醫學微生物學與免疫學實驗指導

目錄

實驗目的與要求

實驗室規則

醫學免疫學實驗

體液免疫檢測

臨床常用的抗原抗體反應

實驗一、凝集反應

一、直接凝集反應

二、間接凝集抑制反應

三、ABO血型鑒定法

實驗二、沉淀反應

一、雙向瓊脂擴散

二、單向瓊脂擴散

三、對流免疫電脈

四、火箭電泳

實驗三補體結合試

免疫標記技術

實驗四熒光抗體技術

實驗五放射免疫測定

實驗六醐聯免疫吸附試驗

細胞免疫檢測

實驗七T細胞計數

一、E攻瑰花結試驗”

二、Ea玫瑰花結試驗

實驗八淋巴細胞轉化試驗

實驗九移動抑制試驗

實驗十T細胞亞群檢測

實驗十一白細胞介素2檢測

醫學微生物學實驗

細菌學

細菌形態學

實驗一微生物學實驗室常用儀器

實驗二顯微鏡油鏡使用法

實驗三細菌的形態觀察

實驗四細菌動力顯微鏡檢查法

一、懸滴法

二、壓滴法

三、暗視野顯微鏡檢查法

四、相差顯微鏡檢查法

實驗五細菌的染色標本檢查法

一、涂片制備及革蘭氏染色法

二、抗醛染色法

細菌的生理學

實驗六細菌的人工培養

一、常用培養基的制備原則

二、細菌培養的接種方法

三、細菌的生長情況觀察

實驗七細菌代謝產物觀察

一、單糖發酵試驗

二、VP試驗

三、甲基紅（MR）試驗

四、證基質試驗

五、硫化氧試驗

外界因素對細菌的影響

實驗八物理因素對細菌的影響

一、溫度與細菌生長繁殖的關系

二、紫外線的殺菌作用

買驗九化字因素對細菌的影響

皮膚消毒前后的細菌學檢查

實驗十生物因素對細菌的影響

細菌對抗生素敏感性測定

細菌的遺傳與變異

實驗十一化學物質對細菌的致突變作用

細菌的感染與免疫

實驗十二病原菌的致病性

一、透明質酸酶的擴散作用

二、破傷風桿菌外毒素的毒性作用

三、邕試驗

實驗十三吞噬細胞的吞噬作用

一、中性粒細胞的吞噬作用

二、單核巨噬細胞的舌噬作用

實驗十四體液的殺菌作用

一、正常血清的殺菌作用

二、溶菌酶試驗

實驗十五病原性球菌

一、病原性球菌形態及染色性

二、病原性球菌的培養特性

三、血漿凝固酶試驗

四、抗鏈球菌溶血毒素"0"試驗

實驗十六病原性球菌未知標本（膿汁）的檢查

實驗十七腸道桿菌

一、腸道桿菌的形態及染色性

二、腸道桿菌的培養特性

三、腸道桿菌的生化反應

實驗十八變形桿菌

一、形態及染色性

二、遷徒生長情況

三、尿素分解試驗

實驗十九糞便標本中致病性腸追桿菌的分離與鑒定

實驗二十傷寒、副傷寒皿清學檢查

肥達氏反應

實驗二十一需氧芽胞桿菌

一、需氧芽胞桿菌的生物學特性

二、炭疽桿菌的串珠試驗

實驗二十二厭氧芽胞桿菌

一、形態及染色特性

二、產氣莢膜桿菌"洶涌發酵"試驗

三、產氣莢摸桿菌動物試驗

四、厭氧培養法

實驗二十三白喉桿菌

一、白喉桿菌的形態及染色性

二、白喉桿菌的培養特性

三、白喉桿菌平板毒力試驗

實驗二十四分枝桿菌

一、結核桿菌和麻風桿菌的形態及染色性

二、結核桿菌的培養特性

三、肺結核患者痰標本的直接涂片檢查

實驗二十五立克次體

一、形態及染色性

二、血清學診斷方法一一外裴氏反應

實驗二十六螺旋體

一、形態及染色性

二、暗視野顯微鏡察鉤端蝶旋體的活動力

三、口腔螺旋體涂片與染色

真菌學

實驗二十七真菌

一、真菌形態及菌落特點

