3細(xì)胞工程(cellengineering)

細(xì)胞工程是按照一定的設(shè)計(jì)方案，通過(guò)在細(xì)胞、亞細(xì)胞或組織水平上進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作，獲得重構(gòu)的細(xì)胞、組織、器官以及個(gè)體，創(chuàng)造優(yōu)良品種和產(chǎn)品的生物工程。

×緩沖室操作室操作人員房間設(shè)備實(shí)驗(yàn)材料3.1細(xì)胞工程的基本操作技術(shù)無(wú)菌操作技術(shù)細(xì)胞和組織培養(yǎng)技術(shù)

材料獲?。簞?dòng)物、植物的組織---消毒

培養(yǎng)基（培養(yǎng)液）：滿足細(xì)胞生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)需求

其他培養(yǎng)條件：溫度、濕度、光照、O2及CO2等

細(xì)胞融合技術(shù)（雜交）---遺傳物質(zhì)的重組

（1）制備原生質(zhì)體

（2）誘導(dǎo)細(xì)胞融合（誘導(dǎo)方法）

（3）篩選雜合細(xì)胞

3.3動(dòng)物細(xì)胞工程動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞融合與單克隆抗體細(xì)胞核移植與胚胎克隆干細(xì)胞工程學(xué)習(xí)要求掌握動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)方法了解動(dòng)物細(xì)胞融合與單克隆抗體技術(shù)了解細(xì)胞核移植與胚胎克隆技術(shù)了解干細(xì)胞工程的基本原理及重大意義細(xì)胞系（cellline)

原代培養(yǎng)的細(xì)胞經(jīng)首次傳代以后的細(xì)胞，包括有限細(xì)胞系和連續(xù)細(xì)胞系（永生性細(xì)胞）。細(xì)胞株（cellstrain)

通過(guò)選擇或克隆從原代細(xì)胞或細(xì)胞系中獲得的具有特定性質(zhì)或標(biāo)志的細(xì)胞群，由單個(gè)細(xì)胞增殖形成。解離液動(dòng)物細(xì)胞在離體條件下的生長(zhǎng)和增殖，操作環(huán)節(jié)包括：原代培養(yǎng)(primaryculture)傳代培養(yǎng)(subculture)細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇

3.3.1動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)（cellculture)Y原代培養(yǎng)動(dòng)物表面消毒取組織塊

原代培養(yǎng)(primaryculture)

：酶解離心，收集細(xì)胞，培養(yǎng)切割培養(yǎng)傳代培養(yǎng)(subculture)：懸浮細(xì)胞：移取一部分細(xì)胞到新的培養(yǎng)基中。貼壁細(xì)胞：酶解法（0.25%胰酶）消化細(xì)胞，收集（離心）細(xì)胞，接種于新的培養(yǎng)基中。細(xì)胞的凍存操作簡(jiǎn)便，保存期長(zhǎng)液氮保存法：細(xì)胞凍存液：基礎(chǔ)培養(yǎng)液+血清+DMSO（甘油）梯度降溫：-4℃,30min-20℃，2h-80℃，過(guò)夜液氮

污染源治理方法

細(xì)菌青霉素（200U/mL),鏈霉素（200μg/mL)

真菌制霉菌素（100U/mL)

支原體卡那霉素（100μg/mL)

細(xì)胞、組織培養(yǎng)污染的防治解離液3.2.2動(dòng)物細(xì)胞融合與單克隆抗體細(xì)胞融合：又稱細(xì)胞雜交，在體外將不同種生物或同種生物的不同類型的細(xì)胞通過(guò)無(wú)性方式融合成雜合細(xì)胞的技術(shù)，可以重新組合兩親本細(xì)胞的遺傳信息。

動(dòng)物細(xì)胞融合的誘導(dǎo)方法（1）病毒誘導(dǎo)

1958年日本岡田善雄發(fā)現(xiàn)滅活的仙臺(tái)病毒誘導(dǎo)艾氏腹水瘤細(xì)胞融合成多核細(xì)胞。（2）化學(xué)誘導(dǎo)---聚乙二醇（PEG）1974年，高國(guó)楠用PEG成功誘導(dǎo)植物細(xì)胞原生質(zhì)體融合；1975年，Pontecorvo用PEG法融合動(dòng)物細(xì)胞取得成功。培養(yǎng)液洗滌離心篩選鑒定雙親本細(xì)胞

