評價要回答的核心問題是轉基因植物釋放到田間去是否會將基因轉移到野生植物中，或是否會破壞自然生態環境，打破原有生物種群的動態平衡。國內、外專家對于轉基因給土壤生物和生物多樣性帶來的影響研究不多，但該問題也備受關注。Ｓａｘｅｎａ等發現Bt殺蟲蛋白質可以通過根部滲出物進入土壤中，并且在適宜的土壤中持久的保持殺蟲活性。總之，轉基因植物的大規模種植，會對生物群落造成或多或少或直接或間接的影響。轉基因的逃逸是指導入植物的目的基因向野生的近緣種等非目標生物流動。如果抗除草劑植物的花粉將基因轉移到雜草中，將產生具有抗除草劑特點的“超級雜草”；外源基因隨花粉、風、雨、鳥、昆蟲、細菌擴散到整個生物鏈體系中，則可能對非靶生物造成基因污染而無法清理，只能永遠繁殖下去；轉基因植物在生存競爭上具有優勢，導致生態系統生物多樣性降低。因此，我們必須嚴格控制被轉基因，以防其逃逸到自然環境中去。如使用安全載體和受體，造成轉基因生物與非轉基因生物之間的生殖隔離等。這樣，轉基因生物在進入自然環境中以后就不可能自行繁殖，因此也就不可能對生態系統造成長期的影響。抗病毒轉基因植物的風險主要是病毒的重組和異源包殼問題。對于導入植物體的病毒外殼蛋白質對人和其他生物本身是無害的，但是一旦它包裝了其他的病毒核酸，則可能產生病毒重組的潛在危險。目前，已采取了一些措施防止重組病毒的產生，如限制導入基因的長度、禁止使用產生功能性蛋白質的基因等。9.3.3.2轉基因植物的食品安全性食品安全性也是轉基因植物安全性評價的一個重要方面。經合組織于１９９３年提出食品安全性評價的實質等同性原則。即如果轉基因植物生產的產品與傳統產品具有實質等同性，則可以認為是安全的；如轉病毒外殼蛋白質基因的抗病毒植物及其產品與田間感染病毒的植物生產的產品都帶有外殼蛋白質，這類產品應該認為是安全的；若轉基因植物生產的產品與傳統產品不存在實質等同性，則應進行嚴格的安全性評價。在進行實質等同性評價時，一般需要考慮以下兩個方面的問題。（１）有毒物質必須確保轉入外源基因或基因產物對人畜無毒。如轉Bt殺蟲基因玉米除含有Bt殺蟲蛋白質外，與傳統玉米在營養物質含量等方面具有實質等同性。要評價它作為飼料或食品的安全性，則應集中研究Bt蛋白質對人畜的安全性。目前，已有大量的試驗數據證明Bt蛋白質只對少數目標昆蟲有毒，對人畜絕對安全。（２）過敏源在自然條件下存在許多過敏源。在基因工程中如果將控制過敏源形成的基因轉入新的植物中，則會對過敏人群造成不利的影響。所以，轉入過敏源基因的植物不能批準商品化生產。如美國有人將巴西堅果中的２Ｓ清蛋白基因轉入大豆，雖然使大豆的含硫氨基酸增加，但也未獲批準進入商品化生產。另外還要考慮營養物質和抗營養因子的含量等。9.3.3.3轉基因植物生物安全性問題的對策對于轉基因植物的生物安全性問題，應排除狹隘的商業利害和信仰偏見的干擾，在目前科技水平還難以精確預測全部后果的情況下，采取避害趨利的必要措施。現將有關方面已經提出的策略、措施介紹如下：（１）深化和完善轉基因技術為了避免轉基因帶來的風險，應不斷完善轉基因過程中的相關技術。如采取轉入雙價基因的方法，即同時轉入目的基因和雄性不育基因，來阻斷轉基因植物花粉傳播可能帶來的外源基因擴散問題；為了防止轉基因過程中采用標記基因造成的生物安全問題，開展有關無標記遺傳轉化系統的開發和研究等。