中國藥典2005年版無菌、微生物限度及細菌內毒素檢查方法學驗證內容簡介1中國藥典2005年版無菌、微生物限度及細菌內毒素檢查方法學驗證內容簡介2006年8月中國藥典2005年版無菌、微生物限度及細菌內毒素檢查方法學驗證內容簡介2主要內容1、無菌檢查方法學驗證關鍵點及常見問題2、微生物限度檢查方法學驗證關鍵點及常見問題3、細菌內毒素檢查方法學驗證關鍵點及常見問題2006年8月中國藥典2005年版無菌、微生物限度及細菌內毒素檢查方法學驗證內容簡介3無菌檢查的方法學驗證相關規定無菌檢查驗證的關鍵點驗證中常見的問題2006年8月中國藥典2005年版無菌、微生物限度及細菌內毒素檢查方法學驗證內容簡介4

一、相關規定

藥品無菌和微生物限度檢查方法驗證作為中國藥典2005年版增訂的一項重要內容對促進我國藥品微生物檢驗的標準化是十分重要和必要的，執行近一年以來的情況表明，方法驗證是促使我國藥品無菌和微生物限度檢查方法更加合理、科學和嚴謹的重要途徑。（2006年6月全國會議紀要）2006年8月中國藥典2005年版無菌、微生物限度及細菌內毒素檢查方法學驗證內容簡介5

中檢所和藥典會多次召開會議肯定工作的成績、研討存在的問題，希望各級領導能給予高度重視，從各方面支持這項工作長期持續發展。實際工作中，藥品生產、研發企業和各級藥檢所在工作中都存在很多困難和問題。2006年8月中國藥典2005年版無菌、微生物限度及細菌內毒素檢查方法學驗證內容簡介6關于執行《中國藥典》2005年版微生物限度檢查法和無菌檢查法有關問題的說明

國藥典發[2005]98號

各藥品檢驗所：

根據國食監注[2005]234號“關于頒布和執行《中國藥典》2005年版有關事宜的通知”規定，《中國藥典》7月1日起開始執行，各藥品檢驗所在執行“微生物限度檢查法”和“無菌檢查法”過程中遇到了一些問題，為保證《中國藥典》2005年版的順利實施，現就有關問題說明如下：2006年8月中國藥典2005年版無菌、微生物限度及細菌內毒素檢查方法學驗證內容簡介7

1．“微生物限度檢查”和“無菌檢查”是藥品安全性檢查的重要項目。雖然近幾版《中國藥典》均收載有“微生物限度檢查法”和“無菌檢查法”，但在如何保證檢驗方法的科學性和檢驗結果的準確性方面與國外藥典相比仍具有一定差距，其關鍵是《中國藥典》未強調對檢驗方法進行必要的方法驗證。為此，藥典會設立專項科研課題，對2005年版《中國藥典》的“微生物限度檢查法”和“無菌檢查法”增加驗證試驗的必要性進行研討。根據研究結果，2005年版《中國藥典》規定當進行藥品的“微生物限度檢查”或“無菌檢查”時應進行方法驗證。2006年8月中國藥典2005年版無菌、微生物限度及細菌內毒素檢查方法學驗證內容簡介8驗證的目的是為了確認試驗中供試品應選擇藥典中所收載的何種供試液制備方法、何種測定方法及確定的檢測系統是否適用于該供試品的檢驗，即只有通過方法驗證，才能確定供試品的檢驗條件和方法，保證“微生物限度檢查”或“無菌檢查”方法的科學性和檢驗結果的準確性。2006年8月中國藥典2005年版無菌、微生物限度及細菌內毒素檢查方法學驗證內容簡介92．不同企業生產的相同品種，特別是中成藥，因原料來源、工藝、輔料的不同，藥品可能表現出不同的抑菌特性；同一個企業生產的相同品種，因原料來源不同、工藝改變或不同實驗室等原因，也可能導致檢測結果的差異。因此，不同企業生產的相同品種進行“微生物限度檢查”或“無菌檢查”時，其具體試驗方法如沖洗量等不能簡單照搬，需通過驗證試驗核實該試驗方法和檢測系統是否適宜。2006年8月中國藥典2005年版無菌、微生物限度及細菌內毒素檢查方法學驗證內容簡介103．目前各藥檢所涉及的檢驗工作可分為三類：注冊檢驗（包括進口注冊和新藥注冊）、監督抽驗和進口檢驗。考慮到各檢驗性質的差異，各口岸所在進行進口復核及進口檢驗時，應請企業提供方法驗證材料或詳細的SOP資料進行審核；各口岸所完成復核時應在修訂的進口注冊標準中明確“微生物限度檢查”或“無菌檢查”的關鍵操作點（如供試品的處理方法等）及試驗方法（如平皿法、薄膜過濾法、直接接種法等），并在復核說明中概述驗證實驗結果，以方便以后的進口檢驗。2006年8月中國藥典2005年版無菌、微生物限度及細菌內毒素檢查方法學驗證內容簡介11對國內新藥的注冊檢驗，也應請企業提供方法驗證資料，如果企業提供不出方法學驗證資料，根據藥品注冊管理辦法，應在審核意見中明確指出“方法學未經驗證，無法檢驗”，并建議企業重新建立“微生物限度檢查”或“無菌檢查”方法。監督抽驗藥品，由于2005年版以前歷版《中國藥典》未強調進行方法學驗證，故各藥檢所目前在進行具體品種檢驗時難度較大，故也應請企業提供方法驗證資料并進行審核，未經過方法學驗證的“微生物限度檢查”或“無菌檢查”結果，決不能給出“符合2005年版《中國藥典》的規定”的結論。2006年8月中國藥典2005年版無菌、微生物限度及細菌內毒素檢查方法學驗證內容簡介12

國家藥典委員會

中國藥品生物制品檢定所

二00五年十月十一日2006年8月中國藥典2005年版無菌、微生物限度及細菌內毒素檢查方法學驗證內容簡介13

●驗證的目的:驗證所采用的方法和條件是否適合于供試品的無菌檢查。即確認供試品在該檢驗量、該檢驗條件下無抑菌活性或其抑菌活性以被充分消除到可以忽略不計。

●驗證的意義：保證檢驗結果的準確、可靠及檢驗方法的完整性。

2006年8月中國藥典2005年版無菌、微生物限度及細菌內毒素檢查方法學驗證內容簡介14二、無菌檢查驗證的關鍵點驗證的類型●前驗證:建立藥品的微生物限度檢查法和無菌檢查法時（當建立藥品的無菌或微生物限度檢查法時，應進行方法的驗證，以證明所采用的方法適合于該藥品的無菌檢查）。●再驗證:修訂的檢驗方法;供試品的組分或原檢驗條件發生改變可能影響檢驗結果時;定期的方法驗證（若藥品的組分或原檢驗條件發生改變時，檢查方法應重新驗證）。2006年8月中國藥典2005年版無菌、微生物限度及細菌內毒素檢查方法學驗證內容簡介15無菌檢查驗證用菌株：金黃色葡萄萄球菌(Staphylococcusaureus)[CMCC(B)26003]銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)[CMCC(B)10104]**擬修訂為大腸埃希菌枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)[CMCC(B)63501]生孢梭菌(Clostridiumsporogenes)[CMCC(B)64941]白色念珠菌(Candidaalbicans)[CMCC(F)98001]黑曲霉(Asperglllusniger)[CMCC(F)98003]2006年8月中國藥典2005年版無菌、微生物限度及細菌內毒素檢查方法學驗證內容簡介16菌株選擇的原則:代表性,普遍性,易存活、低或非致病性,標準菌株(或該藥品中常見的污染菌)。菌名分類芽孢對氧需求銅綠假單胞菌革蘭氏陰性桿菌無芽孢需氧枯草芽孢桿菌革蘭氏陽性桿菌有芽孢需氧金黃色葡萄球菌革蘭氏陽性球菌無芽孢需氧大腸埃希菌革蘭氏陰性短桿菌無芽孢需氧生孢梭菌梭菌有芽孢厭氧2006年8月中國藥典2005年版無菌、微生物限度及細菌內毒素檢查方法學驗證內容簡介17菌種的要求：傳代次數不得超過5代（從菌種保存中心獲得的冷凍干燥菌種為第0代），并采用適宜的菌種保藏技術，以保證試驗菌株的生物學特性。加菌量:＜100cfu。驗證時，按“供試品的無菌檢查”的規定及下列要求進行操作。對每—試驗菌應逐一進行驗證。2006年8月中國藥典2005年版無菌、微生物限度及細菌內毒素檢查方法學驗證內容簡介18菌液制備