PEGpH7.4-8.0融合細(xì)胞團(tuán)再生雜合細(xì)胞搖勻，靜置動(dòng)物細(xì)胞融合的誘導(dǎo)方法(3)物理誘導(dǎo)---電激法將雙親本細(xì)胞溶液混合（1:1），施以交流電，細(xì)胞在電場(chǎng)力作用下排列成串珠狀，瞬間施加高電脈沖，細(xì)胞膜被擊穿發(fā)生融合。

淋巴細(xì)胞雜交瘤產(chǎn)生單克隆抗體

1975年Milstein（阿根廷）和Konler（英國(guó)）將小鼠骨髓瘤細(xì)胞與羊紅細(xì)胞免疫過(guò)的小鼠淋巴細(xì)胞融合，得到能無(wú)限增殖又能產(chǎn)生特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞。由于這一具有偉大生物學(xué)意義的工作，他們獲得1984年諾貝爾醫(yī)學(xué)及生理學(xué)獎(jiǎng)。理論基礎(chǔ)每種B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生一種針對(duì)特異性抗原決定簇的抗體，B淋巴細(xì)胞在體外不能無(wú)限增殖；

細(xì)胞融合

腫瘤細(xì)胞在體外可以無(wú)限增殖單抗隆抗體制備過(guò)程將B淋巴細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞融合（PEG）雜合細(xì)胞培養(yǎng)及雜交瘤細(xì)胞篩選特異性抗原免疫實(shí)驗(yàn)動(dòng)物HAT培養(yǎng)液篩選雜合細(xì)胞單克隆抗體的大量制備單克隆抗體的應(yīng)用（1）檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)診斷試劑

病原微生物抗原、腫瘤抗原、免疫細(xì)胞抗及細(xì)胞因子檢測(cè)（2）腫瘤的導(dǎo)向治療（3）蛋白質(zhì)的提純解離液3.2.3細(xì)胞核移植與動(dòng)物克?。?）異種細(xì)胞核質(zhì)關(guān)系研究（2）動(dòng)物克隆——細(xì)胞核遺傳全能性

早期胚胎細(xì)胞核移植克隆哺乳動(dòng)物

1952年，Briggs

將豹紋蛙的囊胚細(xì)胞核移入去核的同種蛙卵中，部分異核卵發(fā)育成個(gè)體。此后，多種哺乳動(dòng)物通過(guò)此技術(shù)被成功克隆。

成熟的體細(xì)胞核移植克隆哺乳動(dòng)物

1996年7月5日，Dr.Wilmut的團(tuán)隊(duì)在英國(guó)愛丁堡市羅斯林研究所成功用體細(xì)胞克隆出Dolly羊，發(fā)表在1997年2月27日的Nature上。體細(xì)胞克隆哺乳動(dòng)物基本途徑取出體細(xì)胞核未受精卵去核

異核卵早期胚胎

化學(xué)或電激誘導(dǎo)融合

產(chǎn)下幼體假孕狀態(tài)植入代孕母體子宮中

體外發(fā)育2004年2月15日，美國(guó)愛達(dá)荷大學(xué)的研究人員在西雅圖的美國(guó)科學(xué)年會(huì)上展示三頭克隆騾子世界首例成年體細(xì)胞克隆水牛2005年3月17日在廣西大學(xué)“863計(jì)劃”良種牛南方繁殖中心誕生2005年4月24日韓國(guó)科學(xué)家培育出首只克隆狗“史納皮”（snuppy）經(jīng)中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)李寧教授領(lǐng)導(dǎo)的課題組一年多的科技攻關(guān)，2005年8月5日，我國(guó)第一頭體細(xì)胞克隆豬終于在河北省三河成功誕生

2005年12月8日中國(guó)科學(xué)院動(dòng)物研究所用山羊克隆的一只亞洲黃羊(左)與普通山羊一起在山東臨沂亮相---異種克隆

世界冠軍賽馬“斯卡普”被克隆成功，產(chǎn)下小馬駒“克萊頓”中國(guó)首例綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)基因克隆豬問(wèn)世哺乳動(dòng)物克隆存在的問(wèn)題

