T/CVMA176—2024貓支氣管敗血波氏菌感染診斷技術(shù)規(guī)范TechnicalspecificationfordiagnosisoffelineBordetellabronchiseticainfect2024-9-9發(fā)布2024-9-9實(shí)施中國(guó)獸醫(yī)協(xié)會(huì)發(fā)布I12規(guī)范性引用文件GB19489實(shí)驗(yàn)室生物安全通GB/T27401實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范NY/T541獸醫(yī)診斷樣品采集、保存與運(yùn)輸技術(shù)規(guī)范Bb：支氣管敗血波氏菌（BordetellaCt：每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)量達(dá)到設(shè)定閾值所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)（CDHL：膽硫乳瓊脂（DeoxychilateHydrogenSulfideLactoseAgaPCR：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PolymeraseC實(shí)時(shí)熒光PCR：實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Real-timepolymerasechain5.1流行病學(xué)25.1.2患病貓發(fā)病前生活環(huán)境發(fā)生改變，比如寄養(yǎng)、更換住處、運(yùn)輸、進(jìn)入多貓環(huán)境或去過醫(yī)院。5.2.1患病貓出現(xiàn)發(fā)熱、打噴嚏、眼睛分泌物增多、咳嗽等癥狀至少出現(xiàn)一種。5.2.2肺臟呼吸音增大、淋巴結(jié)腫大。5.2.3少數(shù)嚴(yán)重病例出現(xiàn)肺炎、呼吸困難及紫紺中的一種或者一種以上的癥狀。5.3結(jié)果判定6樣品采集、保存、運(yùn)輸及處理6.2.2用于核酸檢測(cè)的樣本，24h之），6.3.2用無菌接種環(huán)，取適量重懸PBS或氣管灌洗液直接劃線接種血瓊脂平3劃線接種的血瓊脂平皿和DHL瓊脂平皿置于37℃培養(yǎng)24h~48h。支氣管敗血波氏菌在血瓊脂平皿上形成1mm左右、灰白色、帶有輕微α溶血的菌落；DHL瓊脂4.4尿素試驗(yàn)陽(yáng)性：分離將涂片于空氣中自然晾干。待檢菌種符合7.4.1和中的任8支氣管敗血波氏菌的PCR檢測(cè)8.1.2高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)。8.1.3生物安全柜。5），），8.5.5加入兩倍體積的無水乙醇，上下8.5.6室溫干燥后，加入30μLRNase-free水取7.5步驟提取的細(xì)菌核酸，進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè)，PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)參數(shù)見附錄C.68.8.2陰性對(duì)照：PCR產(chǎn)物無核酸條帶。在實(shí)驗(yàn)有效的前提下，被檢樣品的PCR產(chǎn)物電泳后在1532bp位置出現(xiàn)特異性條帶，判定為支氣管9支氣管敗血波氏菌的熒光PCR檢測(cè)9.1儀器9.3支氣管敗血波氏菌DNA提取9.4.2加樣合的檢測(cè)通道讀取熒光信號(hào)值，淬滅基團(tuán)選擇none。推薦9.4.4結(jié)果判定確定閾值質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)7可疑8支氣管敗血波氏菌生化試驗(yàn)操作及結(jié)果判定見----+-+--加甲基紅試劑1~2滴，置35℃培養(yǎng)箱10~20min。-加6%甲萘酚酒精溶液2滴，顛倒生化管3~5次，加40%NaOH溶液1滴，顛倒生化管3~5次，置35℃培養(yǎng)箱--+TSA平板+直接用濾紙蘸取菌落，10~20s+硝酸鹽還原試劑甲、乙液混合均勻，加入1+9試劑配方B.1pH7.2，0.01mol/LP取1×PBS，用氫氧化鈉或鹽酸調(diào)pH至7.2，滅菌或過濾除菌，PBS一經(jīng)使用，稱量Tris24.2g，Na2EDTA·2H2O3.72g于1L燒杯中。向燒杯中加入約600mL無菌蒸餾水，充分?jǐn)嚪Q量Tris54.0g，EDTA2.9mg于1L燒杯中。加入硼酸27.5g，充分?jǐn)嚢瑁患訜o菌蒸餾水定容至1L后，室溫保存。