二、棧部真菌病臨蛛標本直接鏡檢

病毒學

實驗二十八、病毒的形態學

實驗二十九病毒的培養法

一、動物接種法

二、雞胚培養法

1.絨毛尿囊膜接種法

2.尿囊腔接種法

3.羊膜腔接種法

三、組織培養法

實驗三十腺病毒約分離

實驗三十一病毒血清學試驗

一、血凝抑制試驗

二、反向間接血凝試驗

附錄一染色液及染色法

（-）呂氏堿性美蘭染色液配制及染色法

（二）革蘭氏染色液配制

（三）抗酸染色液配制

（四）奈瑟（Neisser）氏染色液配制及染色法

（五）阿爾培脫（Albert）氏塵色液配制及染色方法

（六）馮他那（Fontana）氏渡銀染色液配制及染色法

附錄二試劑及溶液

（-）甲基紅試劑

（二）口引噪（柯氏）試劑

（三）Hank,s溶液

（四）0.5%水解乳蛋白溶液

（五）營養液

（六）維持液

（七）0.25%胰蛋白酶溶液

（八）PH8?6離于強度0.05巴比妥緩沖液

附錄三常用培養基制備

（一）肉膏湯培養基

（二）普通瓊脂（固體）培養基

（三）血液瓊脂培養基

（四）半固體瓊脂培養基

（五）蛋自陳水培養基

（六）單糖發酵管培養基

（七）醋酸鉛培養基

（A）尿素瓊脂培養基

（九）Vogel——Bonner基本培養基（簡稱E培養基）

（十）完全培養基

（十一）組氨酸軟瓊脂上層培養基

（十二）S?S瓊脂培養基

（十三）中國蘭瓊脂平板培養基

（十四）半固體雙糖培養基

（十五）紫牛乳培養基

（十六）泡肉培養基

（十七）呂氏血清培養基

（十八）亞硫酸鉀血瓊脂培養基

（十九）Elek蛋白陳培養基

（二十）羅氏培養基

（二十一）蘇通氏培養基

（二十二）改良沙保弱氏培養基

（二十三）玉米粉瓊脂培養基

附錄四真菌小培養法

實驗目的和要求

醫學微生物學和免疫學實驗是醫學微生物學的重要組成部分，是醫學微生物學和免疫學教學過程中的

重要環節之一，是理論與實驗研究的技術基礎。

通過實驗，加深、鞏固對理論內容的理解與記憶；學習、掌握有關醫學微生物學的基本操作技術，樹

立無菌觀念；更重要的是通過實驗培養學生實事求是的科學的態度和獨立分析問題與解決問題的能力。為

對有關疾病的診斷與防治，對醫學微生物學的科學研究工作所必要的實驗方法與技術打下一定的基礎。特

別是通過實驗，使學生熟練地掌握普通光學顯微鏡、涂片染色、分離接種與稀釋方法等基本操作技術。

實驗形式分教師示教和學生操作兩種。前者主要驗證理論，后者可從不同角度進行基本技術訓練和反

復練習，掌握基本技能。

為了提高實驗課效果，保證實驗課質量，要求學生做到：

1.實驗前必須做好預習，以了解實驗的內容、目的、理論依據、操作方法及注意事項，避免或減少錯

誤的發生。

2.實驗過程中堅持嚴肅性，嚴格性與嚴密性，對操作的實驗要在全面理解的基礎上，按步驟依次進行

操作，并進行積極地思考；對示教內容要仔細觀察并與有關理論密切聯系。

3.如實記錄，分析結果，得出結論。如結果與理論不符，應盡量分析，探討起原因以培養訓練自己的

思維能力，最后寫出實驗報告。

實驗室規則

實驗中所用材料，多具有傳染性（如病原微生物、含病原微生物的患者血、尿、便、痰、膿汁及感染

動物等），在實驗過程中，必須嚴肅認真地進行無菌操作，以保證結果準確，防止實驗室感染，防止病原

微生物污染環境。必須遵守以下各項。