接種金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養物至營養肉湯或營養瓊脂培養基中，接種生孢梭菌的新鮮培養物至硫乙醇酸鹽流體培養基中，30～35℃培養18-24小時；接種白色念珠菌的新鮮培養物至改良馬丁培養基或改良馬丁瓊脂培養基中，23～28℃培養24～48小時，上述培養物用0.9％無菌氯化鈉溶液制成每1ml含菌數小于100cfu(菌落形成單位)的菌懸液。2006年8月中國藥典2005年版無菌、微生物限度及細菌內毒素檢查方法學驗證內容簡介19

接種黑曲霉的新鮮培養物至改良馬丁瓊脂斜面培養基上，23~28℃培養5～7天，加入3～5ml0.9％無菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫，然后，吸出孢子懸液(用管口帶有薄的無菌棉花或紗布能過濾菌絲的無菌毛細吸管)至無菌試管內，用0.9％無菌氧化鈉溶液制成每lml含孢子數小于100cfu的孢子懸液。2006年8月中國藥典2005年版無菌、微生物限度及細菌內毒素檢查方法學驗證內容簡介20驗證方法：

直接接種法薄膜過濾法2006年8月中國藥典2005年版無菌、微生物限度及細菌內毒素檢查方法學驗證內容簡介21薄膜過濾法

將規定量的供試品按薄膜過濾法過濾，沖洗，在最后一次的沖洗液中加入小于100cfu的試驗菌，過濾。取出濾膜接種至硫乙醇酸鹽流體培養基或改良馬丁培養基中，或將培養基加至濾筒內。另取一裝有同體積培養基的容器，加入等量試驗菌，作為對照。按規定溫度培養3～5天。各試驗菌同法操作。2006年8月中國藥典2005年版無菌、微生物限度及細菌內毒素檢查方法學驗證內容簡介22直接接種法

取符合直接接種法培養基用量要求的硫乙醇酸鹽流體培養基8管，分別接入小于100cfu的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、生孢梭菌各2管；取符合直接接種法培養基用量要求的改良馬丁培養基4管，分別接入小于100cfu的白色念珠茵、黑曲霉各2管。其中1管接人規定量的供試品，另1管作為對照，按規定的溫度培養3～5天。2006年8月中國藥典2005年版無菌、微生物限度及細菌內毒素檢查方法學驗證內容簡介23結果判斷：

與對照管比較，如含供試品各容器中的試驗菌均生長良好，則供試品的該檢驗量在該檢驗條件下無抑菌作用或其抑菌作用可以忽略不計，照此檢查法和檢查條件進行供試品的無菌檢查。如含供試品的任一容器中微生物生長微弱、緩慢或不生長，則供試品的該檢驗量在該檢驗條件下有抑菌作用。2006年8月中國藥典2005年版無菌、微生物限度及細菌內毒素檢查方法學驗證內容簡介24消除供試品抑菌的方法增加沖洗量增加培養基的用量使用中和劑或滅活劑：

β-內酰胺酶、對氨基苯甲酸更換濾膜品種注意：重新進行方法驗證。2006年8月中國藥典2005年版無菌、微生物限度及細菌內毒素檢查方法學驗證內容簡介25方法學驗證資料試驗記錄要點總的要求：詳細、嚴謹、可操作性供試品信息檢驗數量和檢驗量：按照無菌檢查的量確定供試品處理、供試品溶液的制備檢驗方法（選擇直接接種法說明理由）實驗用菌代數、稀釋級、計數檢驗條件：主要是沖洗條件（沖洗液、沖洗次數、量，必要時說明濾膜材質、儀器、泵速等條件）。需要中和、酶處理等特殊處理方法的需說明逐日記錄各菌的生長情況2006年8月中國藥典2005年版無菌、微生物限度及細菌內毒素檢查方法學驗證內容簡介26方法學驗證資料試驗結論采用的方法：薄膜過濾法/直接接種法關鍵實驗點：如沖洗條件、中和、酶處理等因素2006年8月中國藥典2005年版無菌、微生物限度及細菌內毒素檢查方法學驗證內容簡介27三、驗證及資料中常見的問題

薄膜過濾法加菌的時機不一致（供試品中和陽性對照中）按規定應在最后一次沖洗液中加入陽性菌液，而驗證試驗主要考慮濾膜/濾器殘留抗菌物質對陽性菌的生長的影響，可以與對照濾器比較而作出判斷，所以驗證試驗中加菌時機要與對照一致（中檢所講義）。2006年8月中國藥典2005年版無菌、微生物限度及細菌內毒素檢查方法學驗證內容簡介28薄膜過濾法濾膜材質選擇不正確，直接影響試驗結果普通濾膜有機膜低吸附濾膜1.根據供試品及其溶劑的特性選擇濾膜材質。2.應保證濾膜在過濾前后的完整性。3.采用全封閉過濾器注意觀察膜的狀態，某些油性供試品或采用蓖麻油等作為溶媒的供試品可以損傷普通濾膜。2006年8月中國藥典2005年版無菌、微生物限度及細菌內毒素檢查方法學驗證內容簡介29

