第六章環境中微生物檢測第1頁

微生物因為體積小、質量輕、適應性強等特點，在自然界中分布很廣。但環境條件不一樣，微生物種類和數量也不一樣。第2頁第一節土壤中微生物一、土壤是微生物生活良好環境土壤中生態環境條件——營養（有機質豐富）、水分（有一定含量）、空氣（含氧氣）、酸堿度（pH5.5~5.8，適宜）、滲透壓（0.3~0.6MPa，等滲或低滲環境）、溫度條件（較恒定）和表面保護層。故土壤是微生物大本營，也是人類最豐富“菌種資源庫”。第3頁二、土壤中常見微生物類群土壤中微生物主要種類有：細菌（占70～90％）108放線菌107絲狀菌106酵母菌105藻類104原生動物103第4頁三、土壤中微生物數量與分布不一樣類型土壤中微生物種類和數量是不相同。調查結果表明，有機質含量豐富黑土、草甸土、磷質石灰土等微生物數量多；栗鈣土、鹽堿土、紅壤土、磚紅壤土微生物數量較少。（見表1）不一樣土層深度土壤中微生物數量和種類也不一樣。普通土壤表層微生物數量最多，伴隨土層加深，微生物數量逐步降低。第5頁表1我國各主要土壤含菌量(萬/克干土)土類 地點 細菌 放線菌 真菌暗棕壤 黑龍江呼瑪 2,327 612 13棕壤 遼寧沈陽 1,284 39 36黃棕壤 江蘇南京 1,406 271 6紅壤 浙江杭州 1,103 123 4磚紅壤 廣東徐聞 507 39 11磷質石灰土西沙群島 2,229 1,105 15黑土 黑龍江哈爾濱 2,111 1,024 19黑鈣土 黑龍江安達 1,074 319 2棕鈣土 寧夏寧武140114草甸土 黑龍江亞溝 7,863 29 23嶁土 陜西武功 951 1,032 4白漿土 吉林皎河 1,598 55 3濱海鹽土 江蘇連云港 466 41 0.4第6頁1、取土樣選定取樣點，按對角交叉（五點法）取樣。先除去表層約2cm土壤，將鏟子插入土中數次，然后取2～10cm處土壤。盛土容器應是無菌。將5點樣品約1kg充分混勻，除去碎石、植物殘根等。土樣取回后應盡快投入試驗，同時取10-15g，稱重后經105oC烘干8h，置于干燥器中冷卻后再次稱重，計算含水量。四、土壤微生物分離和計數第7頁2、倒平板熔化已滅菌上述4種培養基并冷卻至45oC左右倒平板，凝固待用，每種培養基每個稀釋度各三只平板。第8頁3、編號取5支無菌空試管（15×150mm）依次編號為10-3、10-4、10-5、10-6、10-7。4、分裝無菌水按無菌操作用5mL移液管分別吸收4.5mL無菌水于編號各無菌空試管中。第9頁5.制備土壤稀釋液稱土樣1g于盛有99mL無菌水或無菌生理鹽水并裝有玻璃珠三角瓶中，振蕩10～20min，使土樣中菌體、芽孢或孢子均勻分散，此即為10-2濃度菌懸液。用無菌移液管吸收懸液0.5mL于4.5mL無菌水試管中，用移液管吹吸三次、搖勻，此即為10-3濃度。一樣方法，依次稀釋到10-7。稀釋過程需在無菌室或無菌操作條件下進行，整個稀釋過程如圖。第10頁第11頁6、混菌法接種細菌分離分別準確吸收10-7，10-6，10-5三個稀釋度菌液1mL；放線菌分離分別吸收10-5，10-4，10-3三個稀釋度菌液1mL；霉菌分離分別吸收10-4，10-3，10-2三個稀釋度菌液1mL；酵母菌分離分別吸收10-6，10-5，10-4三個稀釋度菌液1mL，對號加在已凝固平板上，同時做空白對照，空白對照只加培養基，不接種菌液。7.培養將涂布后平板上倒置于恒溫箱中，細菌在37oC下培養24～48h，霉菌在28oC下培養3～5d，放線菌在28oC下培養5～7d，酵母菌30oC下培養2～3d,觀察結果。第12頁8.計數選菌落分散、菌落數適量且各平行皿菌落數靠近稀釋度平皿計數，通常細菌和放線菌選取菌落數在30～300之間平皿，霉菌選菌落數在10～100之間平皿，最終換算成每克干土所含菌數。同一稀釋度平均菌落數×稀釋倍數每克干土含菌數=1－土壤含水量％第13頁第二節水體中微生物一、水體是微生物天然生境不論是海水還是淡水水體中，都有著微生物生長所必需營養，有如土壤所具備條件。