（２）加強對遺傳工程生物體及其產品的安全性和其他可能產生的危害進行研究研究和開發轉基因產品過程中，必須加強其安全性防范的長期跟蹤研究。（３）建立完善的檢測體系和質量審批制度為確保轉基因產品進出口的安全，必須建立一整套完善的、既符合國際標準又與我國國情相適應的檢測體系，構建嚴格的質量標準審批制度。審批機構應獨立于研發機構之外，也不應受到太多的行政干預。（４）不斷完善相關法規轉基因產品安全性法規的建立和執行應該以嚴格的檢測手段為基準，同時應培養一批既懂生物技術知識、又能駕馭法律的專門人才。（５）加強宏觀調控有關決策層應對轉基因產品的產業化和市場化速度進行有序調控。任何轉基因產品安全性的防范措施都必須建立在對該項技術的發展進行適當調控的前提下，否則在商業利益的驅使下只能是防不勝防。（６）加強對公眾的宣傳和教育，為公眾提供良好的咨詢服務通過多渠道、多層次的科普宣傳教育，培養公眾對轉基因產品及其安全性問題的客觀公正意識，從而培養對轉基因產品具有一定了解、認識和判斷能力的消費者群體。這對于轉基因產品能否獲得市場的有力支撐是至關重要的。同時，應該設立足夠數量的具有高度權威性的相關咨詢機構，從而為那些因缺乏專業知識而難以對某些轉基因產品作出選擇的消費者提供有效的指導性幫助。（７）規范轉基因產品市場必須培育健康、規范的轉基因產品市場。轉基因產品的安全性決定其在市場中的發展潛力。因此，有關轉基因產品質量及其安全性的廣告宣傳應該具有科學性和真實性。一旦消費者因廣告宣傳而受誤導或因假冒產品而被欺騙，轉基因產品就會因消費者的望而生畏從而失去市場。9.4細胞工程與育種植物細胞工程是以植物細胞全能性為理論基礎，以植物組織與細胞培養為技術支持，在細胞和亞細胞水平對植物進行遺傳操作，實現植物改良和利用或獲得植物來源的生物產品的生物技術。植物細胞工程主要包括植物組織培養技術、胚胎培養技術、體細胞突變體篩選技術、原生質體培養與細胞融合（體細胞雜交）技術、加倍單倍體技術等。近年來，這些技術及其與常規育種技術的有效集成在快速繁育、種質保存、品種選育和遺傳改良等許多領域得到廣泛應用，顯示出巨大的潛力。9.4.1胚胎培養技術植物胚胎培養是胚、胚珠、子房和胚乳的離體培養技術，其應用領域包括胚胎的發育機制、克服雜交不親和性、胚拯救、克服珠心胚的干擾、打破種子休眠、獲得體細胞胚和人工種子、建立植物高效再生體系等，并在農作物、園藝作物、林木和藥用植物上廣泛應用。9.4.1.1胚培養胚胎發生過程是從合子進行第１次分裂開始，由未分化到分化直到分生組織形成、幼胚建立的連續漸進變化的過程。不同發育階段的胚培養要求不同的培養條件，溫度和光照等環境條件也會影響到成敗。在子葉期之前的幼胚培養成功率與胚的大小有密切關系，多數研究表明，胚齡大小與成功率呈正相關，小于0.5ｍｍ的幼胚很難進行培養。在未成熟胚胎的培養中，常見有３種明顯不同的生長方式：第１種是繼續進行正常的胚胎發育，維持“胚性生長”；第２種是在培養后迅速萌發成幼苗，而不繼續進行胚性生長，通常稱為“早熟萌發”；第３種是在許多情況下先形成愈傷組織，并由此再分化形成多個胚狀體或芽原基，這種胚性愈傷組織是建立細胞懸浮培養系或分離原生質體的良好原始材料。9.4.1.2胚珠和子房培養胚珠培養時，外植體的選取應注意胚珠授粉的天數，對于球形胚或發育程度更高的胚珠，通過培養較易得到成熟種子。Maheshwari等將授粉６天后的罌粟離體胚珠進行培養，獲得了有生活力的種子。培養基的滲透壓會影響離體胚珠的發育，這對于較細嫩的胚珠更需強調之。如矮牽牛授粉后５天的球形期胚珠，在含４％～１０％（質量分數）的蔗糖培養基中較合適；而對于合子胚期的胚珠，最適的蔗糖濃度為６％（體積分數）；若在受精后進行培養，其蔗糖最適濃度為８％（體積分數）。此外，胎座對于胚珠培養也十分重要。