驗證試驗：按規定的溫度培養3～5天無菌檢查：陽性對照培養48～72h應生長良好

驗證試驗與無菌檢查培養觀察時間是不同的，不加區分影響對陽性菌生長緩慢的判斷2006年8月中國藥典2005年版無菌、微生物限度及細菌內毒素檢查方法學驗證內容簡介30敏感菌株與陽性對照菌不一致，降低了陽性對照菌的意義陽性對照菌不是驗證試驗選定的敏感菌株實際工作中抑制枯草芽孢桿菌的樣品很多（敏感菌株），但陽性對照只能選擇金黃色葡萄球菌。2006年8月中國藥典2005年版無菌、微生物限度及細菌內毒素檢查方法學驗證內容簡介31關于大腸埃希菌的問題供試品無菌檢查中規定“抗革蘭陰性菌為主的供試品以大腸埃希菌為對照菌”，但在方法學驗證中所用菌株沒有大腸埃希菌。解決措施：抗革蘭陰性菌的抗菌藥物進行方法學驗證時增加大腸埃希菌。即將修訂，將銅綠假單胞菌修訂為大腸埃希菌。修訂后按新方法執行。2006年8月中國藥典2005年版無菌、微生物限度及細菌內毒素檢查方法學驗證內容簡介32薄膜過濾法和直接接種法如：一般供試品（無特殊說明），完全可以采用薄膜過濾法，而生產單位進行的無菌檢查驗證法為直接接種法。也有的廠家把兩種方法的驗證都寫上，結論中也沒有說明采用那種方法。CP2005：無菌檢查法包括薄膜過濾法和直接接種法，只要供試品性狀允許，應采用薄膜過濾法。修訂：改為薄膜過濾法重新進行驗證。方法選擇錯誤，不符合CP2005版要求2006年8月中國藥典2005年版無菌、微生物限度及細菌內毒素檢查方法學驗證內容簡介33進行供試品無菌檢查時，所采用的檢驗方法和檢驗條件應與驗證的方法相同。結合無菌檢查檢驗數量和檢驗量確定驗證時取樣量。如同時進行無菌檢查一定要按照規定的檢驗數量和檢驗量取樣。檢驗數量和檢驗量與驗證試驗的量不同，與CP2005版驗證要求不符2006年8月中國藥典2005年版無菌、微生物限度及細菌內毒素檢查方法學驗證內容簡介34生產單位進行方法學驗證時檢驗數量要按照表1批出廠產品最少檢驗數量。檢驗量（每只樣品接入每種培養基的最少樣品量）同上市抽驗品種。無菌檢查法中規定：只要供試品特性允許，應將所有容器內的全部內容物過濾。因此，驗證試驗中檢驗量就多不就少，如10ml注射液，雖然每個濾膜每容器取2ml也符合藥典規定，10支分配至3個或更多濾筒也可，但建議取15支分3個濾筒（貴重藥品和抗生素品種可靈活掌握，但不能低于最少量）。2006年8月中國藥典2005年版無菌、微生物限度及細菌內毒素檢查方法學驗證內容簡介35舉例說明上市抽驗樣品無菌檢查方法學驗證檢驗量（液體制劑）≤1ml每個菌10支,共60支（全取樣）1＜V＜5共30（取樣量為半量）5≤V＜20建議30（取樣量為2ml，建議全部過濾）20≤V＜50建議30（取樣量為5ml，建議全部過濾）50≤V＜100建議30（取樣量為10ml，建議全部過濾)50≤V＜100（靜脈給藥）共30（取樣量為半量）100≤V≤500共18（取樣量為半量）＞5002006年8月中國藥典2005年版無菌、微生物限度及細菌內毒素檢查方法學驗證內容簡介36對檢驗數量和檢驗量的把握應考慮便于實際操作，比如處理100ml/袋的樣品，取9袋樣品一次分配到一組三聯濾器，檢驗數量大于藥典規定的6個，但檢驗量似乎不符合藥典規定的每袋樣品取半量檢驗的規定，僅為1/3，但根據藥典檢驗量即為一次試驗所用供試品總量（g或ml）的解釋，這與先將6袋分配兩個濾筒，再將剩下3袋抽入一個濾筒作為樣定對照的方法一樣，卻更節省時間。（中檢所講義）2006年8月中國藥典2005年版無菌、微生物限度及細菌內毒素檢查方法學驗證內容簡介37沖洗條件、沖洗量的選擇太盲目有些廠家提供的驗證資料中，對非抑菌性供試品也采用大量的沖洗，100ml/次*10次/膜，增加了出現誤差的機會。1.對膜的損傷2.檢驗方法繁瑣，大大增加檢驗人員的工作量（檢驗要按照已經驗證的方法進行）3.驗證試驗方法選擇總的原則是由易到難2006年8月中國藥典2005年版無菌、微生物限度及細菌內毒素檢查方法學驗證內容簡介38沖洗不一定為100ml/次，可少量多次，如50ml/次，注意充分振搖。對于抑菌性較強的供試品，可以先用適宜的稀釋液稀釋后再過濾，以減少膜的吸附,減少沖洗量。如：抗生素品種取規定量，混合至含適量稀釋液（如500ml等)的無菌容器中，然后再過濾。對于抑菌性較強的注射用無菌粉末或固體原料，一定要充分溶解、混合均勻。抗菌藥可以根據其抗菌譜選擇敏感菌先進行預試驗，找到合適的條件再進行其他菌的實驗。采用開放式薄膜過濾器：濾膜分成幾份與取樣量、沖洗條件的選擇有關，建議盡量與無菌檢查法一致（最常見為3等分）。2006年8月中國藥典2005年版無菌、微生物限度及細菌內毒素檢查方法學驗證內容簡介39方法描述不夠詳細，沒有可操作性如某產品驗證資料“將規定量的供試品按薄膜過濾法過濾，沖洗，在最后一次沖洗液中加入小于100CFU的試驗菌，過濾。取出濾膜接種至……中，或將培養基加至濾筒中”。驗證的目的是為了“照此檢查法和檢查條件進行供試品的無菌檢查”，方法確立后，以后該產品就可以采用該方法進行檢驗。應記錄取樣量、（稀釋方法）、沖洗液、沖洗量（沖洗條件）等。2006年8月中國藥典2005年版無菌、微生物限度及細菌內毒素檢查方法學驗證內容簡介40特殊情況眼用液體制劑：制劑通則中規定，眼用液體制劑微生物限度檢查法為“除另有規定外，按薄膜過濾法或直接接種法檢查，至少從2支供試品抽取規定量（每種培養基各接種2支，每支1ml），直接或處理后接種于硫乙醇流體培養基及改良馬丁培養基中。培養7天，不得有菌生長。若有菌生長，應重新取2倍量供試品，分別依法復試，各管均不得有菌生長。”眼用液體制劑微生物限度檢查的方法驗證同無菌檢查方法學驗證。2006年8月中國藥典2005年版無菌、微生物限度及細菌內毒素檢查方法學驗證內容簡介41微生物限度檢查的方法學驗證概述微生物檢查驗證的關鍵點驗證中常見的問題2006年8月中國藥典2005年版無菌、微生物限度及細菌內毒素檢查方法學驗證內容簡介42一、概述微生物限度檢查法驗證的目的：確認所采用的方法是否適合于供試品的微生物限度檢查。驗證的內容：包括準確性(回收率)、專屬性。驗證的類型：前驗證(建立微生物限度檢查法時的驗證)和再驗證(修訂檢驗方法后、供試品組分或原檢驗條件發生改變可能影響檢驗結果時、定期的方法驗證)。2006年8月中國藥典2005年版無菌、微生物限度及細菌內毒素檢查方法學驗證內容簡介43根據檢查方法的不同分為：細菌、霉菌、酵母菌計數方法的驗證和控制菌檢查法的驗證。驗證的意義：

保證檢驗結果的準確、可靠及檢驗方法的完整性。

2006年8月中國藥典2005年版無菌、微生物限度及細菌內毒素檢查方法學驗證內容簡介44總體思路與程序某些供試品含有抗微生物物質，使供試品中的活微生物的生長被抑制，不能按常規方法檢驗，必須以適當的方法消除或抑制供試品中抗微生物物質的活性后，活微生物才能生長，得以檢出。通過消除或抑制供試品中抗微生物物質的活性來檢測微生物的方法，應通過驗證，以確定所用檢測方法測定結果的可信度。

2006年8月中國藥典2005年版無菌、微生物限度及細菌內毒素檢查方法學驗證內容簡介45需要驗證的環節驗證實際上伴隨著整個實驗過程，實驗過程中的每一個環節均應有合理的證明（驗證），保證其對結果判斷沒有影響。前處理方法直接影響后續步驟的效果和重現性，應在驗證的范圍內。已有標準規程（SOP）和充足實驗證明的前處理方法可以直接采用，但出現疑問應進一步研究提高。

供試品中抗菌活性的去除是當前驗證工作的重點2006年8月中國藥典2005年版無菌、微生物限度及細菌內毒素檢查方法學驗證內容簡介46供試品中抗菌活性的去除稀釋法——降低供試品的相對濃度薄膜法——利用體積差異分離中和法——利用化學（生物）專屬性滅活離心法——利用沉降系數差異分離

各方法組合運用，會達到更好效果！2006年8月中國藥典2005年版無菌、微生物限度及細菌內毒素檢查方法學驗證內容簡介47二、驗證的關鍵點

樣品：首先應是合格的樣品。本底微生物太多可以先滅活，但不應因此影響藥效。注意針對抽驗品種本底微生物太高情況，如我們沒條件進行滅活處理，可對檢品適當稀釋后再進行驗證。（經請示專業委員會認可）2006年8月中國藥典2005年版無菌、微生物限度及細菌內毒素檢查方法學驗證內容簡介48檢驗量

指供試品一次檢驗的用量。一般為10g或10ml;化學藥膜劑為100cm2。貴重或微量包裝的藥品可酌減（不得少于3g）。檢查沙門菌的供試品其檢驗量改為10g或10ml。驗證實驗按檢驗量執行。2006年8月中國藥典2005年版無菌、微生物限度及細菌內毒素檢查方法學驗證內容簡介49樣品前處理

制劑形式多樣，決定前處理各異液體供試品固體、半固體或粘稠液體供試品非水溶性供試品其他2006年8月中國藥典2005年版無菌、微生物限度及細菌內毒素檢查方法學驗證內容簡介50液體供試品取供試品10ml，加pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100ml，混勻，作為供試液。油劑可先加入適量的無菌聚山梨酯80使供試品分散均勻，然后再加pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100ml。可溶性液體制劑可用混合的供試品原液作為供試液。2006年8月中國藥典2005年版無菌、微生物限度及細菌內毒素檢查方法學驗證內容簡介51固體、半固體或粘稠液體供試品取供試品10g，加pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100ml，用勻漿儀或其它有效方法混勻，作為供試液。(常規方法）必要時加適量的無菌聚山梨酯80，并置水浴適當加溫使供試品分散均勻。2006年8月中國藥典2005年版無菌、微生物限度及細菌內毒素檢查方法學驗證內容簡介52非水溶性供試品方法一

