《基于環境DNA的長江水生生物監測與完整性評價技術導則》編制說明（征求意見稿）i 2 2 2 3 6 6 6 7 8 8 9 11.1任務來源），1.2起草單位和主要起草人1.3工作過程2024年1月，依托國家重點研發計劃課題——“水生態系統完整性技術體2024年4月，標準編制組向重慶市環境科學學會申請團體標準立項。同月16日，重慶市環境科學學會組織召開了標準開題論證會，經編制組匯報與專家22標準制訂的必要性2.1管理支撐系和評價體系”。“十四五”重點流域水生態環境保護規劃要求在長江、遼河、海2.2技術進步現行標準和技術規范不足以支撐長江水生態環境管理和生物完整性保護工外，通過形態學鑒定的方法進行水生物種監測具有多種局限性1）采樣要求差2）分類鑒定過于依賴專家的經驗，對研究人員的經驗要求較高，質控困難3）在生活史早期階段的部分生物類群以及特定發育階段的生物往往難以3于水生生物多樣性監測中[2]。相對于傳統的形態學監測方法，環境DN檢測群落多樣性4）流程的標準化程度高，易重復，便于質量控制。因此，3國內外研究進展3.1國外研究進展的淡水珍珠貽貝調查中，對目標物種難以發現和識別。2017年Charise等大麻哈魚（Oncorhynchustschawytscha）[7]，在日本桂川河流域檢測到日本大鯢4研究中很多方法針對某個物種而研發相應的特異性PCR引物，對環境中目標物種的DNA進行針對性擴增以檢測到該物種的存在。Antoinette等在佛羅里達水域展開對入侵種緬甸蟒（Burmesepython）[11]監測方法的研究，研究者們開發出年MatthieuLeray和NancyKnowlton在對Virginia和Flori生物群落結構的研究中使用COI基因為特異性識別片段[12]，利用DNA條形碼技在環境DNA技術標準化方面，國際上已經制定了基于環境DNA的生物監采樣、實驗手冊》。2020年，瑞士環境署頒布了聯合蘇黎世大學等單位發布了（COST）出臺了《環境DNA生物評估方法指南》。2022年，澳大利亞政府農業、漁業和林業部門倡議制定了《環境DNA生物監測手冊》《環境DNA檢測53.2國內研究進展會團體標準《淡水生物監測環境DNA宏條形碼法》（T/CSES81—2023）、中148—2024）、北京市地方標準《魚類貝類環境DNA識別技術規范（DB11/T2023—2022）》、遼寧省地方標準《水質DNA條形碼鑒定底棲動物（DB21/T3.3前期研究成果申請環境DNA專利5項，發表環境DNA相關學術論文十余篇，較為全面的揭示了長江水生生物完整性狀況，為長江水生態保護64編制原則和技術路線4.1編制原則（2）合理性：總結現有文獻資料及環境DNA監測技術的基礎上，可操作4.2技術路線7專家咨詢吸取專家意見專家咨詢標準開題會吸取專家意見標準開題會標準審查會吸取專家意見標準審查會吸取專家意見標準審查會5標準主要技術內容5.1總體框架第3章：術語和定義。規定了本標準中使用的5個關鍵的術語和定義。8第5章：基于環境DNA的長江水生生物監測。規定了如何基于環境DNA5.2適用范圍圍內，對水生生物進行監測與生物完整性的評價，其他流域可參照使用。環境5.3規范性引用文件95.4術語和定義本部分針對本標準中關鍵的5個術語和定義進行了規定，具體如下：本定義綜合參考了《淡水生物監測環境DNA宏條形碼法》（T/CSES81—2023）團體標準與期刊論文[18]的表的生物遺傳物質（DNA）。期刊論文[18]中將環境DNA定義為：環境DNA指從水、沉積物、土壤、糞便、空氣等環境介質中提取的各種生物的全部DNA，可獲得多種生物多樣性信息。本標準針對二者進行優化整合，保留二者對“環境介質”的開放性描述，如水、土壤、沉積物、生物膜、空氣等，吸納期刊論文定義定義為：生物體細胞核或者細胞器中能夠代表該物種的標準的、有足夠易擴增的短DNA序列，可用于生物的識別和鑒定。期刊論文[19]中闡述DNA條義中“足夠變異”的模糊表述，避免因變異閾值不清導致的物種誤判；保留“細胞核或細胞器”來源描述，同時通過“特定的、標準的短行中的每個樣本都是不同的，并使序列能夠在操作分類單元（operationaltaxonomicunit）：DNA條形碼技術中，高通量2358-2024）當中對操作分類單元的術語定義：測序數據按照一定的序列相似性大規模測序技術。5.5工作程序參照國際最新研究成果以及發布的相關技術規范，本標準規定基于環境DNA的長江水生生物監測與完整性評價步驟分為環境DNA監測和完整性評價評價包括評價指標、指標賦分方法和評價步圖2基于環境DNA的長江水生生物監測和完整性評價技術流程5.6基于環境DNA的長江水生生物監測境DNA在環境水體中有豐富的分布，因此這幾個類群環境DNA的采樣介質可DNA的濃度也高于水體。