1942年，RueＬ首次開展了被子植物子房的培養；1951年，Nitsch成功培養了黃瓜、草莓、番茄、煙草和菜豆等的離體胚，從而奠定了子房培養技術。維生素和植物激素對于子房培養有顯著作用。Maheshwari等以授粉１天的屈曲花子房為外植體，在含無機鹽和蔗糖的培養基上發現胚比自然形成的小；而在培養基中添加維生素Ｂ后，則獲得正常大小的果實；若再在培養基中添加ＩＡＡ，果實比自然形成的還大。天然植物提取物對于子房培養也有作用，如在蒔蘿和天仙子的合子期或雙細胞原胚期的子房培養中，培養基中若添加椰子汁，其果實大小可超過天然果實。9.4.1.3胚乳培養在胚乳培養中，產生愈傷組織或胚狀體的能力與胚乳發育的時期有密切的關系，一般而言，處于旺盛生長期的胚乳最易誘導產生愈傷組織。但不同植物也有不同，蘋果、柚、黃瓜等未成熟胚乳培養比較適宜的時期是在授粉后７～１４天，超過一定時期則不能誘導愈傷組織；而巴豆、麻瘋樹、變葉木、荷葉芹等都需要在胚乳成熟期進行培養，不僅誘導出愈傷組織，還有器官分化。胚乳培養常用的基本培養基有White、ＭＳ和ＭＴ等，其中ＭＳ培養基用得最多。培養基中添加一定的天然提取物有利于獲得成功，如變葉木和葡萄的胚乳培養，若加一定量的椰子汁對于愈傷組織的誘導和生長是必需的。胚乳培養的主要目的是獲得具有利用價值的三倍體植株。1973年，印度的Srivastava首次從羅氏核實木的成熟胚乳成功培養出三倍體再生植株。目前，有40多種植物的胚乳培養達到了不同程度的細胞分化和器官分化，不少植物已得到再生植株。我國在馬鈴薯、小麥、水稻、蘋果、桃、獼猴桃等10多種植物上得到了胚乳再生植株。胚乳培養還可作為研究淀粉等營養物質合成和代謝的試驗體系。通過胚乳培養產生的一些非整倍體，可以作為遺傳分析的材料。但相對于其他植物器官、組織和細胞的培養，胚乳培養相對較難，故應用并不普遍。9.4.1.4離體授粉、受精植物離體受精可以通過離體柱頭授粉、離體子房授粉、離體胚珠授粉、離體精細胞和卵細胞融合等方法實現。該技術可以克服植物雜交不親和的問題，同時也可以進行胚胎、種子和果實發育機制等基礎研究。人工分離的精細胞和卵細胞融合后進行合子胚培養，已在玉米等植物上獲得成功。植物離體受精技術是植物細胞工程中的重要試驗技術，為研究植物胚胎發育機制提供了新的試驗系統，為開發新的植物轉基因途徑提供了可能。9.4.2加倍單倍體技術加倍單倍體技術（doublehaploidtechnology）是指利用植物組織培養技術培養單倍體植物材料（花藥、花粉、未受精的子房和胚珠）獲得單倍體植物，然后通過自然或人工加倍的方法獲得雙倍體植株的技術，其中以花藥和花粉培養應用最為廣泛。9.4.2.1花藥培養在離體培養條件下，要使花藥中的花粉改變其正常發育方向而形成單倍體植株，需要各種因素來共同調節和控制。外因方面與培養基成分、植物生長調節劑種類、糖濃度、培養溫度和光照有關；內因主要決定于花藥中花粉發育的時期，最適宜的時期因植物種類和品種而不同，一般從單核早期到雙核期。