2000版已有方法（乳化法）方法二2005版新增方法（萃取法）2006年8月中國藥典2005年版無菌、微生物限度及細菌內毒素檢查方法學驗證內容簡介53軟膏、乳膏劑先將已備妥滅菌的含司盤805g、單硬脂酸甘油酯3g、聚山梨酯8010g的混合物融化，待冷至45℃時，加入供試品5g（或5ml），立即用玻璃棒攪拌均勻，分次少量慢慢加入45℃的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液80ml，邊加邊攪拌，使供試品充分乳化，作為1：20供試液。2006年8月中國藥典2005年版無菌、微生物限度及細菌內毒素檢查方法學驗證內容簡介54油劑取供試品10ml，加入無菌聚山梨酯805~8ml，搖勻，再加入pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100ml。栓劑稱取供試品10g，加適量pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，置45℃水浴保溫10min，使溶，加入無菌聚山梨酯805~8ml，振搖使之乳化，再加pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100ml，搖勻。

2006年8月中國藥典2005年版無菌、微生物限度及細菌內毒素檢查方法學驗證內容簡介55眼膏劑取供試品10g，加至20ml無菌十四烷酸異丙酯，必要時可增加十四烷酸異丙酯的用量，充分振搖，使供試品溶解。然后加入pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液100ml，振搖5~10min，靜置，待油水明顯分層，取其水層作為供試液。2006年8月中國藥典2005年版無菌、微生物限度及細菌內毒素檢查方法學驗證內容簡介56非水溶性膜劑化學藥膜劑一般取樣量為100cm2，置滅菌錐形瓶中，加入適量的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，于45℃水浴保溫，浸泡，振搖，以供試品浸液作為供試液。中藥膜劑取50cm2，剪碎，加入適量的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液（通常1cm2加1ml或2ml），浸泡，振搖，以供試品浸液作為供試液。2006年8月中國藥典2005年版無菌、微生物限度及細菌內毒素檢查方法學驗證內容簡介57腸溶及結腸溶制劑供試品取供試品10g，腸溶制劑加pH6.8無菌磷酸鹽緩沖液至100ml，結腸溶制劑加pH7.6無菌磷酸鹽緩沖液至100ml，置45℃水浴中，振搖，使溶解，作為供試液。2006年8月中國藥典2005年版無菌、微生物限度及細菌內毒素檢查方法學驗證內容簡介58氣霧劑、噴霧劑供試品取規定量供試品，置冰箱冰凍室內約1h，取出，速消毒供試品容器的開啟部位周圍，用無菌鋼錐在容器上消毒部位鉆一小孔，在室溫輕輕轉動容器，使拋射劑緩緩全部釋出。用無菌注射器吸出全部藥液，加至適量的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液（若含非水溶性成分，加適量的無菌聚山梨酯80）中，混勻，取相當于10g或10ml的供試品，再稀釋成1：10的供試液。2006年8月中國藥典2005年版無菌、微生物限度及細菌內毒素檢查方法學驗證內容簡介59茶劑取供試品10g，置滅菌錐形瓶中，加入稀釋劑100ml，振搖2～3min，以滅菌紗布過濾（如為袋泡茶，可直接取2袋，以稱樣結果按1：10加稀釋劑，浸泡30min）。2006年8月中國藥典2005年版無菌、微生物限度及細菌內毒素檢查方法學驗證內容簡介60注意：以上供試品如吸水膨脹，或黏度過高，可增加稀釋級的量，制成1：20～1：100供試液制備供試液所用的乳化劑、分散劑、中和劑及其用量應驗證，在該檢驗條件無抗菌作用。目標是使不便于取樣的供試品分散均勻！

2006年8月中國藥典2005年版無菌、微生物限度及細菌內毒素檢查方法學驗證內容簡介61計數方法驗證

定量——回收率測定實驗

在建立供試品的細菌、霉菌和酵母菌計數方法或原法的檢驗條件有改變可能影響檢驗結果的準確性，應對檢查法的可靠性進行驗證。驗證時做規定菌的回收試驗，以判斷供試品是否具有抗菌活性的實驗方法。2006年8月中國藥典2005年版無菌、微生物限度及細菌內毒素檢查方法學驗證內容簡介62驗證用菌株

細菌計數方法驗證用菌株：大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌霉菌及酵母菌計數方法驗證白色念珠菌、黑曲霉取培養物用無菌0.9%氯化鈉溶液稀釋成含50～100cfu/ml的菌液。2006年8月中國藥典2005年版無菌、微生物限度及細菌內毒素檢查方法學驗證內容簡介63要求驗證實驗應獨立平行進行3次，分別計算各次試驗菌的回收率。2006年8月中國藥典2005年版無菌、微生物限度及細菌內毒素檢查方法學驗證內容簡介64具體方法1)試驗組2)菌液組3)稀釋劑對照組4)供試品對照組2006年8月中國藥典2005年版無菌、微生物限度及細菌內毒素檢查方法學驗證內容簡介651.試驗組平皿法計數時，取試驗可能用的最低稀釋級供試液1ml和50～100cfu試驗菌，分別注入平皿中，立即傾注瓊脂培養基，每株試驗菌平行制備2個平皿，按平皿法測定其菌數。薄膜過濾法計數時，取規定量試驗可能用的最低稀釋級供試液，過濾，沖洗，應在最后一次的沖洗液中加入50～100cfu試驗菌，過濾，按薄膜過濾法測定其菌數。2006年8月中國藥典2005年版無菌、微生物限度及細菌內毒素檢查方法學驗證內容簡介662.菌液組測定所加的試驗菌數2006年8月中國藥典2005年版無菌、微生物限度及細菌內毒素檢查方法學驗證內容簡介673.稀釋劑對照組若供試液制備需要分散、乳化，中和、離心或薄膜過濾等特殊處理時，應增加稀釋劑對照組，以考察供試液制備過程中微生物受影響的程度。試驗時，可用相應的稀釋液替代供試品，加入試驗菌，使最終菌濃度為每1ml供試液含50～100cfu，按試驗組的供試液制備方法和菌落計數方法測定其菌數。2006年8月中國藥典2005年版無菌、微生物限度及細菌內毒素檢查方法學驗證內容簡介684.供試品對照組取規定量供試液，按菌落計數方法測定供試品本底菌數。2006年8月中國藥典2005年版無菌、微生物限度及細菌內毒素檢查方法學驗證內容簡介69回收率的計算

試驗組的菌回收率

稀釋劑對照組的菌回收率

2006年8月中國藥典2005年版無菌、微生物限度及細菌內毒素檢查方法學驗證內容簡介70結果判斷指標

在3次獨立的平行試驗中，稀釋劑對照組的菌回收率應均不低于70%。若試驗組的菌回收率均不低于70%，按此該供試液制備方法和計數法測定供試品的細菌、霉菌及酵母菌數。若任一次試驗中試驗組的菌回收率低于70%，應采用培養基稀釋法、離心沉淀集菌法、薄膜過濾法、中和法等方法或聯合使用這些方法消除供試品的抑菌活性，并重新驗證。2006年8月中國藥典2005年版無菌、微生物限度及細菌內毒素檢查方法學驗證內容簡介71常規法

供試液的常規制備方法：

10g(ml)樣品加pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100ml,制成1：10供試液2006年8月中國藥典2005年版無菌、微生物限度及細菌內毒素檢查方法學驗證內容簡介72常規菌落計數方法的驗證過程試驗組：取1：10供試液1ml和菌液1ml（50～100cfu試驗菌），分別注入平皿中，立即傾注瓊脂培養基，每株試驗菌平行制備2個平皿，按平皿法測定其菌數。2006年8月中國藥典2005年版無菌、微生物限度及細菌內毒素檢查方法學驗證內容簡介73菌液組：取菌液1ml注入平皿中，傾注瓊脂培養基，每株試驗菌平行制備2個平皿，按平皿法測定其菌數。供試品對照組：取1：10供試液1ml注入平皿中，傾注瓊脂培養基，平行制備2個平皿，按平皿法測定其菌數。