使用時(shí)稀釋5倍即1×TBE。引物序列5’-3’注1：引物由生物公司合成，純度為HPLC級(jí)，用DEPC水溶解并稀釋至終濃度10μmol/L,-20℃保存?zhèn)渥?：擴(kuò)增目的片段為16S基因，長(zhǎng)度153體積(μL）2×Taq酶\DNA模板\2\7\11ForwardprimerReverseprimerProbeFAM-CGCTGCCGACAGATCAAATTTTGCC-BHQ2工作液終濃度(μmol/L）加樣體積(μL）1×Forwardprimer1Reverseprimer1Probe\2\\2min1E.1支氣管敗血波氏菌16S基因片段參考序5’-TGAACTGAAGAGTTTGATCCTGGCTCAGATTGAACGCTGGCGGGATGCTTTCGGACGGCAGCACGGGCTTCGGCCTGGTGGCGAGTGGCGAACGGGTGAGTAATGGTGCCCAGTAGCGGGGGATAACTACGCGAAAGCGTGGCTAATACCGCATACGCCCAAGCGGGGGACCTTCGGGCCTCGCACTATTGGAGCGGCCGATATCGGATTAGCTAGTAACGGCCTACCAAGGCGACGATCCGTAGCTGGTTTGAGAGGACGACCAGCGCGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATTTTGGACAATGGGATCCAGCCATCCCGCGTGTGCGATGAAGGCCTTCGGGTTGGAAAGCACTTTAACGGCACGGGCTAATATCCTGTGCAACTGACGGTACCTGCAGAATAAGCACCGGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGCAGGCGGTTCGGAAAGAAAGATGTGAAATCCCAGGGCTTAACCTTGGAACTGCATTACCGGGCTGGAGTGTGTCAGAGGGAGGTGGAATTCCGCGTTTAGCAGTGAAATGCGTACGGAGGAACACCGATGGCGAAGGCAGCCTCCTGGGATAACACTGACGCTCATGGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCCTAAACGATGTCAACTAGCGGCCTTCGGGCCTTGGTAGCGCAGCTAACGCGTGAAGTTGACCGCCTGGGGAGGATTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGACCCGCACAAGCGGTGGATGATGTGGATTGCAACGCGAAAAACCTTACCTACCCTTGACATGTCTGGAATCCCGAAGAGATTCAAGAGAACCGGAACACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCATTAGTTGCTACGAAAGGGCACTCTAATGAGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCCTCATGGCCCTTATGGCACGTCATACAATGGTCGGGACAGAGGGTCGCCAACCCGCGAGGGGGAGCCAATCCGATCGTAGTCCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTCGCTGAAGTCGGAATCGCATCAGCATGTCGCGGTGAATACGTTCCCGGGTCTTGTACACACCGCCCGTCACACGGTTTTACCAGAAGTAGTTAGCCTAACCGCAAGGGGGGCGATTACCACGGTAGGATTCE.2支氣管敗血波氏菌外膜蛋白基因參考序列（GenBankAccessionNo.KY25’-TTGCCTGTAGGGAATCCAGCTGAACCAAGTTTATTAATCGATGGCACTATGTGGGAAGGATCCTTGTGATCCTTGTGCTACTTGGTGTGATGCTATCAGCATCCGTGCAGGATTCTACGGAGATTATGTTTTCGATCGTATATTAAAAGTTGATGTTAATAAAACCATCAGCGGAATGGCTGCGGCTCCAACAGCAGCTTCTGGAACTGCAAGCAACACCACTGTCGCTGCCGACAGATCAAATTTTGCCTACGGCAAACATCTTCAAGATGCCGAATGGTGCACCAATGCTGCTTACTTAGCATTAAATATTTGGGATCGTTTTGATGTTTTCTGCACGCTAGGAGCGTCTAATGGTTACTTCAAAGCAAGTTCTGATGCATTT