此外，供體植株的生長條件和植株年齡也會影響花藥的培養。在花藥培養中，特別是通過愈傷組織形成的植株，常有倍性變異。形成非單倍體的原因有核融合、不正常的非單倍體花粉誘導生長、花藥壁和花絲等參與愈傷組織的形成等。為此，可采取花粉培養方法或控制激素水平，抑制體細胞組織的發育而促進小孢子的發育。9.4.2.2花粉（小孢子）培養花藥中的小孢子母細胞通過減數分裂形成小孢子，小孢子核分裂形成生殖細胞和營養細胞后成為雄配子體，即成熟花粉。通常我們把小孢子和雄配子體統稱為花粉。花粉培養實際上包括單核期花粉培養、雙核期花粉培養和成熟花粉培養３種。嚴格地講，小孢子只包括四分體解離后至第１次核有絲分裂時期的細胞，“小孢子培養”單指單核期花粉培養。但是，在培養工作中，由于花粉培養以小孢子培養為主，有時也將花粉培養與“小孢子培養”通用，將雙核期花粉培養甚至成熟花粉培養等統稱為“游離小孢子培養”。花粉培養主要應解決好花粉的分離及其培養兩個環節。分離花粉的方法有機械分離法和自然散落法兩種。常用的花粉培養方法主要有淺層液體培養法、看護培養法、平板培養法和微室懸滴培養法。花粉培養與花藥培養的最大區別在于，它是將花粉從花藥中分離出來，以單個花粉粒作為外植體進行離體培養的技術。因此花粉培養具有下列優點：①可避免花藥培養過程中因存在有害物質出現阻遏小孢子啟動第１次分裂的問題，使小孢子胚胎及其再生植株的產量遠高于花藥培養；②無論是經愈傷組織或胚狀體，最終獲得的小植株均為單倍體或雙單倍體，從遺傳學上而言均是純合植株；③小孢子培養可觀察由單細胞到雄核發育的全過程，誘變處理時，花粉能均勻地接觸化學和物理誘變劑，可揭示花粉吸收、轉化和誘變機制，因此它可作為遺傳與發育及誘變機制研究的理想材料。9.4.2.3離體雌核發育雌核發育（gynogenesis）是植物存在的自然現象，在離體條件下可以通過培養未受精的子房和胚珠產生單倍體植株，也可以在活體條件下通過授以不同種類的花粉或通過物理方法處理（如輻照處理）的花粉誘導雌核發育，目前已在小麥、水稻、玉米、甜菜、向日葵、馬鈴薯、西葫蘆、洋蔥、黃瓜、非洲菊、百合、小黑楊、三葉橡膠、煙草、矮牽牛等１０多種植物上獲得成功。影響雌配子體誘導產生單倍體的影響因素有供體植物的基因型、供體植物的生長環境、預處理、培養基等。離體條件下誘導孤雌生殖獲得加倍單倍體的技術發展時間不長，現已開始應用于作物的改良、構建遺傳分析和轉基因的受體材料。9.4.3原生質體培養和體細胞融合（雜交）技術植物原生質體是被去掉細胞壁的具有生活力的裸細胞。由于原生質體比完整的細胞更容易攝取外來遺傳物質、細胞器以及細菌和病毒等微生物，為研究高等植物遺傳轉化問題提供了較好的試驗材料。同時，原生質體在一定條件下可以誘導融合形成雜種細胞并分化形成植株，為育種開拓了一條新途徑，從而引起了人們的廣泛重視。原生質體培養和體細胞雜交的步驟如下。（１）原生質體的分離要進行原生質體培養及體細胞雜交，首先要獲得大量有活力的原生質體。已經從多種材料中成功地游離出原生質體，如葉、花瓣、果肉、莖髓部、子葉、下胚軸、幼小的根、莖、葉、愈傷組織和懸浮細胞等，不同材料常具有某些不同特點，用得最普遍的是葉肉細胞、愈傷組織和懸浮細胞。通常高等植物細胞壁的主要成分是纖維素，但也含有少量半纖維素、果膠質和蛋白質。