2006年8月中國藥典2005年版無菌、微生物限度及細菌內毒素檢查方法學驗證內容簡介74結果判斷計算試驗組的菌回收率，若三次平行試驗各個試驗菌的回收率均不低于70%，按常規法測定供試品的細菌、霉菌及酵母菌數。若任一次試驗中試驗組的菌回收率低于70%，應采用培養基稀釋法、離心沉淀集菌法、薄膜過濾法、中和法等方法或聯合使用這些方法消除供試品的抑菌活性，并重新驗證。2006年8月中國藥典2005年版無菌、微生物限度及細菌內毒素檢查方法學驗證內容簡介75培養基稀釋法取規定量的供試液，加至較大量的培養基中，使單位體積內的供試品含量減少至不具抑菌作用。1ml供試液可等量分注多個平皿。培養基稀釋法適用于抑菌作用不強的制劑。2006年8月中國藥典2005年版無菌、微生物限度及細菌內毒素檢查方法學驗證內容簡介76在采用培養基稀釋法時，應注意避免在注皿前菌液和供試液直接接觸實驗組（0.5ml/皿；0.2ml/皿）每一平皿均應加1ml菌液。2006年8月中國藥典2005年版無菌、微生物限度及細菌內毒素檢查方法學驗證內容簡介77以1ml供試液平均分注5個平皿的方法為例說明培養基稀釋法方法驗證的過程10g(ml)樣品加pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100ml,制成1：10供試液供試液制備方法為常規法，無需進行稀釋劑對照組的實驗2006年8月中國藥典2005年版無菌、微生物限度及細菌內毒素檢查方法學驗證內容簡介78試驗組：1ml1:10的供試液等量分注5皿，平行2ml，共10皿，每皿各加1ml菌液。計算每皿平均菌數（A）供試品組（本底組）：1ml1:10的供試液等量分注5皿，平行2ml，共10皿。計算每皿平均菌數（B）菌液組：每皿加入1ml菌液，平行2皿。計算每皿平均菌數（C）回收率：（A-B）/C*100％2006年8月中國藥典2005年版無菌、微生物限度及細菌內毒素檢查方法學驗證內容簡介79

結果判斷：計算試驗組的菌回收率，若三次平行試驗各個試驗菌的回收率均不低于70%，按培養基稀釋法測定供試品的細菌數（或霉菌及酵母菌數）。若任一次試驗中試驗組的菌回收率低于70%，應采用其他方法，如薄膜過濾法、中和法等方法或聯合使用這些方法消除供試品的抑菌活性，并重新驗證。

2006年8月中國藥典2005年版無菌、微生物限度及細菌內毒素檢查方法學驗證內容簡介80離心沉淀集菌法

1：10供試液的制備：10g樣品加pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100ml，混勻，低速離心（500rpm離5分鐘）去渣，取上清10ml高速離心（3000rpm離20分鐘），離心后不要震搖離心管（一般用10ml帶有刻度的離心管），用注射器或吸管（注意不要插到2ml刻度以下）吸取上面的8ml棄去，再加8

ml稀釋液補充到10ml，混勻。2006年8月中國藥典2005年版無菌、微生物限度及細菌內毒素檢查方法學驗證內容簡介81試驗組：取1：10供試液1ml和菌液1ml（50～100cfu試驗菌），分別注入平皿中，立即傾注瓊脂培養基，每株試驗菌平行制備2個平皿，按平皿法測定其菌數。菌液組：取菌液1ml注入平皿中，傾注瓊脂培養基，每株試驗菌平行制備2個平皿，按平皿法測定其菌數。供試品對照組：取1：10供試液1ml注入平皿中，傾注瓊脂培養基，平行制備2個平皿，按平皿法測定其菌數。

2006年8月中國藥典2005年版無菌、微生物限度及細菌內毒素檢查方法學驗證內容簡介82稀釋劑對照組：

取含菌稀釋液（含菌濃度為50～100cfu/ml）代替供試品，經過低速離心后轉移含菌稀釋液至另一離心管中，高速離心后，用與制備供試液相同的方法吸取離心管上層8ml液體，再加8

ml稀釋液補充到10ml，混勻。取此液體1ml注入平皿中，傾注瓊脂培養基，每株試驗菌平行制備2個平皿，按平皿法測定其菌數。

要保證稀釋劑對照組的操作過程與實驗組完全相同！2006年8月中國藥典2005年版無菌、微生物限度及細菌內毒素檢查方法學驗證內容簡介83不建議使用離心沉淀集菌法操作過程不小心極易造成菌體損失，使回收率降低。某些沉降系數低的細菌可能被漏檢，而驗證試驗無法對其驗證。對某些抑菌性不強的樣品建議采用培養基稀釋法。2006年8月中國藥典2005年版無菌、微生物限度及細菌內毒素檢查方法學驗證內容簡介84薄膜過濾法供試品對照組：取規定量供試品，相當于供試品1g或1ml，如1：10供試液取10ml,過濾，沖洗（確定沖洗量），取出濾膜，菌液面朝上貼在對應培養基上，按薄膜過濾法測定其菌數。試驗組：過濾量，沖洗量同供試品對照組，在最后一次的沖洗液中加入50～100cfu試驗菌，過濾，按薄膜過濾法測定其菌數。

2006年8月中國藥典2005年版無菌、微生物限度及細菌內毒素檢查方法學驗證內容簡介85菌液組：取菌液1ml注入平皿中，傾注瓊脂培養基，每株試驗菌平行制備2個平皿，按平皿法測定其菌數。

稀釋劑對照組：稀釋液+1ml菌液混勻，過濾，沖洗（沖洗量及沖洗方法同試驗組），取出濾膜，按薄膜過濾法測定其菌數。2006年8月中國藥典2005年版無菌、微生物限度及細菌內毒素檢查方法學驗證內容簡介86注意：如回收率仍達不到70%，首先考慮增加沖洗量，少量多次沖洗，不局限于藥典所說的每次沖洗100ml。可將待過濾的樣品稀釋至大量稀釋液中（如:500ml,多少量需在驗證資料中注明）再進行過濾，這樣可以減少膜對樣品抑菌成分的吸附。沖洗速度不易過快，沖洗量不易過大。可與離心沉淀集菌法，中和法等方法聯用。

2006年8月中國藥典2005年版無菌、微生物限度及細菌內毒素檢查方法學驗證內容簡介87其他消除抑菌效果的方法β-內酰胺類抗生素β-內酰胺酶奎諾酮類抗生素0.1mol/LMnSO4

2006年8月中國藥典2005年版無菌、微生物限度及細菌內毒素檢查方法學驗證內容簡介88當最低稀釋級的供試液含有抑菌活性，且采用上述消除抑菌活性的方法后試驗菌的回收率還無法達到計數方法驗證的要求時，根據供試品的微生物限度標準和菌數報告規則，在不影響檢驗結果判斷的前提下，可采用高一稀釋級的供試液重新進行回收率的測定。若試驗菌的回收率符合計數方法驗證的要求，那么，進行供試品細菌計數或霉菌及酵母菌計數時，應以該稀釋級供試液作為最低稀釋級的供試液（中國藥典2006增補本擬增訂內容）2006年8月中國藥典2005年版無菌、微生物限度及細菌內毒素檢查方法學驗證內容簡介89控制菌檢查方法驗證

定性——能否生長、專屬性實驗樣品給藥途徑和類型決定何種控制菌檢查驗證一般口服制劑驗證大腸埃希菌外用制劑驗證金葡和銅綠含藥材原粉；含豆豉、神曲等發酵成分的制劑的大腸菌群檢查驗證2006年8月中國藥典2005年版無菌、微生物限度及細菌內毒素檢查方法學驗證內容簡介90試驗菌株按規定檢查的控制菌選擇相應驗證的菌株。大腸菌群檢查用大腸埃希菌梭菌檢查用生孢梭菌。菌種的要求：不得超過5代。菌液制備為10～100cfu/ml。2006年8月中國藥典2005年版無菌、微生物限度及細菌內毒素檢查方法學驗證內容簡介911.試驗組取規定量供試液及10～100cfu試驗菌加入增菌培養基中，依相應控制菌檢查法進行檢查。當采用薄膜過濾法時，取規定量供試液，過濾，沖洗，試驗菌應加在最后一次沖洗液中，過濾后，注入培養基或取出濾膜接入增菌培養基中。

2006年8月中國藥典2005年版無菌、微生物限度及細菌內毒素檢查方法學驗證內容簡介922.陰性菌對照組

設立陰性菌對照組是為了驗證該控制菌檢查方法的特異性，方法同試驗組。陰性對照菌不得檢出。2006年8月中國藥典2005年版無菌、微生物限度及細菌內毒素檢查方法學驗證內容簡介93控制菌陰性對照菌株大腸埃希菌金黃色葡萄球菌大腸菌群沙門菌金黃色葡萄球菌大腸埃希菌銅綠假單胞菌梭菌2006年8月中國藥典2005年版無菌、微生物限度及細菌內毒素檢查方法學驗證內容簡介94結果判斷