一、進實驗室應穿白大衣，不得將書包、衣物等放在實驗臺上，不必需的物品勿攜入室內。

二、實驗室內嚴禁飲食、吸煙及用嘴舔濕鉛筆及瓶簽等。

三、保持實驗室安靜，實驗進行時不準隨意進出。實驗室中物品未經許可不準帶出室外。

四、如發生感染或污染等意外時，應立即報告指導老師，進行緊急處理。

L吸入活菌液，應立即吐入容器中消毒，并用1：1000過猛酸甲溶液或3%雙氧水漱口，必要時根據

菌類的不同服用適當的抗菌藥物。

2.菌液流灑桌面或地面，傾注2——3%來蘇兒或0.1%新潔爾滅于污染面上，30分鐘后抹去。手上污

染活菌，在上述消毒液中浸泡10——20分鐘后，再以肥皂水刷洗。衣服污染時，用上述消毒液浸泡30分

鐘后，或高壓滅菌后清洗。

五、實驗用過的吸管、毛細管及玻片等應立即放入指定的消毒液中，不準在實驗臺上亂放。接種環用

后應立即于酒精燈火焰上燒灼滅菌。

六、實驗完畢，應及時清理實驗室，關好門窗水電，用消毒液洗手后離去。

免疫學檢測技術

醫學免疫學是當代生物科學中一個極為活躍的分支。它不僅是基礎醫學的重要帶頭

學科之一，而且對臨床各科都產生了重大影響。隨著免疫學理論的進步，免疫學檢測技術有了顯著的改進

和發展，它對探討臨床疾病的發病原理，診斷和防治免疫性疾病，遺傳性疾病、腫瘤以及器官移植等具有

廣泛的應用價值。

免疫學檢測技術分為體液免疫檢測和細胞免疫檢測兩大類。

體液免疫檢測

體液免疫檢測的基本原理是抗原抗體的特異結合反應。主要包括臨床常用的抗原抗體反應和免疫標記

技術。

一、臨床常用的抗原抗體反應

臨床常用的抗原抗體反應主要指抗原抗體在體外結合，在適當濃度電解質存在的條

件下，直接出現凝集、沉淀、細胞溶解、補體結合等可見反應。因這部分實驗以血清作為抗體材料，所以

又可稱為血清學反應。

實驗一凝集反應

凝集反應是完整的細菌。紅細胞等顆粒性抗原與相應抗體在一定條件下出現凝集物的現象。參與反應

的抗原稱凝集原，抗體稱凝集素。凝集反應包括直接凝集反應、間接凝集反應、間接凝集抑制反應、反向

間接凝集反應、協同凝集試驗、抗球蛋白試驗等。本實驗介紹兩種方法。

內容：一、直接凝集反應

二、間接凝集抑制反應

三、ABO血型鑒定法

一、直接凝集反應

直接凝集反應是顆粒性抗原與相應抗體直接結合所出現的凝集現象。基本方法有玻

片法和試管法，本實驗介紹玻片法。

玻片凝集試驗是一種定性試驗，方法簡便快速。常用干鑒定菌種、測定人類紅細胞的AB（）血型等。

（一）實驗目的與原理

練習玻片凝集試驗方法。觀察凝集現象，判斷凝集結果。

抗原與抗體一般均為蛋白質，在中性或磴性溶液中多表現為親水性，且帶有負電荷。抗原抗體結合

后，由于極性基的相互吸引而變為疏水性，易受電解質影響，如有適當的電解質存在，使其失去一部分負

電荷而互相吸引出現肉眼可見的凝塊。

（二）實驗材料

1、抗體1:10稀釋的傷寒桿菌診斷血清與痢疾桿菌診斷血清。

2、抗原:待檢病原菌24小時斜面培養物。

3、其它:生理鹽水、載玻片、毛細管、接種環等

（三）實驗方法

1、取潔凈玻片一張，用蠟筆劃成三格。標識1、2、3。

2、于I格內滴加1:10傷寒桿菌血清1?2滴，第二格加1:10痢疾桿菌血清1?2

滴，第三格滴加1?2滴生理鹽水。

3、用接種環取培養物少許混于第3格中，再取少許培養物分別混于第1、2格中。每次取培養物前接

