DB24/TXXXX－XXXX

奶牛趾間皮膚外植體構建技術規程

1范圍

本標準規定了奶牛趾間皮膚外植體構建操作技術規程。

本標準為奶牛蹄部趾間皮膚感染性疾病的研究提供基礎。

2規范性引用文件

下列文件中的內容通過文中的規范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注日期

的引用文件，僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括

所有的修改單）適用于本文件。

3術語定義

下列術語和定義適用于本文件。

3.1皮膚外植體

從活體動物切取下來進行培養的那部分皮膚組織叫做皮膚外植體。

4要求

4.1外植體皮膚來源的要求

4.1.1以新屠宰的奶牛蹄部趾間皮膚為實驗樣本。

4.1.2外植體所用的皮膚需從無蹄部疾病且蹄形結構良好的奶牛后蹄處采集。

4.2實驗人員要求

4.2.1實驗人員應具備一定的獸醫外科知識，且熟練掌握獸醫外科手術操作。

4.2.2實驗人員應熟練掌握組織/細胞培養技術。

4.2.3實驗人員應熟練掌握病理組織學和免疫組織化學知識，并熟悉病理切片制作方法。

4.2.4實驗人員應具備分析病理組織切片的技術能力。

5外植體構建方法

5.1培養基配置

5.1.1運輸培養基

DMEM/F-121:1培養基內添加1%青霉素-鏈霉素-兩性霉素B溶液（100X），5μg/mL硫

酸慶大霉素，1%L-谷氨酰胺。

5.1.2洗滌培養基

DMEM/F-121:1培養基內添加1%青霉素+鏈霉素+兩性霉素B（100X），2μg/mL硫酸慶

3

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大霉素。

5.1.3組織培養基

DMEM高糖與DMEM/F-121:1培養基以3:1比例混合，添加1%青霉素+鏈霉素+兩性霉素

B（100X），5μg/ml硫酸慶大霉素，1%L-谷氨酰胺，4U/ml胰島素，0.4μg/ml氫化可

的松，10%胎牛血清。

5.2樣本的采集、運輸

選取新屠宰的、無蹄部疾病且蹄形結構良好的黑白花奶牛。首先用清水和皮膚清潔劑反

復沖洗蹄部直至表面無污物，隨后用無菌手術刀片和剪刀去除趾間皮膚被毛，PBS緩沖液

沖洗后，更換新的無菌手術刀切除全部趾間皮膚，PBS沖洗后立即放入準備好的運輸培養基

中，冰上運輸回實驗室。

5.3奶牛趾間皮膚外植體的組裝

將采集的趾間皮膚用8mm皮膚活檢打孔器無菌收集外植體皮膚，并浸入預熱至37℃的

洗滌培養基中，室溫下洗滌3次，15min/次。

取500μL體積分數為1.2%的瓊脂糖作為底座置于12孔培養板最下層，為皮膚外植體

提供物理支撐，其上覆蓋0.5cm2無菌手術紗布，洗滌后的外植體置于紗布和瓊脂糖底座的

頂部（圖1）。添加組織培養基至表皮與真皮交界處，形成氣相與液相交替的培養系統。將

組裝的外植體模型置于37℃、5%CO2濕化培養箱中培養，每12h換液1次，于培養0、12、

24、36、48和72h收集2塊皮膚外植體，分別固定于4%多聚甲醛和保存于‐80℃冰箱中。

圖1皮膚外植體模型組裝圖

6奶牛趾間皮膚外植體可行性檢測

6.1皮膚組織切片制作

采用黑龍江八一農墾大學動物科技學院病理課題組的國家發明專利方法《動物組織石蠟

切片的綠色環保制作技術》制作石蠟組織切片。

6.2病理組織學檢查

4

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按照蘇木素伊紅（HE）染色試劑盒說明書的步驟對組織切片進行HE染色，隨后封片顯