陰性菌對照組不得檢出陰性對照菌。若試驗組檢出試驗菌，按此供試液制備法和控制菌檢查法進行供試品的該控制菌檢查。試驗組未檢出試驗菌，應采用稀釋法、離心沉淀集菌法、薄膜過濾法、中和法等方法或聯合使用這些方法消除供試品的抑菌活性，并重新驗證。驗證試驗可與供試品的控制菌檢查同時進行2006年8月中國藥典2005年版無菌、微生物限度及細菌內毒素檢查方法學驗證內容簡介95總結一般的驗證過程：第一步：常規法第二步：培養基稀釋法第三步：薄膜過濾法在計數方法驗證時先用常規法對5種實驗菌進行預實驗，如果某個或某些菌的回收率達不到70%，繼續用它驗證下一步的實驗方法。直到它的回收率達到70%以上。這時再用5種菌進行平行試驗。2006年8月中國藥典2005年版無菌、微生物限度及細菌內毒素檢查方法學驗證內容簡介96關于驗證菌中敏感菌的選擇相關文件選擇原則2006年8月中國藥典2005年版無菌、微生物限度及細菌內毒素檢查方法學驗證內容簡介97第七屆全國藥品檢驗所抗生素室主任工作會議暨全國藥品微生物檢驗方法及標準研討會會議紀要（微生物檢驗部分）為了進一步理順方法驗證和目前監督抽驗工作的關系，討論認為應對以建立科學合理的檢驗方法為目的的方法驗證試驗和對監督抽驗工作中所采用抽驗方法的有效性的確認實驗加以區分，具體有如下三點：2006年8月中國藥典2005年版無菌、微生物限度及細菌內毒素檢查方法學驗證內容簡介981.對于注冊檢驗，如果沒有合理的檢驗方法，應嚴格按照藥典要求，通過完整的驗證試驗建立標準檢驗方法及SOP，所建立的標準檢驗方法中應確定具體的實驗方法，如無菌檢查中的薄膜過濾法和直接接種法，微生物限度檢查中的平皿法和薄膜過濾法。標準檢驗方法中應有關鍵的實驗要點，如無菌檢查薄膜過濾法的沖洗條件；微生物限度檢查平皿法的供試品稀釋程度（0.5ml/皿、0.2ml/皿應注明）。對有抗菌作用的樣品應通過驗證試驗確定一株敏感菌株，以供采納該檢驗方法時進行方法的確認使用。2006年8月中國藥典2005年版無菌、微生物限度及細菌內毒素檢查方法學驗證內容簡介992.對注冊檢驗中已有驗證資料的方法進行復核時，應根據企業提供材料的情況，結合藥檢所掌握的情況，通過分析判斷、適當的實驗驗證等，保證驗證資料中檢驗方法的合理、可靠和科學。2006年8月中國藥典2005年版無菌、微生物限度及細菌內毒素檢查方法學驗證內容簡介1003.對于目前比較突出的已上市品種的監督抽驗問題，原則上應向被抽驗品種的生產單位索取方法驗證資料，如資料中已確定有敏感菌株，可以該菌株為陽性對照確認或調整檢驗方法。如果沒有及時獲得驗證資料，或者驗證資料中沒有確定敏感菌株，抗生素及抗菌品種可根據其抗菌譜確立一株敏感菌株進行方法確認試驗，其他品種可從藥典驗證菌株中選取一到兩株菌快速確立檢驗方法，一般細菌選擇枯草芽孢桿菌或金黃色葡萄球菌，真菌選擇白色念珠菌，或其他有可靠依據的敏感菌株，方法確認實驗可和檢驗同步進行。2006年8月中國藥典2005年版無菌、微生物限度及細菌內毒素檢查方法學驗證內容簡介101敏感菌株的選擇原則首先是個動態的選擇；目前針對固定品種尚未有固定或法定的方法；敏感菌株可以是一株菌，也可是兩株或更多；敏感菌株不一定是藥典規定的驗證用菌株；由于新藥生產過程中的諸多不穩定因素，對于注冊品種建議按照藥典規定菌株逐一進行驗證。2006年8月中國藥典2005年版無菌、微生物限度及細菌內毒素檢查方法學驗證內容簡介102針對抽驗品種如資料中已確定有敏感菌株，可以該菌株為陽性對照確認或調整檢驗方法；可根據其抗菌譜確立一株敏感菌株進行方法確認試驗；其他品種可從藥典驗證菌株中選取一到兩株菌快速確立檢驗方法；一般細菌選擇枯草芽孢桿菌或金黃色葡萄球菌，真菌選擇白色念珠菌；其他有可靠依據的敏感菌株，方法確認實驗可和檢驗同步進行。2006年8月中國藥典2005年版無菌、微生物限度及細菌內毒素檢查方法學驗證內容簡介103抗厭氧菌的，應選擇生孢梭菌；抗革蘭氏陰性菌的，應選擇大腸桿菌；對無明顯抗菌活性的中藥品種（包括注射劑），我們在實驗中發現多對枯草芽孢桿菌較為敏感，而對霉菌不敏感；建議中藥品種（包括注射劑），細菌首選擇枯草芽孢桿菌，真菌選擇白色念珠菌。2006年8月中國藥典2005年版無菌、微生物限度及細菌內毒素檢查方法學驗證內容簡介1042005版《中國藥典》細菌內毒素檢驗及方法建立山東省藥品檢驗所2006.８濟南2006年8月中國藥典2005年版無菌、微生物限度及細菌內毒素檢查方法學驗證內容簡介105內容細菌內毒素概述細菌內毒素檢查方法建立的指導原則細菌內毒素檢查方法的建立與驗證細菌內毒素檢查附：中外藥典細菌內毒素檢查方法收載及修訂情況2006年8月中國藥典2005年版無菌、微生物限度及細菌內毒素檢查方法學驗證內容簡介106

細菌內毒素概述

前言

細菌內毒素

2006年8月中國藥典2005年版無菌、微生物限度及細菌內毒素檢查方法學驗證內容簡介107一、前言

自20世紀60年代鱟血凝集機制的發現和鱟實驗方法的建立以來，引起了各國藥政管理部門的極大興趣，并使細菌內毒素檢查法在藥品的熱原限量控制中得到了廣泛的應用和發展。尤其是與家兔熱原法相比，細菌內毒素檢查法具有勞動強度低，實驗成本小等特點，還可以通過對原料、活性成分、滅菌水、容器、賦形劑和終產品的細菌內毒素檢測，對生產過程進行質控，更明顯的特點是可以定量檢測藥品生產過程中可能污染的痕量內毒素，并且為區分干擾作用與內毒素污染提供了極為重要的技術手段。

2006年8月中國藥典2005年版無菌、微生物限度及細菌內毒素檢查方法學驗證內容簡介108二、細菌內毒素1細菌內毒素與熱原的關系

注射給藥過程中，偶爾會出現發熱、寒戰、頭痛、惡心、嘔吐等癥狀，嚴重的甚至昏迷、死亡，將這種藥物的不良反應稱之為熱原反應，能引起上述熱原反應的物質被稱之為熱原（Pyrogen）。熱原與內毒素的關系在學術上仍有爭論，但目前認為，在GMP的條件下，內毒素是主要的熱原物質，可以說無內毒素就無熱原，控制細菌內毒素就控制熱原物質。這也正是鱟試劑用于藥物生產過程或藥物成品熱原檢測的基礎。