種環均需火焰滅菌。

4、輕輕搖動玻片，1?2分鐘觀察結果。

（四）實驗結果

第3格中應是均勻混濁，無凝集出現。

依被檢抗原的不同，在第1或第2格中出現塊狀凝集。如第1格中凝集，被儉物為傷寒桿菌，第2格

凝集則為痢疾桿菌。

二、間接凝集抑制反應

可溶性抗原與抗體結合后不出現凝集。如把可溶性抗原吸附在載體微球上，成為人工免疫微球，再與

抗體結合即出現凝集，此稱間接凝集反應。由于載體微球增大了可溶性抗原的反應面積，微球上少量抗原

存在就足以出現肉眼可見的反應。這種反應的敏感性比沉淀反應高得多。

如先使可溶性抗原與抗體充分結合，再加入有關的免疫微球。因抗體已被抗原結合，不再出現免疫微

球的凝集現象。這一試驗稱間接凝集抑制反應。

（一）試驗目的與原理

了解間接凝集抑制反應原理、試驗方法與結果判斷。

絨毛膜促性腺激素（HCG）為可溶性抗原，在妊娠尿中含量顯著增高。如尿中有此抗原存在與相應抗體

（抗一HCG）結合后，加入吸附HCG的免疫微球時，不出現凝集現象，呈均勻乳液，如尿中無HCG存在，

沒有抗原與抗體結合，再加入相應的免疫微球時，即出現肉眼可見的凝集（即凝集未被抑制）。

（二）實驗材料

1、妊娠診斷血清（抗一一HCG血清）。

2、妊娠診斷抗原（吸附有HCG的免疫微球）。

3、待檢尿、正常尿、玻片等。

（三）實驗方法

1、取一潔凈玻片，用蠟筆劃分1、2兩格。（圖1）

待檢尿正常尿

1、陽性結果2、陰性結果

2、加被檢尿滴于1格內，加正常尿滴于2格內。

3、每滴尿中各加抗一一HCG血清1滴搖勻或用牙簽混勻。

4、再于各滴中加（HCG乳膠抗原。HCG兔疫微球）1滴;混勻，繼續搖動2—3分鐘。肉眼觀察結果。

（四）實驗結果

妊娠尿滴呈均勻乳狀，無凝集現象（陽性）。

正常尿滴出現明顯凝集顆粒（陰性）。

三、ABO血型鑒定法

血型是根據血細胞表面抗原的差異而將人類血液分為若干類型。紅細胞、白細胞、血小板各有自己復

雜的抗原系統和血型分類方法，但臨床血型主要指紅細胞血型而言。

自從1901年Lanlsteiner發現ABO血型系統以來，迄今已發現的人類紅細胞血型系統至少有15個，

但在臨床輸血工作中最重要的還是ABO血型系統。

ABO血型系統根據人類紅細胞表面A抗原和B抗原的分布。將人類分為A型、B

型、AB型與O型四個血型。不同血型間進行輸血時，可因紅細胞表面抗原與血清中天然血型抗體結合產

生凝集反應，在補體存在時，可發生溶血現象。故臨床上給病人輸血時，必須先鑒定血型，同時需進行交

互配血試驗，以復查定型時有無錯誤或有無亞型存在。

（一）實驗目的與原理

熟悉血型鑒定方法及判斷結果的理論依據。

ABO血型系統是根據紅細胞表面抗原的種類及有無而分為A型、B型、AB型與O

型四個血型。本試驗，是依抗原抗體間反應的特異關系，用抗A、抗B兩種已知的標準血清（即抗體）分別

與被檢血混合。根據紅細胞有無凝集判定紅細胞表面抗原種類，決定是何種血型。

（二）實驗材料

1、標準血清:抗A、抗B標準血清。

2、載玻片、采血針、酒精棉、牙簽等。

（三）實驗方法

1、取潔凈載玻片一張，用蠟筆標記“抗A”、“抗B”兩部分。分別加滴抗A、抗B血清。

2、用酒精棉消毒耳垂或手指，用采血針刺破，以另一玻片一端的兩角取血兩滴。分別滴于"抗A'\"

