尼帕病毒病檢疫技術規范48.3.3水平搖床。8.4病料處理8.4.1將采集的病料選取具有典型病變0.5cmx0.5cmx0.3cm大小的組織，浸入10倍體積固定液固定，7d后更換固定液，再維持一周。8.4.2將選取好的組織塊放入新配的固定液中固定7d,其間更換固定液三次，并在水平搖床上不斷搖蕩，以提高固定液的滲透力。8.4.3將固定好的組織塊放入流水中漂洗24h。8.4.4放入下列不同濃度的酒精中脫水：8.4.5放入二甲苯中透明：8.4.6浸蠟：軟蠟中放置2h;硬蠟中放置4h。8.4.7將浸好蜻的組織塊放入包埋框中用硬蠟包埋，4℃冷卻過夜。8.4.8將石蠟塊切成5μm厚的切片，用干凈的載玻片貼片。8.5操作方法8.5.1脫蠟：依次將切片放入二甲苯-二甲苯-二甲苯各1min,無水乙醇-無水乙醇-70%乙醇各5min,然后用流水沖洗。8.5.2將切片置于蒸餾水中漂洗、然后浸入包含0.1%(質量濃度)胰蛋白酶的0.01molL氯化鈣(用0.1molL的氫氧化鈉調pH值至7.8)中，37℃放置20min,用蒸餾水沖洗。8.5.3將切片放入濕盒內用PBS漂洗5min。洗完后用吸承紙吸干組織塊周圍的液體，每張切片上滴加200μL3%的H?O?溶液，室溫放置20mm,然后倒掉H?O,放入PBS中漂洗5min。8.5.4洗完后用吸水紙吸干組織塊周國的液體，向切片上滴加200pL適當稀釋的兔抗尼帕病毒抗體(用包含0.1%脫脂奶粉的PBS稀釋，每份樣品和對照均要設立平行試驗),將切片封好置于37℃孵8.5.5將切片放入PBS中綜洗5min。洗完后用吸水紙吸干組織塊周圍的液體，滴加2-3滴羊抗兔降標二抗，37℃孵育20m8.5.6將切片放入PBS中漂洗5min,洗完后用吸水紙吸干組織塊周圍的液體，滴加顯色液，在顯微鏡下觀察染色程度。陽性對照切片染色充分后(通常2min~5min),用蒸餾水漂洗終止反應。8.5.7將切片用PBS漂洗5min,洗完后用吸水紙吸干組織塊周圍的液體，放入蘇木素中復染1min~3min,用蒸餾水沖洗，加入Scot's溶液，流水沖洗。蒸餾水漂洗切片，用中性封片劑封片。8.5.8顯微鏡觀察。8.6結果判定如果鏡檢切片顯示細胞質可見褐色/紅色顆粒狀著色點，細胞核呈藍色，則判定為NiV陽性。9微量血清中和試驗9.1主要試劑9.1.1細胞培養液(見附錄A.3)。9.1.2細胞維持液(見附錄A.3)。9.1.3細胞消化液(見附錄A.2)。69.3.2.4蓋上培養板，輕輕搖勻，置5%二氧化碳培養箱于37℃孵育1h。9.3.2.5取出培養板，每孔加100μLVem細胞，細胞濃度為2.4×107100μL。置5%二氧化碳培養箱37℃培養，48h用倒置顯微鏡進行初步判定，72h后最終判定結果。9.4.1檢查各種對照試驗，細胞對照正常，無CPE;陰性血清對照出現明顯的CPE,表現為多個細胞發生融合，形成合胞體，最后細胞脫落、裂解；陽性血清對照無CPE,細胞不出現病變。病毒滴度驗證，當實際使用病毒量在30-300TCID。范圍內，說明病毒稀釋濃度符合微量血清中和試驗的工作濃度。被檢血清對照孔不出現病變，說明被檢血清無毒性反應。9.4.2在各種對照成立的情況下，檢查各個被檢血清的CPE。如果出現CPE,則判為陰性孔；如果不出現CPE,則判為陽性孔。以完全中和病毒感染性(即不出現CPE)的最大稀釋度為該血清的中和10.1主要試劑10.1.1磷酸鹽緩沖液(PBS)(見附錄C.1)。10.1.2病毒抗原(參見附錄D.1)。10.1.3細胞對照抗原(參見附錄D.2)。10.1.4封閉液(見附錄C3)。10.1.5洗滌液(見附錄C.2)。10.1.6底物溶液(見附錄C.4)。10.1.9陽性血清、弱陽性血清和陰性血10.3.1將病毒抗原和細胞對照抗原用PBS1:1000俗釋，將稀釋后的抗原加入96孔板中，1、3、5、7、9和11孔加病毒抗原。2、4、6、8、10和12孔滴加細胞對照抗原。置于37℃振蕩培養1h或410.3.2倒掉孔內液體，在吸水紙上吸干，每孔加滿洗滌液(PBS-T),靜置1min-2min后倒掉，吸10.3.3加人封閉液，每孔100μL,置37℃振蕩孵育30min。