因此，結合《長江流域水生態監測方案（試行）》中表1水生生物類群及其環境DNA采樣介質水生生物類群常用采樣介質適用水體類型魚類水體河流、湖庫大型底棲無脊椎動物表層沉積物河流、淺水湖泊浮游動物水體湖泊重點保護水生生物根據棲息環境確定有重點保護水生生物分布的水體參照《水生態監測技術指南河流水生生物監測與評價（試行）》和《水生物的DNA，導致環境DNA出現假陽性，因此，采樣點位的布設主要參照《地表水環境質量監測技術規范》（HJ91.2）執針對長江流域制訂，因此，點位的布設可結合長江水生態考核辦法規定的50個），位和92個重點湖泊點位）確定（見表3），也可根據需要自行確定采樣范圍和序號省份水體類型水體重點保護水生生物物種數1青海河流長江干流（青海）32長江干流（四川）243赤水河（四川）4岷江215嘉陵江（四川）6沱江7雅礱江8西藏長江干流（西藏）59云南長江干流（云南）24云南赤水河（云南）7重慶長江干流（重慶）重慶嘉陵江（重慶）21重慶烏江（重慶）貴州赤水河（貴州）9貴州烏江（貴州）貴州清水江甘肅7甘肅嘉陵江（甘肅）21湖北長江干流（湖北）2420湖北漢江（湖北）21湖南長江干流（湖南）2422湖南湘江2223湖南資江324湖南沅江2225湖南澧水526江西長江干流（江西）2427江西贛江928漢江（陜西）29嘉陵江（陜西）2130河南丹江（河南）/31廣西湘江西源/32安徽長江干流（安徽）33江蘇長江干流（江蘇）34浙江東苕溪135浙江西苕溪136上海長江干流（上海）37上海黃浦江338云南湖泊滇池639貴州草海/40湖北洪湖/41湖南洞庭湖42江西鄱陽湖643安徽巢湖/44江蘇太湖/45江蘇淀山湖—元蕩（江蘇）/46上海淀山湖—元蕩（上海）/47重慶水庫三峽水庫（重慶）948湖北三峽水庫（湖北）949湖北丹江口水庫（湖北）550河南丹江口水庫（河南）5表3長江流域水生生物監測位點清單序號點位名稱1直門達97.248133.0219河流2通天河大橋95.826634.0358河流3庚卓如瓦96.962233.3438河流4洛須鎮溫托村98.997529.7111河流5江達具鄧科鄉97.981132.4644河流6江達縣波羅鄉98.602031.1879河流7金江橋26.1838河流8五孫廟26.5654河流9金沙江樹底橋27.0058河流龍洞26.5384河流新華99.958326.9331河流三塊石28.6317河流倒流子28.4728河流黃沙坡28.6469河流洗白27.4996河流岔河渡口27.7147河流洛甸河水文站27.6859河流金沙江崗托橋98.596731.6178河流倮果26.6010河流20石門子28.7406河流21水磨溝村99.055029.9381河流22掛弓山28.7815河流23江南鎮沙嘴上28.7849河流24納溪大渡口(左岸)28.7488河流25手爬巖28.8950河流26沙溪口28.8813河流27蒙姑26.5719河流28賀龍橋99.389228.1706河流29拉鯡26.3652河流渭門橋31.7589河流鎮平鄉32.1636河流悅來渡口29.7273河流岷江青衣壩29.4974河流涼姜溝28.7799河流彭山岷江大橋30.2114河流岷江東青交界29.9044河流映秀31.0456河流岳店子下30.3575河流河口渡口29.1419河流40月波29.0423河流41雅礱江口26.6120河流42雅江縣城上游29.2033河流43呷拉鄉雅礱江99.978831.6115河流44柏枝沙灘27.1095河流45長須干馬鄉99.006132.7519河流46沙溪(底)31.6200河流47金溪電站31.1572河流48上石盤32.3890河流49金子30.2134河流烈面30.5035河流元西村32.5368河流伍嘉碼頭30.9585河流新政電站31.3108河流小渡口30.7336河流麻柳包31.4010河流醒覺溪28.8045河流宏緣30.6033河流拱城鋪渡口30.0608河流大磨子28.9678河流李家灣29.1044河流老翁橋29.2658河流銀山鎮29.6872河流幸福村(河東元壩)29.9614河流腳仙村29.4413河流沱江大橋(底)28.8849河流和尚山29.5076河流江津大橋29.2670河流寸灘29.6180河流豐收壩29.3949河流沙溪鎮29.7129河流北溫泉29.8368河流井口(嘉陵江右岸)29.6633河流大溪溝29