2006年8月中國藥典2005年版無菌、微生物限度及細菌內毒素檢查方法學驗證內容簡介109過去一直認為細菌內毒素來源于革蘭陰性細菌，但最近發現存在革蘭陰性菌來源的不具有內毒素毒性的革蘭陰性細菌脂多糖（LPS）結構。因此，目前認為所有內毒素均為脂多糖，但非所有的脂多糖均為內毒素。2006年8月中國藥典2005年版無菌、微生物限度及細菌內毒素檢查方法學驗證內容簡介1102鱟試劑反應機制參與鱟血細胞凝集的成分是細菌內毒素的C因子、B因子、G因子、凝固酶原和凝固蛋白原。G因子激活的鱟試劑激活旁路，鱟試劑中的G因子可以被真菌、酵母和藻類細胞壁中另一類細菌多糖--（1，3）-β-D-葡聚糖激活，因此鱟試劑同內毒素的反應不是特異的。LPS不能激活G因子旁路。但是，鱟試劑同葡聚糖的反應與鱟試劑同內毒素的反應敏感性是不一致的。有實驗表明不同的鱟試劑在檢測葡聚糖和內毒素上存在很大的差異，鱟試劑與內毒素的反應更靈敏。2006年8月中國藥典2005年版無菌、微生物限度及細菌內毒素檢查方法學驗證內容簡介111盡管與鱟試劑反應的物質不完全是內毒素，但目前作為鱟實驗基礎的兩個原則仍是：1、內毒素活性與熱原性相關，家兔和鱟實驗作為人類發熱和炎癥反應的預測方法是相關的。2、在注射劑GMP生產環境下，不存在內毒素也就意味著不存在主要的熱原物質。盡管存在少數例外，但依然可以使用。2006年8月中國藥典2005年版無菌、微生物限度及細菌內毒素檢查方法學驗證內容簡介112C因子活化的C因子內毒素活化的B因子B因子凝固酶凝固酶原凝固蛋白（凝膠）凝固蛋白原β(1,3)-D-葡聚糖或LAL-RM活化的G因子（旁路反應）G因子抗LPS因子凝膠法鱟試劑與內毒素的反應機理

——復雜的酶促反應過程2006年8月中國藥典2005年版無菌、微生物限度及細菌內毒素檢查方法學驗證內容簡介1133細菌內毒素標準品1.0IU=1.0EU我國內毒素參考標準品無論是在賦形劑的選擇，還是標定標準和方法的使用上均與國際參考標準品取得了一致。

2006年8月中國藥典2005年版無菌、微生物限度及細菌內毒素檢查方法學驗證內容簡介1144鱟試劑凝膠反應的特征

⑴隨著鱟試劑反應的進行，凝固蛋白不斷增加，伴隨凝聚的形成，光密度也會增加。⑵內毒素的濃度決定了光密度增加的速率。⑶凝膠形成反應呈S型曲線（分為初期的平臺期、快速增長期和后期的平臺期）。這些特性構成了各種檢測方法的理論基礎。2006年8月中國藥典2005年版無菌、微生物限度及細菌內毒素檢查方法學驗證內容簡介1155近兩版中國藥典細菌內毒素檢查法的應用

2000年版藥典內毒素檢查品種增加至69種，檢測方法也由單一的凝膠法增加了定量檢測法。2005年版藥典不但增加了112種檢查品種，并且對細菌內毒素檢查法進行了全面的修訂，使之與美國、歐盟和日本三方協調統一的方法趨于一致。國家SFDA正組織相關專業組對2005年版藥典部分進行熱原檢查的品種開展細菌內毒素檢查方法學研究。2006年8月中國藥典2005年版無菌、微生物限度及細菌內毒素檢查方法學驗證內容簡介1166細菌內毒素檢查法的方法學在方法學上，試管凝膠法已成為內毒素檢查法的經典方法，并被普遍使用。但是凝膠法仍然存在著不能定量等缺點，于是隨著光電子和計算機領域的進步，在凝膠法的基礎上，作為細菌內毒素定量分析的比濁法和比色法逐漸發展成熟，并很快得到推廣和使用，到目前為止已被許多國家的藥典收載，并被統稱為光度法。2006年8月中國藥典2005年版無菌、微生物限度及細菌內毒素檢查方法學驗證內容簡介117比濁法的原理是采用分光光度計檢測凝膠形成過程中濁度的變化，從而定量檢測細菌內毒素；比色法則是利用凝固酶水解顯色底物，產生的顯色基團使吸光度發生變化，以此進行定量的方法。2006年8月中國藥典2005年版無菌、微生物限度及細菌內毒素檢查方法學驗證內容簡介118兩種方法又根據檢測過程的不同被分為終點比濁法（EnedpointTurbidimetricAssay）、動態比濁法(KineticTurbidimetricAssay)和終點比色法（EndpointColorimetricAssay）、動態比色法（KineticColorimetricAssay）。2006年8月中國藥典2005年版無菌、微生物限度及細菌內毒素檢查方法學驗證內容簡介119凝膠法和終點法采用單一的時間點采集結果數據，決定反應在規定的時間內是否達到預定的水平。而動態法則是在適當的檢測波長下監測整個反應過程的數據。內毒素的濃度決定了蛋白凝膠形成的速率，因此，通過測量達到設定光密度的時間，確定光密度隨時間的改變情況，以建立光密度變化的速率與參照內毒素之間的線性關系。2006年8月中國藥典2005年版無菌、微生物限度及細菌內毒素檢查方法學驗證內容簡介120終點法中人為的加入反應終止劑，并且在此時間點讀取和記錄樣品和標準曲線點的光密度，其缺點是：必須人為的終止反應，標準曲線的范圍有限，僅為一個Log。而在動態法中光度檢測儀連續的讀取光密度的變化，動態監測光密度的變化，記錄達到設定的光密度所需要的時間。動態法以已知的標準內毒素濃度的對數與最終反應時間的對數作圖，因此，測定范圍可跨越4-5個Log（一般為0.005-50EU/ml），克服了終點法的缺點。2006年8月中國藥典2005年版無菌、微生物限度及細菌內毒素檢查方法學驗證內容簡介121動態比濁法：凝膠的濁度形成是凝膠形成的前提，因此，在這個意義上濁度法其實是凝膠法的延伸。進行濁度法的鱟試劑含有凝固蛋白原的量足以在凝固酶的作用下形成濁度，但不足以形成凝膠。濁度法克服了凝膠法只能檢測某一個限值水平的缺點，可以定量一定范圍內的內毒素含量。現在細菌內毒素定量法的使用率在國外已超過凝膠法，大約占65%～70%，并且還在逐年上升。2006年8月中國藥典2005年版無菌、微生物限度及細菌內毒素檢查方法學驗證內容簡介122細菌內毒素檢查方法的指導原則方法標準物質限值的確定干擾試驗檢驗2006年8月中國藥典2005年版無菌、微生物限度及細菌內毒素檢查方法學驗證內容簡介123一、方法細菌內毒素檢查法包括凝膠法和光度測定法凝膠法為限量測定方法，光度測定法為定量測定方法凝膠法分為限量試驗和半定量試驗；光度測定法包括動態濁度法、終點濁度法、動態顯色法和終點顯色法兩種方法可任選一種進行內毒素的檢測當測定結果有爭議時，除有特殊規定外，以凝膠法結果為準2006年8月中國藥典2005年版無菌、微生物限度及細菌內毒素檢查方法學驗證內容簡介124二、標準物質除另有規定外，細菌內毒素國家標準品或細菌內毒素工作對照品應使用由中國藥品生物制品檢定所統一發放的標準品2006年8月中國藥典2005年版無菌、微生物限度及細菌內毒素檢查方法學驗證內容簡介125三、限值的確定1計算公式

L=K/M·······

藥品人用最大劑量參考《國家藥品標準化學藥品說明書內容匯編》。中國人均體重按60kg計算；人均體表面積按1.55m2計算。注射時間小于1小時的，按1小時計算。2006年8月中國藥典2005年版無菌、微生物限度及細菌內毒素檢查方法學驗證內容簡介1262對于抗腫瘤和治療心血管疾病的藥物，限制可在計算出的限值基礎上適當嚴格。3大輸液類，規格≥100ml的限值可按0.5EU/ml計；規格<100ml或既有≥100ml規格又有<100ml規格的品種，限值應按《國家藥品標準化學藥品說明書內容匯編》中規定的有效成分的最大用量計算。2006年8月中國藥典2005年版無菌、微生物限度及細菌內毒素檢查方法學驗證內容簡介1274對于美國、歐洲和日本藥典已收載細菌內毒素檢查項目的品種，可參考國外藥典規定的的限值，并與公式計算出的限值比較，以嚴格者計。如使用國外藥典規定的的限值，應以最新版藥典為準。2006年8月中國藥典2005年版無菌、微生物限度及細菌內毒素檢查方法學驗證內容簡介128四、干擾試驗建立新品種細菌內毒素檢查法時，要求至少檢測三批樣品（如為新藥需檢測連續生產的三批樣品），同時使用兩個鱟試劑廠家的鱟試劑進行干擾試驗。如同一樣品對兩個廠家的鱟試劑測定結果差異較大，應使用第三個廠家的鱟試劑。在確認該品種在某一濃度下不干擾細菌內毒素檢查，或該品種在有效濃度仍有干擾作用但采用適當方法能消除這種干擾時，該品種方可采用細菌內毒素檢查方法。2006年8月中國藥典2005年版無菌、微生物限度及細菌內毒素檢查方法學驗證內容簡介129對于只能使用高靈敏度才能消除干擾進行檢測的品種，需慎重考慮，最好有另一實驗室進行復核。藥品生產廠家建立新品種細菌內毒素檢查法時，應將方法學驗證試驗報告送國家或省級藥檢所復核。2006年8月中國藥典2005年版無菌、微生物限度及細菌內毒素檢查方法學驗證內容簡介130五、檢驗當對供試品陽性檢驗結果有疑義時，應考慮供試品中是否有可以引起假陽性結果的干擾因素，如葡聚糖等物質。可采用特異性鱟試劑或其它可排除干擾的方法再次試驗，以判定供試品是否符合規定。2006年8月中國藥典2005年版無菌、微生物限度及細菌內毒素檢查方法學驗證內容簡介131細菌內毒素檢查方法的建立