抗B"血清中、混勻。

3、前后左右搖動玻片，使之充分混合，靜止10~15分鐘。觀察有無凝集。

（四）實驗結果

凝集者可見紅細胞凝集成塊，無凝集者細胞均勻分散。____________________________

抗A血清抗B血清血型____________

0^

+-A型

+B型

++AB型

注：“十”：凝集?“一”：不凝集

實驗二沉淀反應

可溶性抗原（如血清蛋白、細菌培養濾過液、細菌浸出液，組織浸出液等）與特異性抗體結合，在適量

電解質的存在下，形成沉淀物，稱此反應為沉淀反應。參與沉淀反應的可溶性抗原稱為沉淀原，抗體稱為

沉淀素。沉淀反應的試驗方法有環狀法，絮狀法和瓊脂擴散法三種基本類型。其中瓊脂擴散法方法簡單，

用途也較廣泛，為本實驗介紹的重點。

內容：一、雙向瓊脂擴散

、單向瓊指擴散

三、對流免疫電泳

四、火箭電泳

一、雙向瓊脂擴散

（一）實驗目的與原理

了解試驗方法，觀察判定結果。

利用可溶性抗原與相應抗體在半固體瓊脂對應孔中各自向四周進行擴散，如抗原抗體相對應，兩者在

比例適當處，就出現肉眼可見的白色沉淀線。?若同時具有幾種抗原抗體系統，因各自的擴散速度不同，

可在瓊脂中出現多條沉淀線。

（二）實驗材料

1、抗體：甲胎蛋白診斷血清。

2、抗原:肝癌病人甲胎蛋白陽性血清或正常人胚胎組織浸出液，待檢血清。

3、1%生理鹽水瓊脂、載玻片、打孔器、毛細管等。

（三）實驗方法

1、將1%生理鹽水瓊脂加熱溶化。

2、制備瓊脂板:取潔凈載片一片，放一水平臺上，將溶化的2-5ml瓊脂趁熱用吸管注于玻片上，使其

自然流成平面，瓊脂凝固后用打孔器如圖（圖2.1）打孔，去掉孔中的瓊脂。

O

OO

OOO

O

圖2.1雙向瓊脂擴散模式

3、加樣沖央孔中加入甲胎蛋白（AFP）診斷血清，1、4孔加肝癌病人陽性血清，2、3、5、6孔加待

檢血清。加血清至滿勿外溢。不可有氣泡。

4、加樣后，將掠脂板放入有一定濕度帶蓋容器中，置37℃溫箱，24小時觀察結果。

（四）實驗結果（圖2.2）

1、1、4孔為陽性對照孔（加已知陽性標本），與中央孔間出現乳白色沉淀線。

2、其余各孔與中央孔如出現沉淀線，且一端與陽性對照沉淀線相吻合者為陽性。證明該份血清含有

甲胎蛋白。如兩條沉淀線相交，表明二者抗原性不同，出現的沉淀線另一種抗原擾缽反應，不能判定陽性。

3、如待檢孔與中央抗體孔間末出現沉淀線為陽性，證明待檢血清中沒有甲胎蛋白。

1

O

6O/\02

/O'