10.3.4用PBS-T洗板三次(同上)。10.3.5按照10.2.3每孔加入100μL準備好的待檢血清，各緩沖液對照孔加人100μLPBS(含5%雞血清和5%脫脂奶粉),置37℃靜止1h。10.3.6用PBS-T洗板三次(同上)。10.3.7用含1%脫脂奶粉的PBS-T稀釋酶標抗體?；靹蚝蟪孜飳φ湛淄饷靠准尤?00μL,底物對照孔加人100L含1%脫脂奶粉的PBS-T,置37℃靜止1h。11.1.61.5%的瓊脂糖凝膠(見附錄E4)。5'-TCAGYATGTATATGAAAGATAAA5TCATCYTTAACCAT5°=TCATCYTTAACCA811.2.1PCR擴增儀。11.2.2高速臺式冷凍離心機：最大離心力12000g以上。11.2.3生物安全柜。11.2.5水浴鍋。11.2.6微量移液器。11.2.7組織研磨器。11.2.8電泳儀和電泳槽。11.2.9紫外凝膠成像儀。11.3操作方法11.3.1核酸提取RNA提取應在樣品制備區，根據樣本的種類選擇合適的生物安全級別的實驗室進行操作。應保證無細菌及核酸污染，實驗材料和容器應經過消毒處理并一次性使用。提取TFR時應避免RNA酶污染。同時設立陽性對照和陰性對照。用Trizol提取核酸RNA的操作步驟如下(樣品以組織研磨上清液為例a)在無RNA酶的15mL離心管中加入200μL上清液，后加人1mLTriml,震蕩20s,室溫靜置b)加入200μL氧仿，顛倒混勻，室溫靜置10mmns12000/min離心15min。c)管內液體分為三層，取500μL上清液于離心管中，加入500μL預冷(-20℃)的異丙醇，顛倒混勻，靜置10min。12000rmin離心15mim沉淀RNA.棄去所有液體(離心管在吸水紙上控干)。d)加入700μL預冷(-20℃)的75%乙醇洗滌，顛倒混勻(2-3)次。12000r/min離心10min。e)調水浴至60℃。室溫下干程10ain。f)加入40μL無核酸酶水(DEPe水)。60℃金屬浴中作用10min,充分融解RNA.-70℃保存或立即使用。核酸提取也可以使用毒效的商品化病毒RNA試劑盒或自動化核酸提取儀。擴增體系為25pL.依次加人以下成分：11μLddH?0,5μL5×0meStepRT-PCRBuffer,1μLOneStepRT-PCREnzymeMix,1μLdNTPMix(10mmolLcach),1μL引物ET(10μmol/L),1μL物LREV(10μmol/L),5μL模板。擴增反應條件：48°C、30min;95℃、15min:94°℃、30s.42C、30s,68℃、Imin,共30個循環；68°℃延伸5min。LFWD2(10μmol/L),IμL引物LREV(10μmolL),2μL首次RT-PCR反應產物。擴增反應條件：95℃、5min;94℃、30s,46℃、30s,72℃、30s,共30個循環；72℃延伸11.3.4PCR產物的電泳取PCR產物5μL在1.5%瓊脂糖凝膠中進行電泳，凝膠成像系統中觀察結果。911.3.5結果判定當陰性對照和空白對照首次RT-PCR反應和半套式PCR中均未擴增出DNA片段，陽性對照首次RT-PCR反應擴增出現了364bp片段、半套式PCR擴增出266bp片段時，試驗成立。當待檢樣品首次RT-PCR反應擴增出現了364bp片段或半套式PCR擴增出266bp片段，可判為NiV核酸陽性。確證可對PCR產物進行測序，參考序列見附錄F。當待檢樣品無擴增片段或條帶大小不是364bp或266bp時，均判為NiV核酸PCR陰性。12實時反轉錄聚合酶鏈式反應12.1主要試劑12.1.1RNA提取試劑盒。12.12一步法熒光RT-PCR試劑盒(或其他等效熒光RT-PCR試劑)。12.1.3無核酸酶水(DEPC水)(見附錄E.12.1.4引物探針見表2。表2引物探針5"-GGT-ATG-ART-GTT-TIT-TGT-TTT-GGT-T5°-CCC-CIT-TTG-YGA-ATT-C5"-FAM-ATC-AAA-ACA-GAG-ATG-CGA-GC-M12.1.5陽性對照、陰性對照和空白對照，同11.1.8。