微鏡下觀察，根據建立的評分標準對出現不同病理變化的皮膚外植體進行評分，評分標準如

下所示。

表1皮膚外植體病理組織學評分表

皮膚外植體病理組織變化評分

表皮細胞變性（壞死）0分

出現以下描述的表皮和真皮所有變化現象（組織不可行）

多灶性表皮下裂

基底層細胞空泡化（表皮變性）

1分

外分泌腺、白細胞和表皮細胞出現核固縮和脫離，顯示自溶跡象

（組織不可行）

伴有中性粒細胞變性的基底層細胞多灶性固縮

角質形成細胞凋亡

基底層細胞空泡化

上皮裂開1.5分

小汗腺和周圍神經有自溶的跡象，一些濾泡上皮細胞（組織可行）

(脫落)也有自溶的跡象。

棘細胞層出現核固縮現象

毛囊周圍的一些基底下裂隙2分

腺體內很少有脫落的上皮細胞（組織可行）

2.5分

散在凋亡的角質形成細胞

（組織可行）

可觀察到正常的組織結構和活力，偶爾在分泌腺內有少量脫3分

落的上皮細胞。（組織可行）

6.3Caspase-3蛋白表達檢測

按照SP檢測試劑盒說明說的步驟對組織切片進行免疫組織化學檢測，隨后封片顯微鏡

下觀察，對皮膚外植體中Caspase-3凋亡蛋白的陽性表達進行評分。選擇5個不同高倍視野，

根據以下指標對陽性細胞強度進行評分。

1）陽性率：陽性細胞數/細胞總數×100%，反映陽性細胞所占百分比。對細胞陽性比

率進行評分：0～5%為4分，6%～25%為3分，26%～50%為2分，51%～75%為1分，>75%

為0分。

2）陽性細胞著色強度：測量區域平均陽性強度為0,1,2,3分，陰性無著色，計3分；

弱陽性淡黃色，計2分；中陽性棕黃色，計1分；強陽性棕褐色計0分。

3）陽性評分：陽性綜合評分為陽性細胞著色強度分值×陽性細胞比率分值，數據越小

說明綜合陽性強度越強。

6.4TUNEL細胞凋亡檢測

5

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按照TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒說明書的步驟對組織切片進行染色，Dapi復染后封片

觀察，計算視野內1000個細胞中陽性細胞所占觀察同類細胞的百分比，細胞凋亡率=凋亡細

胞數量/1000×100%。對細胞凋亡率進行評分：細胞凋亡率在0～5%為4分，6%～25%為3分，

26%～50%為2分，認為模型可行；細胞凋亡率在51%～75%為1分，>75%為0分，認為模型

不可行。

7奶牛趾間皮膚外植體可行性評分標準

模型可行性根據病理組織學檢查評分、陽性綜合評分和細胞凋亡率評分綜合評定。病理

組織學檢查評分＞1.5分、陽性綜合評分＞1分、細胞凋亡率評分＞1分的外植體模型認為

是可行的。

6

DB24

黑龍江省地方標準

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奶牛趾間皮膚外植體構建技術規程

起草人：鄭家三

單位：黑龍江八一農墾大學

手機號碼/p>

郵箱：zjs3399@

XXXX-XX-XX發布XXXX-XX-XX實施

黑龍江省市場監督管理局發布

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奶牛趾間皮膚外植體構建技術規程

1范圍

本標準規定了奶牛趾間皮膚外植體構建操作技術規程。

本標準為奶牛蹄部趾間皮膚感染性疾病的研究提供基礎。

2規范性引用文件

下列文件中的內容通過文中的規范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注日期

的引用文件，僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括

所有的修改單）適用于本文件。

3術語定義

下列術語和定義適用于本文件。

3.1皮膚外植體

從活體動物切取下來進行培養的那部分皮膚組織叫做皮膚外植體。

4要求

4.1外植體皮膚來源的要求

4.1.1以新屠宰的奶牛蹄部趾間皮膚為實驗樣本。

4.1.2外植體所用的皮膚需從無蹄部疾病且蹄形結構良好的奶牛后蹄處采集。

4.2實驗人員要求

4.2.1實驗人員應具備一定的獸醫外科知識，且熟練掌握獸醫外科手術操作。

4.2.2實驗人員應熟練掌握組織/細胞培養技術。

4.2.3實驗人員應熟練掌握病理組織學和免疫組織化學知識，并熟悉病理切片制作方法。

4.2.4實驗人員應具備分析病理組織切片的技術能力。

5外植體構建方法

5.1培養基配置

5.1.1運輸培養基

DMEM/F-121:1培養基內添加1%青霉素-鏈霉素-兩性霉素B溶液（100X），5μg/mL硫

酸慶大霉素，1%L-谷氨酰胺。

5.1.2洗滌培養基

DMEM/F-121:1培養基內添加1%青霉素+鏈霉素+兩性霉素B（100X），2μg/mL硫酸慶

3

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大霉素。

5.1.3組織培養基

DMEM高糖與DMEM/F-121:1培養基以3:1比例混合，添加1%青霉素+鏈霉素+兩性霉素

B（100X），5μg/ml硫酸慶大霉素，1%L-谷氨酰胺，4U/ml胰島素，0.4μg/ml氫化可

的松，10%胎牛血清。

5.2樣本的采集、運輸

選取新屠宰的、無蹄部疾病且蹄形結構良好的黑白花奶牛。首先用清水和皮膚清潔劑反

復沖洗蹄部直至表面無污物，隨后用無菌手術刀片和剪刀去除趾間皮膚被毛，PBS緩沖液

沖洗后，更換新的無菌手術刀切除全部趾間皮膚，PBS沖洗后立即放入準備好的運輸培養基

中，冰上運輸回實驗室。

5.3