第14頁二、水體中微生物數量和分布1.污染淡水處于城鎮等人口聚集地域湖泊、河流等淡水。108~109個/mL水主要是一些能分解各種有機物腐生菌，如芽孢桿菌、生孢梭菌、變形桿菌、大腸桿菌、糞鏈球菌等。有甚至還含有傷寒、痢疾、霍亂、肝炎等人類病原菌。第15頁2.清潔淡水（1）溪流及貧營養湖10~100個/mL水以自養型種類為主。常見細菌有綠硫細菌、紫色細菌、藍細菌、柄細菌、赭色纖發菌、球衣菌和螢光假單胞菌等。另外，還有許多藻類（如綠藻、硅藻等）、原生動物（如鐘蟲及其它固著型纖毛蟲、變形蟲、鞭毛蟲等）和后生動物（如枝角類、橈足類等）。（2）地下水、自流井、山泉及溫泉有機物和微生物都極少石油巖石地下水含分解烴細菌，含鐵泉水有鐵細菌，含硫溫泉有硫磺細菌。第16頁3.影響微生物在淡水水體中分布原因水體類型、污染程度、有機物含量、溶解氧量、水溫、pH及水深等。4.海水除了一些從河水、雨水及污水等帶來暫時種類外，絕大多數是耐鹽、嗜冷、耐高滲透壓和耐高靜水壓力種類。海水中常見微生物有假單胞菌屬、弧菌屬、黃色桿菌屬、無色桿菌屬及芽孢桿菌屬等。普通在港口，每毫升海水含菌量為1×105個，在外海每毫升含菌為10~250個。

第17頁

江、河、湖泊、池塘等水體中有機物含量比較多，微生物種類數量也比較多。微生物在水體中表現為水平分布和垂直分布規律。另外，相同水域不一樣時期微生物含量及分布也不一樣。

第18頁生活飲用水細菌衛生標準是：細菌總數﹤100個/mL，大腸菌群值﹤3個/L。第19頁（一）細菌總數測定菌落總數——需氧情況下，37℃培養48h，能在普通營養瓊脂平板上生長細菌菌落總數.作用：判定食品被細菌污染程度及衛生質量優劣，對被檢樣品做出適當衛生學評價。基本操作普通包含：樣品稀釋－－傾注平皿－－培養48小時－－計數匯報。

三、水細菌學檢測第20頁1、樣品處理和稀釋

操作要求：“無菌操作”落實一直。充分振搖或研磨25g或25ml檢樣225mL稀釋液含有玻璃珠滅菌玻璃瓶或乳缽1：10稀釋液。1ml1ml1ml9ml稀釋液1：1009ml稀釋液1：10009ml稀釋液1：10000第21頁降低誤差：每遞增稀釋一次即換用1支1ml滅菌吸管，將吸管內液體沿管壁流入，勿使吸管尖端伸入稀釋液內，而且稀釋液應充分振搖。環境要求：瓊脂平板在工作臺暴露15分鐘，每個平板不得超出15個菌落。

代表性：取固體樣品時需多采幾個部位，且經過均質或研磨；液體樣品須經過振搖，以取得均勻稀釋液。

第22頁2、稀釋樣品取樣和傾注平皿

每個稀釋度做兩個平皿將涼至46℃營養瓊脂培養基注入平皿約15ml，并轉動平皿，混合均勻。1.取樣傾注平皿1：10稀釋液225mL無菌水1mL1mL9mL稀釋液1：1009mL稀釋液1：10001mL1mL1mL1mL1mL1mL1mL1ml無菌水25g或25ml檢樣第23頁3、培養及計數培養條件：倒置于36±1℃溫箱內培養48±2h計數時間：抵達要求培養時間，應馬上計數。假如不能馬上計數，應將平板放置于0－4℃，但不得超出24h。菌落總數匯報方式

計平皿中菌落數：肉眼觀察，必要時用放大鏡檢驗。記下各平板菌落總數，求出同稀釋度各平板平均菌落數。規律：不一樣稀釋度菌落數應與稀釋倍數成反比（同一稀釋度二個平板菌落數應基本靠近），即稀釋倍數愈高菌落數愈少，稀釋倍數愈低菌落數愈多。如出現逆反現象，則應視為檢驗中差錯（有食品有時可能出現逆反現象，如酸性飲料等），不應作為檢樣計數匯報依據。第24頁

當計數平板內菌落數過多（即全部稀釋度均大于300時），但分布很均勻，可取平板二分之一或1/4計數。再乘以對應稀釋倍數作為該平板菌落數。

當平板上有鏈狀菌落生長時，如呈鏈狀生長菌落之間無任何顯著界限，則應作為一個菌落計，如存在有幾條不一樣起源鏈，則每條鏈均應按一個菌落計算，不要把鏈上生長每一個菌落分開計數。如有片狀菌落生長，該平板普通不宜采取，如片狀菌落不到平板二分之一，而另二分之一又分布均勻，則能夠半個平板菌落數乘2代表全平板菌落數。