不同植物細胞類型或不同生長發育時期其細胞壁的組成和結構也不相同。要去掉細胞壁獲得有生活力的原生質體通常用一步酶解法，即把一定量的用于酶解細胞壁的酶類（果膠酶、纖維素酶、半纖維素酶和蝸牛酶等）組成混合酶溶液，材料放入其中處理即可分離得到原生質體。研究表明，原生質體的產量和質量受組織和細胞的生理狀態、酶的種類、溶液的組成成分以及滲透穩定劑（Ｃａ２＋）的類型和濃度等的影響。在分離原生質體的過程中常有很多殘余物，應進行純化，方法有離心沉淀法、飄浮法、滴洗法等。得到的原生質體應用形態、活性染色、熒光染料染色等方法測定活力。（２）原生質體的培養培養原生質體的基本營養同一般組培，但對某些組分，如鈣和碳源的水平要求更為嚴格。由于原生質體沒有細胞壁，在培養基中保持一定的滲透壓極為重要，故采用適當的培養基是獲得培養成功的關鍵之一。常用的原生質體培養基有ＭＳ培養基、Ｂ５培養基等。多數植物的原生質體適宜培養后１～３天再生新細胞壁，表現在原生質體體積稍有增加、膨大，繼而由圓形變為卵圓形，這是新壁形成的特征。在胞壁形成的同時，胞質增加，液泡減少或消失，葉綠體或顆粒內含物可分散在胞質中也可圍繞在細胞核的周圍，并開始出現分裂，多數能進行持續分裂。許多植物的分裂結果是形成愈傷組織，有的形成胚狀體然后長成植株，有的先形成愈傷組織，再在愈傷組織上形成胚狀體，經進一步的培養和處理可發育成為完整植株。（３）體細胞雜交以體細胞原生質體為親本進行融合的一種細胞工程技術，是建立在植物組織、細胞培養和原生質體培養的基礎上。主要包括以下３個環節：①原生質體融合主要有ＰＥＧ法、電融合法、高鈣高ｐＨ法、ＮａＮＯ３法等；②雜種細胞篩選目前主要采用突變細胞遺傳互補選擇法、營養互補選擇法和根據原生質體特性差異的機械選擇法；③體細胞雜種植株鑒定主要方法有形態學方法、細胞學（染色體）方法、同工酶法、分子標記法、熒光原位雜交技術等。原生質體培養和體細胞雜交是植物細胞工程的核心技術之一，為克服植物遠緣雜交不親和性、創造新的種質資源、實現植物遺傳轉化和進行細胞學基礎研究提供了重要的技術支撐。目前，獲得的原生質體再生植株包括糧食作物、蔬菜、果樹、花卉、林木、藥用植物以及真菌和海藻等。利用體細胞融合技術可以克服有性雜交不親和性，創造新的物種或類型，實現植物種間、屬間，甚至科間的體細胞雜交，如番茄＋馬鈴薯、甘薯栽培種＋野生種、甘藍＋白菜、擬南芥＋甘藍型油菜、酸橙＋甜橙、紅橘＋枳殼的雜種培育等。利用細胞融合技術還獲得了一些特異的新種質，如細胞質雄性不育水稻、細胞質雄性不育煙草等。盡管目前已在多種植物上建立了體細胞雜交和遺傳操作的技術程序，但還有相當多的植物在原生質體培養上存在技術困難，仍需進一步加強多學科的交叉研究以及技術集成和創新。9.4.4體細胞突變體篩選技術隨著國內、外學者應用組織培養技術篩選突變體取得一些成果，組織培養逐漸成為遺傳變異的一個重要來源。近年來，除了利用愈傷組織繼代過程中產生的自發突變以外，還采用射線、甲基磺酸乙酯等物理或化學因素誘發變異，并在細胞水平上進行抗性突變體的篩選，可以大大減少植物改良所需投入的人力、物力。與常規育種方法相比，離體篩選具有以下優點：①可以獲得廣泛的變異類型，甚至產生自然界尚未發現的突變，為抗病選擇提供遺傳基礎；②可以在較小空間內培養和處理大量細胞；③在細胞水平上直接誘發和篩選突變體，是高等植物抗性育種微生物化的一種嘗試，易于從單倍體細胞選出隱性突變，經加倍成為二倍體或雙倍體，較快地得到純合穩定的抗病材料；④在人工控制條件下體外定向選擇，易于進行同位素示蹤、半微量分析等試驗，不受地區和季節限制；⑤可以從細胞、組織及整株水平上進行生化、遺傳和抗病機制的研究。