ICS71.100.70CCSY42團體標準T/ZHCA032—2024駐留類化妝品溫和性評價重建表皮模型組織活力法Evaluationformildnessofleave-oncosmeticproducts—Tissueviabilitymethodofreconstructedepidermalmodel2024-01-15發布2024-04-15實施浙江省健康產品化妝品行業協會ⅠT/ZHCA032—2024本文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導則第1部分:標準化文件的結構和起草規則》的規定起草。請注意本文件的某些內容可能涉及專利。本文件的發布機構不承擔識別專利的責任。本文件由浙江省食品藥品檢驗研究院提出。本文件由浙江省健康產品化妝品行業協會(ZHCA)歸口。本文件起草單位:浙江省食品藥品檢驗研究院、廣東博溪生物科技有限公司、珀萊雅化妝品股份有限公司、杭州捷諾飛生物科技有限公司、上海家化聯合股份有限公司。1T/ZHCA032—2024駐留類化妝品溫和性評價重建表皮模型組織活力法1范圍本文件描述了采用重建表皮模型對駐留類化妝品溫和性功效的評價方法。本文件適用于駐留類化妝品溫和性功效的評價。2規范性引用文件下列文件中的內容通過文中的規范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中,注日期的引用文件,僅該日期對應的版本適用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB/T6682分析實驗室用水規格和試驗方法3術語和定義下列術語和定義適用于本文件。駐留類化妝品leave-oncosmeticproduct除淋洗類化妝品外的化妝品。3.2溫和性mildness經過安全評估的受試物在正常、合理及可預見的使用條件下,未引起皮膚異常反應的特性。3.3重建表皮模型reconstructedepidermalmodel分離人包皮表皮細胞作為種子細胞,經過體外培養,制備成與人表皮組織具有相似結構及功能的三維組織模型。4試驗原理將經安全性評價為無刺激性的受試樣品均勻涂抹在重建表皮模型上,經過比刺激性測試更長的暴露時間或更高暴露量后,根據模型細胞的存活率,評價受試樣品的溫和性。5試劑和材料除非另有說明,本方法所用試劑均為分析純,水為GB/T6682規定的三級水。5.1聚乙二醇單-4-辛基苯基醚(TritonX-100)。5.2十二烷基硫酸鈉(SDS)。5.3異丙醇。2T/ZHCA032—20245.4噻唑藍(MTT)。5.5磷酸鹽緩沖液(DPBS):pH7.0~7.3,不含鈣、鎂離子。5.61.0%TritonX-100溶液:吸取TritonX-100(5.1)10μL,溶于990μL水中,配制成體積分數為1.0%的TritonX-100溶液。5.70.1%SDS溶液:稱取SDS(5.2)10mg,溶于10mL水中,配制成質量分數為0.1%的SDS溶液。5.8MTT溶液:稱取噻唑藍(5.4)20mg,溶于20.0mLDPBS(5.5)中,配制成質量濃度為1mg/mL的MTT溶液,臨用現配。5.9重建表皮模型試劑盒:EpiKutisRHE模型及其培養液或其他經驗證的等效模型及其培養液。接收時模型與培養基接觸界面不應有明顯氣泡或固體培養基變色情況(如黑紫色)。5.10死亡組織模型:將重建表皮模型置于-20℃環境下冷凍24h以上。6儀器設備6.1天平:分度值為0.0001g。6.2二氧化碳培養箱:37℃±1℃、CO2體積分數范圍為(5±1)%、相對濕度≥95%。6.3超凈工作臺或生物安全柜。6.4外置活塞式移液器:最大量程為50μL、100μL、200μL。6.5連續分液器:最大量程為25mL。6.6計時器。6.7微孔板振蕩器。6.8酶標儀:配570nm波長濾光片。7測試方法7.1MTT干擾因素排查7.1.1當受試樣品與MTT有反應時:取MTT溶液1.0mL,加入受試樣品液體80μL,分別在0h、1h、2h和3h時觀察樣品周邊溶液顏色變化情況。當溶液顏色變成藍紫色,應增加死亡組織模型組。7.1.2當受試樣品有顏色時:取受試樣品80μL,加入2mL異丙醇中,受試樣品不溶于異丙醇,無須增加死亡組織模型對照組;受試樣品溶于異丙醇,在570nm波長處測定吸光度(OD570),若OD570≥0.15,應增加死亡組織模型組。7.2測試步驟7.2.1重建表皮模型復蘇在超凈工作臺或生物安全柜中將合格的模型轉移至含0.9mL培養液的無菌6孔培養板,放入二氧化碳培養箱培養1h。更換全部培養液,放入二氧化碳培養箱培養過夜。模型底部與培養液間不應出現氣泡。7.2.2試驗分組和加樣試驗分為陰性對照組(水)、陽性對照組(1.0%TritonX-100溶液或0.1%SDS溶液)和受試樣品組,當出現7.1中的情況時,增加死亡組織模型陰性對照組和死亡組織模型受試樣品組,每組平行使用3個模型。加樣前更換全部培養液,采用外置活塞式移液器吸取受試樣品80μL均勻涂抹在模型表面,放入二氧化碳培養箱暴露24h。3T/ZHCA032—20247.2.3沖洗暴露結束后,采用連續分液器吸取25mLDPBS將模型逐個進行沖洗,每次2mL,未沖洗干凈應增加沖洗次數直至沖洗干凈,吸干殘余的DPBS。7.2.4甲瓚提取將模型轉移至含300μLMTT溶液的24孔培養板中,模型底部與MTT溶液間不應出現氣泡。放入二氧化碳培養箱中培養3h后,轉移至新的24孔培養板中,每孔加入2mL異丙醇,用封口膜密封培養板間隙。室溫條件下將培養板固定在微孔板振蕩器上振搖2h提取甲瓚,或在4℃條件下提取過夜。7.2.5OD570的測定提取結束后,用移液器吸頭戳破模型,將模型內外提取液混合均勻,并轉移至96孔培養板中,每個組織模型取2個復孔,200μL/孔。用異丙醇作為溶劑對照,取6個復孔,在570nm波長處讀取吸光度(OD570),計算組織的存活率。7.2.6數據處理與統計分析無死亡組織模型對照組的存活率按式(1)計算。存活率×100%…………式中:A—受試樣品的OD570;B—溶劑對照(異丙醇)的OD570平均值;C—陰性對照的OD570。有死亡組織模型對照組的存活率按式(2)計算。存活率×100%…………式中:A—受試樣品的OD570;B—溶劑對照(異丙醇)的OD570平均值;C—陰性對照的OD570;D—受試樣品死亡組織的OD570;E—陰性對照死亡組織的OD570。8結果判定8.1試驗成立條件8.1.1陰性對照組的OD570范圍為1.0~2.5。8.1.2陽性對照組的存活率<15%。8.1.3同一樣品復孔間SD<18%。8.2結果評價8.2.1溫和性:存活率≥50%。8.2.2不判定:存活率<50%,需結合其他試驗進一步確認。4T/ZHCA032—20249試驗報告試驗報告至少應給出以下幾個方面的內容:a)檢驗依據;b)樣品和陽性對照組的信息,包括與試驗操作相關的理化性狀;c)重建表皮模型來源、質檢報告等相關信息;d)試驗條件和方法,包括試驗具體步驟;e)數據處理與結果評價方法;f)試驗的日期;g)結論;h)檢驗者、校核者和技術負責人簽字,以及檢驗單位公章或檢驗專用章。5T/ZHCA032