.5705河流梁沱(左岸)29.6012河流長江涪陵菜場沱29.7115河流麻柳嘴29.5955河流鑼鷹29.3867河流江口鎮爛泥坨29.2818河流鹿角29.1333河流大關橋26.8673河流六廣27.0067河流烏江下五龍27.3012河流大烏江鎮27.4009河流烏楊樹27.9969河流沿河28.6225河流清池27.7390河流黃歧坳27.7817河流茅臺27.8603河流九龍囤28.2917河流鰱魚溪28.6078河流茶園岔河26.3604河流興仁橋26.3247河流下司26.4944河流旁海26.7482河流茅坪26.7476河流崔家25.5236河流大沖口25.7272河流大源屋26.0130河流白果村26.2509河流白龍江兩河口橋33.6975河流姚渡32.7865河流洛大33.9797河流固水子村33.3280河流33.6034河流站兒巷33.7820河流烈金壩33.0438河流老君關32.7156河流黃金峽33.1934河流南柳渡33.1118河流蘭灘32.8794河流八廟溝32.8315河流魯光坪33.3117河流黃牛鋪34.1950河流灶火庵33.9021河流鳳州33.9567河流淅川史家灣33.0805河流荊紫關丹江河橋33.2533河流寺灣鎮丹江河橋33.1605河流沈灣32.4650河流白家灣32.0584河流仙人渡32.2259河流陳家坡32.8046河流羅漢閘30.6898河流皇莊31.1851河流黑流渡30.5411河流轉斗31.4598河流余家湖31.9142河流漢南村30.4045河流石到30.4183河流小河30.6805河流石牌港30.9930河流岳口30.5010河流宗關30.5772河流云池(白洋)30.4310河流調關29.6982河流柳口29.9714河流磚瓦廠30.2848河流觀音寺30.2322河流荊江口29.4664河流南津關30.7687河流白滸山30.5484河流紗帽30.3083河流黃蓋湖鎮右29.8661河流中官鋪29.8443河流風波港(右岸)30.2143河流劉佐(左岸)29.8233河流燕磯30.4067河流桑植打鼓泉渡口29.4551河流永定澄潭(區水廠)29.1253河流張公廟29.6008河流澧水三江口29.5884河流窯坡渡29.5937河流永定潭口29.1897河流沙河口29.2600河流大夫廟26.2790河流港子口26.5032河流歸陽鎮26.5371河流新塘鋪26.7780河流城北水廠26.9122河流魚石村26.9792河流樟樹港28.5686河流熬洲27.3281河流桔子洲28.1678河流昭山27.9720河流馬家河27.8489河流諸葛廟26.2068河流五強溪28.7746河流浦市上游28.0852河流陳家河(四水廠)28.9848河流武水匯合口28.2866河流侯家淇28.4107河流27.1486河流坡頭28.9130河流城陵磯(右岸)29.4833河流天字一號29.6978河流陸城29.6083河流江南鎮29.7631河流君山長江取水口29.4825河流桂花渡水廠27.2074河流桃谷山28.5419河流球溪27.6024河流萬家嘴28.6168河流新化水廠27.7194河流曬谷灘電站27.3300河流坪口28.0478河流臨資口28.7000河流瓦石磯28.7139河流株溪口28.3986河流新廟前25.9953河流青原七姑嶺26.9731河流新干車頭27.6854河流生米28.5417河流豐城小港口28.2619河流吳城贛江29.1884河流周坊28.7864河流吉里28.7783河流馬當渡口29.9917河流湖口(右岸)28.7783河流彭澤紅光村29.8592河流200九江縣大屋何29.8381河流201陳家墩(右岸)31.0784河流202皖河口(左岸)30.4892河流203前江口(左岸)30.5734河流204五步溝(右岸)30.8063河流205民生水廠(右岸)30.6789河流206三興村(底)31.7788河流207元寶圩(左岸)30.9985河流208東西梁山31.5014河流209烏江(左岸)31.8425河流210塘浦30.6459河流211荊灣30.8288河流212鐵路橋30.8817河流213新港口30.9401河流214遞鋪30.6529河流215汪家埠30.2572河流216城南翻水站30.5314河流217東升30.6547河流218城西大橋30.8652河流219毗山30.8784河流220團結閘31.7915河流221高港碼頭(左岸)32.2851河流222小河口上游(左