（１）突變細胞的篩選方法常用的有直接選擇法和間接選擇法。直接選擇法是指新的突變表型在選擇條件下能優先生長，或預期在感觀上可測定其他可見的差異。直接選擇法分為正選擇和負選擇兩種類型。正選擇是用一種含有特定物質的選擇培養基，在此培養基中正常型的細胞不能生長，只有突變體才能生長，借此可以分離出突變體細胞。如果加入培養基中的選擇劑的劑量較高，可以一次性地有效抑制或殺死所需突變體以外的其他細胞，使突變體保留下來，這種選擇方式稱為一步選擇系統。但若開始加入培養基的選擇劑劑量較低，在較長時間內只有少量的細胞生長，９０％的細胞不能生長，從中選擇生長較好的細胞，然后依次增加選擇劑的濃度，進行第２輪、第３輪的篩選，最后得到抗性的細胞，這種選擇方式稱為多步選擇系統。一步選擇系統得到的突變體較多是單基因突變。多步選擇系統的生化背景不詳，獲得的突變體可能是多基因變化的突變體，這種突變體較為有效。負選擇是用特定的培養基使突變體細胞處于不能生長的狀態，而正常型的非突變細胞則可以生長，然后用一種能使生長中的細胞中毒死亡的汰選劑淘汰這些細胞，最后使未中毒的突變細胞恢復生長并分離出來。負選擇法常用于分離營養缺陷型突變細胞。間接選擇法是借助與突變表型有某種相關的特征作為間接選擇指標的選擇方法。如在離體培養細胞中直接選擇抗旱性是困難的，可通過選擇抗羥脯氨酸類似物的突變體，從而間接篩選抗旱突變體。此外，突變體還可利用ＲＦＬＰ、ＲＡＰＤ、ＡＦＬＰ、ＳＳＲ、ＳＣＡＲ等分子標記技術（詳見9.5節內容）進行選擇。（２）突變性狀的遺傳基礎及其穩定性鑒定利用選擇培養基開展突變體選擇時，能夠在選擇培養基上生長的細胞并非均為突變細胞。一部分細胞有可能由于沒充分與選擇劑相接觸而殘留下來，還有可能經過選擇后獲得的是非遺傳的變異細胞。鑒別經選擇出來的細胞是否性狀穩定時，常用的方法是讓細胞或組織在沒有選擇劑的培養基上繼代培養，如果仍能表現選擇出來的變異性狀，便可確認為是突變細胞或組織。鑒別從變異細胞或組織再分化形成的植株是否為突變植株時，可用所形成的植株開花結實后的發芽種子或者用種子長成的植株為材料，誘導其形成愈傷組織，再轉移到含有選擇劑的培養基上進行檢驗。如果所選擇的突變性狀是可以在植株個體水平表達的性狀時，如抗病性等，也可以用再生植株本身進行鑒定。細胞突變的誘發以及細胞突變體的篩選標志著誘變育種已向細胞水平進展。目前，利用培養細胞與組織進行離體篩選的研究主要集中在營養缺陷型、抗病、抗鹽、抗除草劑、抗溫度脅迫、抗水分脅迫等突變體的篩選方面。通過突變體的離體篩選已得到抗黑根病的甘藍、抗青枯病和萎蔫病的番茄、抗枯萎病的芹菜、抗根腐病的萵苣、抗萎蔫病的馬鈴薯、抗枯萎病的菜豆、耐鹽的楊樹、耐堿的毛白杜鵑、抗潰瘍病的歐洲落葉松等。但由于這一技術歷史較短，在應用上受到組織培養技術、分離篩選突變體的方法和水平，以及變異表型能否穩定等多方面的限制。只有在搞清細胞變異體表型發生變化的原因、性質及其遺傳傳遞規律的基礎上，細胞突變體的篩選及其利用才能發揮更大的作用。