鴨甲肝病毒3型熒光RT-PCR檢測技術(shù)2024-12-12實施本文件按照GB/T1/1-2020《標準化工作導(dǎo)則第1部分：標準化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》給出的規(guī)則起草。本文件由山東省獸醫(yī)協(xié)會提出并歸口。本文件起草單位：山東省動物疫病預(yù)防與控制中心(山東省人畜共患病流調(diào)監(jiān)測中心)、青島嘉智生物技術(shù)有限公司、青島新牧至康生物技術(shù)有限公司、山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所、山東新希望六和集團有限公司、青島市即墨區(qū)畜牧業(yè)發(fā)展服務(wù)中心。本文件主要起草人：蘭鄒然、秦立廷、魏笑笑、黃兵、馬秀麗、王苗利、劉志杰、戴榮蓮、李波、楊曉雪、趙魯、陳婷、孫愛榮、孫偉、武梅、王秋珍、李曉菲、高緒慧。1鴨甲肝病毒3型熒光RT-PCR檢測技術(shù)本文件規(guī)定了鴨甲肝病毒3型實驗室診斷樣品采集與處理，以及熒光RT-PCR檢測方法。本文件適用于鴨甲肝病毒3型的檢測。2規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB19489實驗室生物安全通用要求GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法NY/T541獸醫(yī)診斷樣品采集、保存與運輸技術(shù)規(guī)范3.縮略語下列縮略語適用于本文件。DHAV-3:鴨甲肝病毒3型病毒(duckhepatitisAvirustype3)熒光RT-PCR:熒光反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)(real-timereversetranscriptpolymerasechainCt值：熒光信號達到設(shè)定閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)(cyclethreshold)4儀器設(shè)備和試劑耗材4.1儀器設(shè)備4.1.1熒光定量PCR擴增儀。4.1.2生物安全柜。4.1.3高速冷凍離心機。4.1.4核酸提取儀。4.1.5恒溫培養(yǎng)箱。4.1.6微量移液器。4.2試劑耗材及實驗參照物除非另有說明，在檢測中使用的化學(xué)試劑均為分析純，實驗室用水應(yīng)符合GB/T6682的要求。24.2.2異丙醇：分析純，使用前預(yù)冷至-20℃。4.2.5陽性參照物(鴨甲肝病毒3型病毒)。4.2.6陰性參照物(鴨肝臟組織)。5.1.1活體及病死鴨采樣：按NY/T541要求無菌采集發(fā)病鴨的肝臟組織。5.1.2病毒培養(yǎng)物：取5.2.1中處理好的上清液經(jīng)尿囊腔接種9日齡~11日齡鴨甲肝病毒3型病毒抗體陰性鴨胚，0.1mL/枚，共5枚。封口后置于37℃恒溫培養(yǎng)箱繼續(xù)孵化，每日照胚2次，記錄鴨胚死亡情況，觀察到第6天。收集接種后24h～96h的死亡鴨胚病毒培養(yǎng)物。5.2.1組織樣品處理：取肝臟組織2g~10g,加入10倍體積生理鹽水，用剪刀剪碎后，置于研磨器中充分研磨，反復(fù)凍融2次~3次，8000r/min離心10min,取上清液200μL用于RNA提取。5.2.2病毒培養(yǎng)物處理：無菌收集培養(yǎng)24h~96h的鴨胚尿囊液，-20℃保存?zhèn)溆?。采集或處理的樣本?℃~8℃條件下保存應(yīng)不超過24h;若需長期保存，需放置-80℃冰箱，但7RNA提取7.1在100μL病料上清液中加入1mL裂解液，劇烈顛倒50次～100次，室溫靜置10min后，加入200μL氯仿，上下顛倒50次~100次，室溫靜置5min~10min,于4℃12000r/min離心10min。7.2吸取上清加入等體積氯仿，上下顛倒50次~100次，于4℃12000r/min離心10min。7.3吸取上清加入等體積的-20℃預(yù)冷的異丙醇，輕輕混勻后，-20℃靜置至少30min,然后于4℃12000r/min離心15min～20min。7.4棄上清液，加入1mL預(yù)冷的75%酒精，12000r/min離心5min～10min。7.5棄上清液，倒置自然晾干，或12000r/min再離心5min,吸掉管底部的液體。37.6沉淀用20μL無RNA酶水溶解，備用。每次抽提核酸，應(yīng)至少包括一個陽性對照和一個陰性對照，陽性和陰性參照物RNA的提取方法同上。7.7樣品RNA提取也可使用同等效果的商品化試劑盒，提取的RNA立即進行RT-PCR反應(yīng)或-70℃7.8核酸提取也可使用商品化的柱式提取試劑盒或全自動磁珠提取試劑盒，按說明書操作。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系為20μL。在PCR管中加入5×Buffer4μL,dNTP(2.5mmol/L)8μL,隨機引物1.5μL,反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV(200UuL)0.5μL,RNA酶抑制劑(40U/HL)0.5μLPCR儀中30℃10min,42℃1h得到cDNA。上游引物P3:5'CCTTGTTGTGAAACGGATTA3'下游引物P4:5'GGAACACCCARTAATACTRAAGTaqMan探針序列為：5'TAGCATCTAGTGGTTCCAGTCCATAAC3',其5'和3'端分別標記FAM和BHQ。8.3擴增反應(yīng)8.3.1反應(yīng)體系反應(yīng)體系為25.0μL,配制見表1。表1熒光PCR反應(yīng)體系配制總體積8.3.2反應(yīng)程序采用以下反應(yīng)程序進行擴增：95℃預(yù)變性5min;95℃變性15s,60℃退火延伸45s,40個循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后根據(jù)分析軟件得出的Ct值和擴增曲線來判定結(jié)果。熒光RT-PCR擴增也可使用等效的商品化的熒光RT-PCR試劑盒，按說明書規(guī)定操作。9結(jié)果判定49.1判定前設(shè)置綜合分析儀器給出的各項結(jié)果，基線以儀器給出的默認值作為參考，閾值設(shè)定原則以閾值線剛好超過正常陰性對照品擴增曲線的最高點為準，具體根據(jù)儀器噪聲情況進行調(diào)整，選擇FAM通道進行分9.2實驗成立條件選擇FAM通道進行分析，在陽性對照的Ct≤35且出現(xiàn)典型擴增曲線；陰性對照無Ct值或Ct≥40,無典型擴增曲線的情況下，試驗成立。9.3陽性判定Ct≤35,且出現(xiàn)典型擴增曲線，判為陽性，表明鴨甲肝病毒3型病毒核酸陽性。9.4陰性判定無Ct值或Ct≥40,無典型擴增曲線的樣本，判為陰性，表明鴨甲肝病毒