流產(chǎn)率高；難產(chǎn)率高；畸形率高；圍產(chǎn)期死亡率高；幼年死亡率高；解離液3.2.4干細(xì)胞工程干細(xì)胞（stemcell）是動(dòng)物（包括人）胚胎及某些器官中具有自我復(fù)制和分化潛能的原始細(xì)胞，是重建、修復(fù)組織或器官的理想的種子細(xì)胞。1958年，Stevens在小鼠畸胎瘤中首次發(fā)現(xiàn)胚胎干細(xì)胞，1970年，Evans分離得到小鼠胚胎干細(xì)胞，1997年，人胚胎干細(xì)胞首次被培養(yǎng)成功培養(yǎng)，1999年，Goodell等分離出小鼠肌肉干細(xì)胞，近年陸續(xù)分離出多種成體干細(xì)胞。根據(jù)其發(fā)育階段分為胚胎干細(xì)胞（embryonicstemcell）和成體干細(xì)胞。胚胎干細(xì)胞：哺乳動(dòng)物囊胚期內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的細(xì)胞；成體干細(xì)胞：神經(jīng)干細(xì)胞、造血干細(xì)胞、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、表皮干細(xì)胞等、臍帶血干細(xì)胞等。根據(jù)分化潛能的大小分為三類：

全能性干細(xì)胞，胚胎干細(xì)胞；

多能性干細(xì)胞，如骨髓造血干細(xì)胞；

專能干細(xì)胞，如上皮基底層干細(xì)胞和肌肉中的成肌細(xì)胞。干細(xì)胞研究“三步曲”獲得干細(xì)胞系;建立干細(xì)胞誘導(dǎo)分化模型;將上述干細(xì)胞或干細(xì)胞培育體系植入動(dòng)物或人的相應(yīng)器官或組織，考察其效果。誘導(dǎo)多能干細(xì)胞

（inducedpluripotent

stemcells）

誘導(dǎo)多潛能性干細(xì)胞(iPSC)是由體細(xì)胞誘導(dǎo)而成的干細(xì)胞，具有和胚胎干細(xì)胞類似的發(fā)育多潛能性，能夠像胚胎干細(xì)胞一樣進(jìn)行分化。CombinationofGene-TherapyandCell-Therapy干細(xì)胞治療的優(yōu)點(diǎn)：低毒性（或無(wú)毒性），一次治療有效；不需要完全了解疾病發(fā)病的確切機(jī)理；用自身干細(xì)胞移植，可避免產(chǎn)生免疫排斥反應(yīng)。

干細(xì)胞的應(yīng)用干細(xì)胞生物學(xué)研究與應(yīng)用幾乎涉及所有生命科學(xué)和生物醫(yī)藥學(xué)領(lǐng)域。除了在細(xì)胞治療、組織器官移植、基因治療具重要意義外，還將在新基因發(fā)現(xiàn)與基因功能分析、發(fā)育生物學(xué)研究、新藥開發(fā)與藥效以及毒性評(píng)估等領(lǐng)域產(chǎn)生極其重要的影響。1999年12月，美國(guó)Science雜志將人類干細(xì)胞研究評(píng)為年度世界十大科學(xué)研究之首；2000年再度被該雜志評(píng)為年度世界十大科學(xué)之一。2006年日本京都大學(xué)

山中伸彌（ShinyaYamanaka）領(lǐng)導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)室在世界著名學(xué)術(shù)雜志《cell》上率先報(bào)道了iPSC的研究，2012年，JohnB.Gurdon與ShinyaYamanaka因此獲得諾貝爾生理學(xué)和醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。小結(jié)：動(dòng)物細(xì)胞工程

通過(guò)本部分知識(shí)的學(xué)習(xí)，使大家了解動(dòng)物細(xì)胞工程方面幾個(gè)具有重大意義的技術(shù)：利用淋巴細(xì)胞雜交瘤生產(chǎn)單抗隆抗體；利用體細(xì)胞克隆哺乳動(dòng)物；干細(xì)胞工程技術(shù)，從而認(rèn)識(shí)到這些技術(shù)對(duì)人類發(fā)展的光明前景。回答問(wèn)題：