與驗證影響因素信息的收集主要步驟常見的干擾因素和處理方法學驗證注意事項

實例2006年8月中國藥典2005年版無菌、微生物限度及細菌內毒素檢查方法學驗證內容簡介132一、影響因素

細菌內毒素檢查法作為控制藥品質量的有效方法，已經廣泛的被世界各國藥典收載。盡管經過30多年的不斷改進，無論是凝膠法還是光度法均比較成熟和完善。但是，在為新化合物或新藥建立細菌內毒素檢查方法時，常常會遇到各種各樣的困難。大輸液品種遇到的問題相對較少，小針劑在方法建立中，由于小針劑體積小，藥物濃度高，很容易干擾樣品中添加內毒素的回收。尤其是尚處于新藥研發早期階段的化合物，由于藥物制劑、賦形劑等還不穩定，經常會發生變化，這樣給方法建立帶來不同程度的影響。2006年8月中國藥典2005年版無菌、微生物限度及細菌內毒素檢查方法學驗證內容簡介133常見的影響因素包括：樣品不溶于水、樣品本身具有內毒素樣活性或含有內毒素（應在干擾實驗前要去除）、藥物的規格發生變化，藥物的臨床用量發生變化等。2006年8月中國藥典2005年版無菌、微生物限度及細菌內毒素檢查方法學驗證內容簡介134二、信息的收集在建立細菌內毒素檢查法之前，應盡可能的收集有關該藥品的基本信息，例如：有關樣品的溶解性信息，推薦的稀釋液，在水中的溶解度，以及最適溶劑等；樣品的pH范圍；分子量大小；產品規格、體積或重量；擬用于臨床的用法和用量；還應了解是否為已知的鰲合劑；是否具有酶活性（如胰島素或絲氨酸蛋白酶）；活性組分是否會在70℃水浴中被滅活，是否可能含有纖維素物質等。2006年8月中國藥典2005年版無菌、微生物限度及細菌內毒素檢查方法學驗證內容簡介135以便選擇合適的樣品處理方法和內毒素檢查方法，尤其是對于一個正處于早期研發階段的藥物。應選擇合適的賦形劑，以有利于細菌內毒素檢查方法中對樣品的稀釋處理。此外，在制定限值時還應盡可能的采用最大人擬用劑量，為臨床安全性和有效性研究中增加劑量留出空間。2006年8月中國藥典2005年版無菌、微生物限度及細菌內毒素檢查方法學驗證內容簡介136三、主要步驟對某一新化合物建立一個新的細菌內毒素檢查方法的基本流程如圖。首先根據人體最大日給藥劑量和給藥途徑，計算和確定樣品的內毒素限值，選擇合適的鱟試劑，根據臨床規格，計算最大有效稀釋倍數，稀釋產品，并在低于最大稀釋倍數的濃度下檢驗。可以采用凝膠法，也可以用終點法或動態法。2006年8月中國藥典2005年版無菌、微生物限度及細菌內毒素檢查方法學驗證內容簡介137細菌內毒素檢查法建立的基本流程圖藥物方法建立收集藥物有關信息，確定最大劑量和內毒素限值,計算最大有效稀釋倍數或最小有效濃度。確定藥品溶解度特性，進行預試驗進行驗證試驗干擾無法去除選擇其他方法

可能的干擾因素：PH值、蛋白修飾、非特異鱟試劑激活、內毒素污染驗證試驗（3批樣品）建立細菌內毒素檢查方法2006年8月中國藥典2005年版無菌、微生物限度及細菌內毒素檢查方法學驗證內容簡介1381內毒素限值的確定一個藥品在投放市場前，它是否滿足內毒素限值要求？樣品的內毒素含量是多少？與前一批的結果比較相差多少？與內毒素限值含量相差多少？這些問題不但關注用藥安全，同時也考慮了生產環境的內毒素含量變化。因此，一個完善的細菌內毒素檢查法的建立，除了要滿足法規相關的強制性要求，保證臨床用藥人群的安全外，還應該最大限度的提供有關內毒素含量的信息，為藥品生產過程的質量控制提供警戒信息。2006年8月中國藥典2005年版無菌、微生物限度及細菌內毒素檢查方法學驗證內容簡介139盡管細菌內毒素檢查方法的建立是一個科學方法的研究過程，但其最終目的還是要為控制藥品質量服務。因此，不但要闡明限值的合理性，也要滿足相關藥品管理法規的要求。所以在建立方法時，不但要考慮技術可能達到的限值，也要考慮藥品管理的法規要求。

2006年8月中國藥典2005年版無菌、微生物限度及細菌內毒素檢查方法學驗證內容簡介140研究人員在建立方法的早期，一般會按照臨床建議的最大人用劑量確定一個非正式的限值，這個限值可以根據實驗室可以達到的最低檢測水平，把限值訂的相對比較嚴格，但往往由于早期的臨床劑量會比最終上市的臨床劑量高幾倍，所以嚴格的限值，可能會使得正式投產時很多產品不能通過檢查，從而造成不必要的浪費。2006年8月中國藥典2005年版無菌、微生物限度及細菌內毒素檢查方法學驗證內容簡介141相反也可以按照法規允許的最高水平，確定樣品的限值，但是若標準制訂的太接近法規允許的計算值，一旦產品內毒素水平超出允許范圍，幾乎沒有警告和改善生產條件的機會，并失去日常檢驗對生產過程的質量監督作用。若標準制訂的離法規允許的計算值較遠，通過日常檢測結果可以掌握內毒素含量的變化，從而為改善生產環境提供充足的時間。

2006年8月中國藥典2005年版無菌、微生物限度及細菌內毒素檢查方法學驗證內容簡介142樣品內毒素限值的確定一般與臨床人體最大給藥劑量有關，劑量越大，單位重量或體積的內毒素限值越低。一般按以下公式確定：內毒素限值=K/M式中內毒素限值是以EU/ml，EU/mg或EU/u表示；K為按規定的給藥途徑，人體每公斤體重每小時最大可耐受的內毒素劑量，以EU/（kg.h）表示。注射劑K=5EU/（kg.h），其中放射性藥品注射劑K=2.5EU/（kg.h），鞘內用注射劑K=0.2EU/（kg.h）。2006年8月中國藥典2005年版無菌、微生物限度及細菌內毒素檢查方法學驗證內容簡介143假如我國人群平均體重按60kg計算，人體對細菌內毒素的最大耐受量為300EU/h，假如我國人體的平均體表面積按1.55m2計算，人體每平方米的最大耐受劑量為(300EU/h)/1.55m2=（193EU/h）/m2

。M為人體每公斤體重每小時接受的最大給藥劑量，以ml/（kg.h）、mg/（kg.h）或u/（kg.h）表示。2006年8月中國藥典2005年版無菌、微生物限度及細菌內毒素檢查方法學驗證內容簡介144內毒素限值計算舉例（一）：A產品的人體最大用量為每小時1.5g，每公斤每小時體重的劑量為1.5g/60kg=0.025g/kg=25mg/kg內毒素限值=K/M=(5EU/kg)/(25)mg/kg=0.2EU/mg因為在細菌內毒素檢查法中，細菌內毒素標準品和鱟試劑均以EU/ml表示，所以在具體實驗中樣品的內毒素的限量可以轉換為EU/ml的表示方法