9.4.5植物快繁技術植物快繁技術應用于高附加值經濟植物、珍稀瀕危植物、轉基因植物、育種原種以及植物脫毒苗的快繁，是植物細胞工程中應用最為廣泛的技術，取得了顯著的經濟效益。利用超低溫保存種質法結合快繁技術可以實現植物種質資源的中長期保存和利用；通過莖尖培養或利用組織培養技術并結合物理、化學方法獲得無毒苗，成為植物細胞工程技術的重要方面。我國開展植物快繁技術研究較早，于２０世紀７０年代中期開始規模化植物快繁脫毒的研究和應用，植物種類包括果樹、蔬菜、花卉、林木、藥用植物等，其中以脫毒馬鈴薯、蘭花、甘蔗、香蕉、葡萄、草莓、蘋果、柑橘、楊樹等規模較大。植物快繁生物反應器的出現為植物快繁技術帶來根本性變革，成為快繁技術發展的新方向。植物快繁生物反應器具有生產規模大、便于自動化控制、顯著降低玻璃化苗的比例、降低成本和污染以及節約人力資源等特點，目前已在木薯、馬鈴薯、咖啡、橡膠、菠蘿、甘蔗、香蕉、蘋果、梨等植物上獲得成功。利用生物反應器生產大量繁殖體和制作人工種子，可實現人工種子生產的規模化，為植物快繁、雜種優勢利用和種業發展帶來革命性的變化。9.5分子標記輔助育種生物技術的發展給植物遺傳育種研究提供了新的手段，分子標記作為一種基本的遺傳分析手段，是繼形態標記、細胞標記和生化標記之后發展起來的一種新的較為理想的遺傳標記（geneticmarker）。遺傳標記是指可以穩定遺傳的、易于識別的、特殊的遺傳多態性形式。9.5.1分子標記及其種類自20世紀80年代初發展起來的分子標記技術是通過遺傳物質ＤＮＡ序列的差異來進行標記，具有以下優點：①直接以ＤＮＡ的形式表現，在植物的各個組織、各發育時期均可檢測到，不受季節、環境的影響，不存在表達與否的問題；②數量極多，遍及整個基因組；③多態性高，自然存在許多等位變異，不需專門創造特殊的遺傳材料；④不影響目標性狀的表達，與不良性狀無必然的連鎖遺傳現象；⑤許多分子標記能夠鑒別純合基因型與雜合基因型，提供完整的遺傳信息。由于分子標記具有較大的優越性，其應用越來越廣泛。從發展進程上可將其分成３個世代：第１代是以傳統的Southern雜交為基礎的分子標記，如限制性片段長度多態性（ＲＦＬＰ）；第２代是以ＰＣＲ為基礎的分子標記，如隨機擴增多態性ＤＮＡ（ＲＡＰＤ）、簡單序列重復或微衛星（ＳＳＲ）、擴增片段長度多態性（ＡＦＬＰ）、特異序列擴增區域（ＳＣＡＲ）、酶切擴增多態性序列（ＣＡＰｓ，又稱ＰＣＲ－ＲＦＬＰ）、序列標簽位點（ＳＴＳ）等；第３代是以基因組序列為基礎的分子標記，如單核苷酸多態性（ＳＮＰ）、插入或刪除（insertdelete）、編碼簡單序列（codingsimolesequencerepeat）及表達序列標簽（ＥＳＴ）等。（１）ＲＦＬＰ標記基本原理是由于酶識別序列內的點突變或部分ＤＮＡ片段的缺失、插入、倒位和易位而引起酶切位點的缺失或獲得，導致限制性位點改變，再利用限制性內切酶切割ＤＮＡ時，就產生了大量的多態性片段。該標記具有共顯性特點，可以區別純合基因型與雜合基因型，能夠提供單個位點上較完整的資料。結果穩定可靠、重復性好，特別適合于連鎖圖譜的建立。（２）ＲＡＰＤ標記以一個隨機的寡核苷酸序列（通常為１０個堿基）為引物，通過ＰＣＲ對基因組ＤＮＡ進行隨機擴增，產生大小不同的ＤＮＡ片段，再經凝膠電泳分開，進行多態性觀察。與ＲＦＬＰ相比，ＲＡＰＤ方法簡單、快速，靈敏度高，ＤＮＡ用量少，而且不需要用同位素標記，安全性好。