第25頁菌落總數匯報方式

計數標準：選平均菌落數在30~300之間者進行計算2.若有2個稀釋度平均菌落數在30~300之間時，則按二者菌落總數之比來決定，若比值小于2應匯報二者平均數；若大于2則匯報其中較小菌落總數。3.若全部稀釋度平均菌落數均大于300，以稀釋度最高平均菌落數乘以稀釋倍數匯報之。4.若全部稀釋度平均菌落數均小于30，則應按稀釋度最低平均菌落數乘以稀釋倍數匯報之。5.若全部稀釋度平均菌落數均不在30~300之間，則以最靠近300或30平均菌落數乘以稀釋倍數匯報之。6.若全部菌落數勻為“無法計數”時，應注明水樣最大稀釋倍數。7.在求同稀釋度平均數時，若其中1個平板上有較大片狀菌落生長時，則不宜采取，而應以無片狀菌落生長平板作為該稀釋度平均菌落數。若片狀菌落約為平板二分之一，而另二分之一平板上菌落分布很均勻，則可按半平板上菌落計數，然后乘以2作為整個平板菌落數。1.僅1個稀釋度平均菌落數在此范圍時，則以該平均菌落數乘其稀釋倍數報告之。第26頁匯報標準菌落總數匯報方式

例次不一樣稀釋度平均菌落數兩個稀釋度菌落數之比菌落數(個/mL)匯報方式(個/mL)10-110-210-31136516420—1640016000或1.6×10422760295461.63775038000或3.8×10432890271602.22710027000或2.7×1044無法計數4650513—513000510000或5.1×105527115—270270或2.7×1026無法計數30512—3050031000或3.1×1047無法計數10-3無法計數第27頁4、菌落總數匯報方式

菌落數匯報，按國家標準方法要求菌落數在1~100時，按實有數字匯報，如大于100時，則匯報前面兩位有效數字，第三位數按四舍五入計算。為了縮短數字后面零位，可用10指數來表示。

固體檢樣以克（g)為單位匯報，液體檢樣以毫升（mL）為單位匯報，表面涂擦則以平方厘米（cm2）匯報。第28頁作業：對某一自選食品進行微生物學檢驗設計。關鍵點：1.食品相關統計（名稱、廠家、商店等）2.所用物品起清單（設備及易耗品等）3.工作計劃（人員安排、進度計劃等）4.匯報格式（表格設計及匯報高書等）第29頁(二)大腸菌群測定

——國家標準采取三步法

1、檢驗查表方法

大腸菌群——需氧及兼性厭氧、在37℃能分解乳糖產酸產氣革蘭氏陰性無芽胞桿菌。

乳糖發酵試驗分離培養證實試驗樣品稀釋后，選擇三個稀釋度，每個稀釋度接種三管乳糖膽鹽發酵管。36±1℃培養48±2h，觀察是否產氣。將產氣發酵管培養物轉種于伊紅美藍瓊脂平板上，36±1℃培養18-24h，觀察菌落形態。挑取平板上可疑菌落，進行革蘭氏染色觀察。同時接種乳糖發酵管36±1℃培養24±2h，觀察產氣情況。

依據證實為大腸桿菌陽性管數，查MPN表，匯報每100ml（g）大腸菌群MPN值。

第30頁較清潔樣品三步法圖示

100mL50mL三倍濃縮乳糖蛋白胨培養液100mL5mL5mL5mL5mL5mL5mL5mL5mL5mL5mL水樣10mL10mL10mL10mL10mL10mL10mL10mL10mL10mL第31頁三步法圖示

取產酸產氣發酵管中培養液在伊紅美蘭平板上進行劃線取有關鍵和帶金屬光澤深紫色菌落進行革蘭氏染色乳糖蛋白胨培養液鏡檢（革蘭氏陰性菌）37℃培養48h證實產氣（陽性）結果是否37℃培養24h37℃培養24h

第32頁大腸菌群測定

2、計算方法

挑選菌落特征：黑紫色、有光澤或無光澤菌落；紅色、粉紅色菌落。抑制劑：膽鹽、煌綠、十二烷基硫酸鈉。

為陰性結果水樣體積（mL）×全部水樣體積（mL）

MPN＝

1000×為陽性結果發酵管（瓶）數目

產酸判斷：紫色培養液變成黃色產氣判斷：發酵導管內有小氣泡，如輕輕打動試管有氣泡沿管壁上浮，應考慮可能有氣體產生，需深入試驗。第33頁美國FDA標準方法——行業標準采取兩步法：用于對出口食品中大腸菌群進行檢驗

推測試驗證實試驗樣品稀釋后，選擇三個稀釋度，每個稀釋度接種三管LST肉湯發酵管。36±1℃培養48±2h，觀察是否產氣。

將產氣發酵管培養物轉種于煌綠乳糖膽鹽（BGLB）肉湯中，36±1℃培養48±2h，觀察是否產氣。以BGLB產氣為陽性，查MPN表，匯報每ml（g）樣品中大腸菌群MPN值。

第34頁練習：如對一自來水廠出水進行檢驗，初發酵普通在10支小發酵管和兩支大發酵瓶內進行，復發酵在5支小發酵管內進行。以300mL進行初發酵試驗，其中100mL水樣2份（分狀于2個大發酵瓶中），10mL水樣10份，（分狀于10支個小發酵管中）。試驗結果：100mL2份水樣為陰性結果，無大腸桿菌存在；10mL水樣中有5份為陽性結果，存在大腸桿菌。則：MPN=?第35頁第三節空氣中微生物

空氣