1.如何獲得能在體外大量生長(zhǎng)、分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞？2.開展干細(xì)胞研究對(duì)人類有什么積極的意義？3.2植物細(xì)胞工程植物組織培養(yǎng)植物細(xì)胞培養(yǎng)和次生代謝物生產(chǎn)原生質(zhì)體制備與細(xì)胞融合單倍體植物的誘發(fā)與利用學(xué)習(xí)要求學(xué)習(xí)掌握植物細(xì)胞、組織的培養(yǎng)方法了解原生質(zhì)體制備與細(xì)胞融合技術(shù)了解單倍體植物育種的優(yōu)勢(shì)3.2.1植物組織培養(yǎng)

植物組織培養(yǎng)的基本過(guò)程芽、根離體的植物器官、組織去分化愈傷組織再分化植物體培養(yǎng)胚狀體高濃度生長(zhǎng)素消毒注意的問(wèn)題1.選擇外植體應(yīng)考慮哪些因素？

大小適宜；優(yōu)先選擇胚和幼嫩組織器官2.對(duì)外植體進(jìn)行除菌3.培養(yǎng)基的配制：基本成分+微量無(wú)機(jī)物+微量有機(jī)物4.誘導(dǎo)去分化時(shí)，采用固體培養(yǎng)基，添加高濃度生長(zhǎng)素3.2.2植物細(xì)胞培養(yǎng)和次生代謝物生產(chǎn)植物細(xì)胞培養(yǎng)罐氨基酸、核酸、蛋白質(zhì)、碳水化合物、脂類、維生素、有機(jī)酸抗白血病藥、抗腫瘤藥、抗病毒藥、抗微生物藥、酶抑制劑、奎寧、阿司匹林色素、香料、甜味劑、鴉片、殺蟲劑、激素、強(qiáng)心苷、核苷酸橡膠、可卡因從植物培養(yǎng)細(xì)胞中獲得的各類物質(zhì)

產(chǎn)量物種天然產(chǎn)物細(xì)胞培養(yǎng)原植物

橘葉雞眼藤蒽醌900μg/g干重110μg/g干重決明蒽醌鮮重的0.334%種子干重的0.21%

長(zhǎng)春花蛇根堿干重的1.3%干重的0.26%

三角葉薯蕷薯蕷皂苷26mg/g干重20mg/g干塊根人參人參皂角苷鮮重的0.38%鮮重的0.3%~3.3%

煙草煙堿干重的3.4%干重的2%~5%

煙草泛醌0.5mg/g干重16mg/g干葉大紅罌粟蒂巴因130mg/g干重140mg/g干葉細(xì)胞培養(yǎng)和原植物的天然產(chǎn)物量的比較

優(yōu)點(diǎn)：結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，易操作；細(xì)胞增殖快缺點(diǎn)：次生代謝物生產(chǎn)效率低封閉式懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)

植物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)系統(tǒng)立柱培養(yǎng)系統(tǒng)平床培養(yǎng)系統(tǒng)固定化培養(yǎng)系統(tǒng)優(yōu)點(diǎn)：細(xì)胞生長(zhǎng)慢，利于分化和組織化，收貨更多的次級(jí)代謝物3.2.3植物原生質(zhì)體制備與融合原生質(zhì)體的制備原生質(zhì)體的融合雜合體的鑒別與篩選名詞：原生質(zhì)體（protoplast):去除全部細(xì)胞壁的細(xì)胞原生質(zhì)球（球狀體，spheroplast):殘存少量細(xì)胞壁的原生質(zhì)體1.原生質(zhì)體的制備原生質(zhì)體的制備過(guò)程：（1）取材、除菌

：外植體選用生長(zhǎng)旺盛的組織器官（2）酶解：復(fù)合纖維素酶；（3）分離：200-400目過(guò)濾；低速離心法；（4）離心洗滌：原生質(zhì)體培養(yǎng)液（5）鑒定：鏡下觀察呈圓形歷史：

1937年，Michel率先嘗試細(xì)胞融合試驗(yàn)；1960年，Prof.Cocking利用真菌纖維素酶成功制備出番茄幼根細(xì)胞原生質(zhì)體。2.原生質(zhì)體的融合（1）化學(xué)法誘導(dǎo)融合（1974-1977年，華人高國(guó)楠建立并完善）培養(yǎng)液洗滌離心篩選鑒定雙親本原生質(zhì)體PEG高鈣高pH原生質(zhì)體團(tuán)再生雜合原生質(zhì)體（2）物理法誘導(dǎo)融合---電激法

雙親本原生質(zhì)體1:1混合，施