122儀器設備12.2.1實時熒光PCF擴增僅。12.2.2高速臺式冷深離心機：最大離心力12000g以上。12.2.3生物安全柜。12.2.6微量移液器。12.2.7組織研磨器。12.3操作方法123.1核酸提取同11.3.1。12.3.2反應體系的配置擴增體系為25μL,依次加入以下成分：2×RT-PCR反應液12.5μL,RT-PCR酶混合液0.25μL,NiVL11908F(20μmol/L)1.25μL,NiVL11962R(20μmol/L)1.25μ1.25μL,模板5μL,用ddH?O補足每次進行實時熒光PCR擴增時均設陽性、陰性及空白對照。5FAM-TCCCAGGATTCTTCGCAACCATCA521探針(10μmnlL)一2ddH?O(無菌水)一7一1分鐘1注：不同數字RT-PCR試劑和儀器可根據說明書對除退火根據數字PCR結果中陰性分割體系的終點熒光值設定熒光的閾值限。閾值限需要對陰性和陽性擴增結果進行明顯的區分。根據公式(3)計算回收率：式中：B(%)——回收率，即PC物質的回收率。Cm—PC物質的濃度，即稀釋后的RNA模板中PC物質檢測目的片段的拷貝濃度，由PC物質的數字PCR檢測值乘以數字PCR反應體系的體積后，除以數字PCR反應體系中RNA模板的體積計算得出，單位為拷貝每微升。A—RNA模板的稀釋倍數。V?——提取后的RNA模板的體積，單位為微升。C?！砑拥綐悠分械腜C物質的原始濃度，單位為拷貝每微升。V?—濰加到樣品中的PC物質的體積，單位為升。每個反應孔的有效微小體系總數量不低于數字PCR系統理論數的60%;陽性對照或陽性樣品的陽性微小體系數量低于總體系數量的80%。陰性對照組和空白對照組內均沒有任何擴增現象；PC對照的回收率>1%。有一項不符合則實驗重斯進行。本文件數字PCR法所能達到的檢測限：NiV750拷貝/g(組織)。本文件數字PCR法所能達到的定量限：NiV100拷貝每個樣品設置3組平行反應，若樣品反應孔無特異性熒光信號，則認為待測樣品中不含有NiV,若樣品反應孔有明顯特異性熒光信號，則按公式(4)計算相對標準偏差：式中：X?,X?,X?——分別為三個平行組的檢測值。X——三個平行組的平均檢測值。三個平行檢測值的相對標準偏差(RSD)≤25%時，其平均值乘以數字P…病毒分離和微量血清中和試驗培養基和試劑的配制A.1抗生素貯存液用滅菌三蒸水配成每毫升含100001U青霉素和10mg鏈霉素的抗生素貯存液，用微孔濾膜(0.22μm)過濾除菌，分裝成2mL/瓶，-20℃凍存備用。保存期不超過60天。A2細胞消化液(0.02%EDTA)EDTA(乙二胺四乙酸二鈉)氯化鈉氯化鉀磷酸氫二鈉磷酸二氫鉀加三蒸水至1000mL,充分溶解，分裝成小瓶，115℃高壓災菌10mm,4℃冷藏備用。保存期不A.3細胞培養液和細胞雄持液滅能的無菌胎牛血清(FBS):56930min滅能的無菌胎牛血清。細胞培養液：含10%滅能的無菌胎牛血清(FBS)的EMEM培養基。細胞維持液：含2%滅能的無菌胎牛血清(FBS)的EMEM培養基。細胞培養液和細胞維持液均用微孔濾膜(0.22μm)過濾除菌，分裝成小瓶，4℃保存備用。保存期不超過60天。使用加1%抗生素貯存液(終濃度為每毫升EMEM培養基含100U和100μg)。并用7.5%碳酸氫鈉溶液調盒值至7.0-7.2。(規范性)酶聯免疫吸附試驗抗原制備與樣品前處理D.1病毒抗原制備D.1.1在滾瓶中培養Vero細胞直至合流，每瓶保留5mL培養液，其余倒掉。在P4實驗室條件下將NiV病毒接種到Vemo細胞。D.1.233℃旋轉滾瓶30min以吸附病毒。然后每瓶加60mL細胞培養液。33℃繼續旋轉48h。D.1.3用預冷的0.01mol/LPBS洗滌病毒感染的細胞一次，每瓶刮取細胞，收集到5mL~10mL預冷的D.1.4將收集的細胞轉移至50mL離mmol/LTris,10mmolL,1.510mmolLMgCl?,pH7.2)重懸細胞，每瓶大約0.5mLTNM。D.1.5加NP40裂解液至1%,用移液器吹打5-10次以裂解細胞。D.1.7輕輕地將上