但是由于ＲＡＰＤ的重復性差，穩定性不好，不能區分雜合基因型與純合基因型，所以限制了它的利用。（３）ＳＳＲ標記基因組中存在的由２～５個核苷酸為重復單位組成的長達幾十個核苷酸的串聯重復序列。這種序列廣泛分布于真核生物基因組，其重復次數的不同就產生了等位基因之間的多態性。由于ＳＳＲ兩端多為相對保守的單拷貝序列，通過設計引物便可以進行ＰＣＲ擴增，進行多態性檢測。（４）ＡＦＬＰ標記通過對基因組ＤＮＡ酶切片段的選擇性擴增來檢測ＤＮＡ酶切片段長度的多態性。ＡＦＬＰ揭示的ＤＮＡ多態性是酶切位點及其后的選擇性堿基的變異，ＡＦＬＰ擴增片段的譜帶數取決于采用的內切酶和引物３′端選擇堿基的種類、數目及所研究的基因組的復雜性。由于ＡＦＬＰ是限制性酶切與ＰＣＲ結合的一種技術，因此具有ＲＦＬＰ技術的可靠性和ＰＣＲ技術的高效性，可以在一個反應內檢測大量限制性片段，一次可獲得５０～１００條譜帶的信息，可為不同來源以及不同復雜程度基因組的分析提供一個有力的工具。（５）ＳＴＳ標記一種將ＲＦＬＰ標記轉化為ＰＣＲ標記的方法。它通過ＲＦＬＰ標記或探針進行ＤＮＡ序列分析，然后設計出長度為20ｂｐ左右的引物，對基因組ＤＮＡ進行ＰＣＲ擴增尋找多態性。它的擴增產物是一段長幾百堿基對的特異序列，此序列在基因組中往往只出現１次，因此能夠界定基因組的特異位點。ＳＴＳ標記的信息量大、多態性好，是共顯性標記，能夠鑒定不同的基因型。（６）ＳＣＡＲ標記在ＲＡＰＤ技術上發展起來的一種分子標記。其方法是將目標ＲＡＰＤ標記克隆并進行末端測序，根據原ＲＡＰＤ片段兩端的序列設計特定引物（通常為24ｂｐ），對基因組ＤＮＡ再進行ＰＣＲ擴增分析。ＳＣＡＲ標記是共顯性遺傳，與ＲＡＰＤ標記相比有更好的穩定性、更高的可重復性。（７）ＣＡＰｓ標記又稱為ＰＣＲ－ＲＦＬＰ。所用的ＰＣＲ引物是針對特定的位點而設計的。其基本步驟是先進行ＰＣＲ擴增，擴增產物用限制性內切酶酶切，電泳分析多態性。與ＲＦＬＰ技術一樣，ＣＡＰｓ技術檢測的多態性是酶切片段大小的差異。（８）ＳＮＰ標記用于測定同一物種不同個體間染色體上遺傳密碼單個堿基的變化，是繼ＲＦＬＰ和ＳＳＲ之后一種新的分子標記。它是對某特定區域的核苷酸序列進行測定，將其與相關基因組中對應區域的核苷酸序列比較，檢測出單個核苷酸的差異，這個有差異的ＤＮＡ區域被稱為ＳＮＰ標記。ＳＮＰ標記在大多數基因組中存在較高的頻率，數量豐富，可進行自動化檢測。（９）EST標記長度為150～500ｂｐ的基因表達序列片段。EST技術是將ｍRNA反轉錄成ｃDNA，并克隆到質粒或噬菌體載體構建成ｃDNA文庫后，大規模隨機挑選ｃDNA克隆，對其５′或３′端進行一步法測序，所獲序列與基因數據庫中已知序列進行比較，從而獲得對生物體生長、發育、代謝、繁殖、衰老、死亡等一系列生理、生化過程認知的技術。以EST為基礎的分子標記具有開發簡便、信息量高和通用性好等特點。根據開發的方法不同，ＥＳＴ標記可分為以下４類：①EST-SSR和EST

-PCR（微衛星）標記以ＰＣＲ技術為核心，操作簡便、經濟，是目前研究和應用最多的一類；②EST-SNP（單核苷酸多態性）標記以特定EST區段內單個核苷酸差異為基礎的標記，可依托雜交、PCR等多種手段進行檢測；③EST-ＡＦＬＰ標記以限制性內切酶技術和PCR相結合為基礎的標記；④EST-ＲＦＬＰ標記以限制性內切酶和分子雜交為依托，以EST本身作為探針，與經過不