岸)32.2429河流223焦山尾(右岸)32.2264河流224瀏河(右岸)31.5468河流225魏村(右岸)32.0070河流226九鄉河口32.1780河流227下青龍港32.0512河流228小灣(右岸)31.9401河流229啟東港31.7483河流230朝陽農場31.1722河流231崇明東灘(左岸)31.3911河流232東風西沙31.7048河流233白龍港(右岸)31.3092河流234青草沙進水口31.4908河流235淀峰31.0897河流236夏字圩30.9723河流237閔行西界30.9794河流238吳淞口31.3836河流239臨江31.1127河流240草海中心24.9917湖泊241灰灣中24.9136湖泊242羅家營24.8900湖泊243觀音山東24.8372湖泊244觀音山中24.8372湖泊245觀音山西24.8372湖泊246海口西24.7733湖泊247滇池南24.7064湖泊248白魚口24.8100湖泊249斷橋25.0150湖泊250草海楊關山26.8742湖泊251草海中部26.8515湖泊252朱家灣子26.8335湖泊253萬下河口26.8548湖泊254劉家巷26.8491湖泊255洪湖湖心A29.8396湖泊256楊柴湖29.7936湖泊257排水閘29.8281湖泊258洪湖湖心B29.8817湖泊259小港29.9284湖泊260王垸村29.8821湖泊261下新河29.9477湖泊262洪湖5#29.8760湖泊263桐梓湖29.8118湖泊264鹿角(洞)29.1541湖泊265扁山29.3380湖泊266東洞庭湖29.3300湖泊267洞庭湖出口29.4429湖泊268橫嶺湖28.8375湖泊269虞公廟28.8297湖泊270岳陽樓29.4027湖泊271蔣家嘴28.8631湖泊272萬子湖28.8184湖泊273南嘴29.0630湖泊274小河嘴28.8516湖泊275東洞庭湖湖心29.2454湖泊276主湖體129.4279湖泊277主湖體429.2062湖泊278磊石山28.9722湖泊279蓮湖29.0215湖泊280康山28.9406湖泊281南磯山28.9924湖泊282伍湖分場29.0559湖泊283青嵐湖28.4913湖泊284三山29.1498湖泊285星子29.4447湖泊286老爺廟29.3730湖泊287蚌湖29.2842湖泊288鄱陽湖出口29.7272湖泊289蛤蟆石29.6090湖泊290都昌29.2455湖泊291梅溪咀28.8000湖泊292白沙洲29.1233湖泊293湖濱31.6461湖泊294黃麓31.5778湖泊295新河入湖區31.5674湖泊296西半湖湖心31.6527湖泊297龜山31.6019湖泊298東半湖湖心31.5220湖泊299忠廟31.5658湖泊300兆河入湖區31.4726湖泊301天燈村31.5900湖泊302炯煬31.6343湖泊303花塘31.5606湖泊304余家墩31.4800湖泊305南淝河入湖區31.6862湖泊306孤山31.6021湖泊307派河入湖區31.6607湖泊308梅梁湖心31.4686湖泊309錫東水廠31.4478湖泊310沙渚南31.3789湖泊竺山湖心31.3909湖泊312蘭山嘴31.2167湖泊313胥湖心31.1717湖泊314烏龜山南31.3103湖泊315西山西31.1347湖泊316拖山31.3919湖泊317椒山31.3333湖泊318漫山31.2328湖泊319平臺山31.2258湖泊320十四號燈標31.0628湖泊321澤山31.0136湖泊322大雷山31.1364湖泊323五里湖心31.5131湖泊324大浦口31.2967湖泊325東太湖31.0933湖泊326元蕩31.0700湖泊327千燈浦口31.1876湖泊328新華港31.1383湖泊329汪洋蕩31.1406湖泊330淀山湖中31.1200湖泊331急水港口31.1039湖泊對于環境DNA的水樣，采用濾膜過濾的方式采集環境DNA仍然的方式，濾膜的孔徑大小目前文獻中沒有統一，一般情況下0.45微米的濾膜適），）；大程度的捕獲環境DNA，因此，在具備條件的河流斷面，可采用立體采品，在DNA提取之前需進行預處理。根據選擇的DNA提取方法，必要時以抽解液將濾膜振蕩破碎；對于沉積物樣品宜將樣品均DNA提取后，應對其濃度和質量進行檢測。一般用于后續間，OD260/230應大于2.0，否則表明DNA純度不足，可能有蛋白質、RNA或測到隱性或難以采集的物種。純化則是為了去除PCR擴增過程中可能出現的非（一般6～8bp）。推薦引物可參照T/CSES81—2023或相關文條形碼基因的擴增產物用1%～2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，應呈現單一清表4中華鱘和長江江豚條形碼基因擴增引物引物序列（5,-3,）鱘ND4YFPDloop-F段克隆到載體中，形成一個可以長期保存并且能夠代表原始樣本基因信息的DNA文庫。文庫構建的主要目的是為后續的高通量測序、功能分析以及基因組學研究提供系統化的DNA資源。通過構建文庫，可以獲得一個包含多種不同DNA片段的集合，這些片段能夠全面、準確地代表整個樣本的遺傳信息，為后文庫構建包括混庫、末端處理、接頭連接、混庫是將使用同一個引物進行PCR擴增的所有產物等比例混庫，混庫可以段進行磷酸化和3端添加dA尾，以產生黏性末端。配PCR儀給末端處理產物連接接頭。接頭的文庫長度可通過基于電泳分離原理的設備進行檢測，確保文庫的長度符合預期。），高到>Q30等，將進一步提高測序正確率，但同時也會剔除掉更多的個樣本的OTU統計表由OTU名稱、序列、物種注釋的分類信息（門、綱、目、個技術重復以增加結果的確定性2）在生物信息學分析過程中，對于同一批有疑義時回溯3）假陽性與假陰性是經常可能出現的問題，在物種注釋時，升結果的可信度，為后續監測、長期數據對比和區域間數據共享提供有力保障，具體措施包括1）所有采樣工作遵循標準化采樣流程，使用無菌技術采集樣實驗場所應滿足分子生物學實驗室的各項條件，如，PCR產物因操作不當極容易引起氣溶膠污染，會影響實驗結果準確性，因此應將PCPCR產物純化檢測區進行強制性物理隔離。另外，實驗前應對實驗室環境（實驗臺、儀器設備、實驗耗材等）消毒滅菌，避免污染和交叉污染。（3）詳實記5.7水生生物完整性評價IBI在實踐中操作簡便，能夠為管理者提供定量化、標準化的評估依據，水生生物分別建立IBI。在我國發布的技術文監測與評價（試行）》（HJ1295—2023）和《水生態監測技術指南湖泊和水庫水生生物監測與評價（試行）》（HJ1296—2023）兩項技術規范中，規定的定指標參考值、指標賦分、水生生物完整性指數最終得進行評估，包括人類活動的干擾強度、河湖/庫的物理這一方法的實施旨在確保在不同區域能夠根據慣例。對于重點保護水生生物，指的是國家I級和II級重點保護水生生物，則參照長江水生態監測方案和農業農村部的技術文件，以物種種類數比例對生物完整性進行評價。各項指標的賦分標準采用百分制，也主要參考農業農村部技術文件確定。在對生物完整性進行分級評價之前，首先需要對各項指標的賦分進行綜合對比決定取舍原則。依據農業農村部文件，單一生物類群的不同指標，以得最低分的指標分值為準；不同生物類群的分值綜合起來進行最終評價時，則取分值的算術平均值作為最終分值。這一方面考慮了保守的生態環境保護理念，另一方面，也考慮了不同生物類群完整性評價的均衡性，結論更為科學。評價分級的標準則按照百分制，每20分一個等級，分為優、良、中、差、劣五個等級，這種分級方法也較為常見，主要參考了農業農村部技術文件、生態環境部技術文件以及廣東省生態環境廳于2021年發布的《廣東省江河湖庫水生態環境調查與評價技術指引（試行）》中的分級方法。6標準實施建議6.1確保資源和技術準備充分6.2加強質量控制和質量保證體系建設括采樣、DNA提取、擴增、測序等）的質量達到規6.3加強培訓與能力建設EnvironmentalResearch.2023;239.DNAfromsediments[J].JournalofMicrobiologicalMethods.1987;unsaturatedbiofilms[J].AppliedandEnvironmentalMicrobiology.2005;71(9):5404-10.MicrobialCommunities[J].Science.2005;308(5721):55(eDNA)asadetectiontoolforat‐riskfreshwaterpearlymusselspecies(Bivalvia:Unionidae)[J].AquaticConse2018;28(3):545-58.2022;4(2):339-48.Japanesegiantsalamander(Andriasjaponicus)distributioninwesternJapanusingmulti-copynuclearDNAmarker[J].Limnology.2024;25(2):18quantificationofthe