5oX；—O3

O

4-

圖2—2雙向瓊脂擴散試驗結果

2、6孔：吻合沉淀線（陽性）。

5孔：交叉沉淀線（陰性）。

3孔：無沉淀線（陰性）。

二、單向瓊脂擴數

（一）實驗目的與原理

了解單擴散試驗方法、原理及結果分析。

單擴散實驗是一種定量試驗方法。先將一定量抗體混合于瓊脂中，傾注于平板上。凝固后打孔。加入

待測抗原。如抗原與抗體一致時，抗原向孔四周擴散，與孔周圍抗體形成抗原抗體復合物，呈白色沉淀環,

沉淀環直徑大小與抗原濃度成正比。如先用不同濃度的標準抗原制成標準曲線，則未知標本中的抗原含量,

即可從標準曲線中求出。本試驗主要用于檢查標本中各種1g與血清中各種補體成分的測定。

（二）實驗材料

1、3%生理鹽水瓊脂。

2、抗體:免抗人毛Ig抗體血清。

3、抗原:待檢人血清、IgG參考抗原。

4、塑料板、吸管、打孔器。

（三）實驗方法

1、制備含抗IgG抗體的瓊脂板:溶化的3%瓊脂、待冷至56℃時吸取1.5ml瓊脂與等量適當稀釋的抗

IgG抗體混合均勻。傾注于水平放置的塑料板上，制成厚薄均勻的瓊脂板。凝固后用打孔器打孔二排，每

排5孔、孔距8—10mm,孔要圓整光滑。

e

。e,⑥■

圖3、單向瓊脂擴散試驗模式

2、加樣:用微量加樣器加樣。

（1）第一排五孔分別加入不同濃度（20、25、50、100、200倍）的參考IgG抗原10、1。

（2）第二排五孔，同法加1:50待檢血清103將瓊脂板平放于保持一定濕度的帶蓋容器內，37℃溫

箱放置24小時觀察結果。

（四）實驗結果

標準曲線的繪制及血清標本中IgG含量的測定。

1、以各稀釋度標準抗原孔沉淀環直徑為橫座標，相應孔中IgG含量為縱座標在半對數座標紙上作圖，

畫出標準曲線。

2、依待檢血清標本孔沉淀直徑，查標準曲線，將查得的唾G含量乘以標本的稀釋倍數，即為血清中

IgG的含量。

三、對流免疫電泳

（一）實驗目的與原理

了解瓊脂對流免疫電泳的基本方法、原理及特點。

對流免疫電泳是把雙擴散與電泳技術結合在一起的方法。

抗原抗體在電場作用下，各向相反的電極移動。因抗原在PH8.6的緩沖液中帶負電荷，由陰極向陽極

移動。抗體等電點為PH6~7,在PH8.6環境中帶負電荷少，分子又較大，則運動較慢。同時又因電滲作用

等原因使抗體向陰極倒退。于是出現抗原抗體相向移動的情況。如二者相應，在相遇的最適比例處即形成

白色沉淀線。由于抗原抗體在電場中定向移動，從而提高了試驗的敏感性，且沉淀線出現較快，可在一小

時內出現結果。

（二）實驗材料

1、抗原:甲胎蛋白陰、陽性血清。

2、抗體:甲胎蛋白診斷血清。

3、緩沖液、PH8.6,離子強度0.025——0.05巴比妥緩沖液。

4、1%緩沖瓊脂（精制瓊脂粉）。

5、電泳儀、載玻片、毛細管等。

（三）實驗方法

1、制備瓊脂板:將1%緩沖瓊脂溶化。吸3ml瓊脂傾注于平放的潔凈載片上。凝固后如圖3孔，孔徑

3mm,抗原抗體孔間距5mm。

十

1004-

2OO5

3006

圖3、對流免疫電泳模式

2、力口樣:1、2、3孔加甲胎蛋白診斷血清，4孔加陽性對照血清，5、6號孔均加待檢血清。

3、將瓊脂板置于電泳槽架上，抗原孔置陰極端，抗體孔置陽極端。瓊脂板兩端用雙層濾紙與緩沖液

相連，接通電源，控制電流在3?4mlA/Cm寬（載片寬2.5Cm,應控制電流在10mA）。電壓6—10V/cm長，

通電1?2小時；

4、關閉電源、取出瓊脂板，觀察結果。

（四）實驗結果

1、1、4孔間應出現白色沉淀線（陽性對照）。

2、2、5孔間出現白色沉淀線（待檢血清陽性）。

3、3、6孔間無沉淀線出現（待檢血清陰性）。

四、火箭電泳

（一）實驗目的和原理

了解火箭電泳試驗方法。原理與結果分析。

火箭電泳是把單擴散和電泳結合在一起的方法。抗原在含定量抗體的瓊脂中泳動，二者比例合適時，

在短時間內形成火箭樣或錐狀的白色沉淀線，沉淀峰的高低與抗原的濃度成正比。

（二）實驗材料

1、抗原。

2、抗體。

3、2%緩沖瓊脂。

4、0.05MPH8.6巴比妥緩沖液。

5、電泳儀、載玻片、打孔器等。

（三）實驗方法

1、將2%緩沖瓊脂加熱溶解，保溫于56c水浴中。

2、用0.05MPH8.6巴比妥液將抗體稀釋。

3、制板:將二液等量混合，取3ml傾注于平放的載片上。待凝，在載片近端1.5cm處打孔一排共3孔。

孔距4mm。孔徑3mm。（圖4）

一

圖4火箭電泳示意圖

4、用微量加樣器分別吸三種不同稀釋度的抗原液各加lOuEo

5、瓊脂板置于電泳槽架上，抗原孔在陰極端。用兩層濾紙與緩沖液連接。接通電源，電流ImA/mm

寬或6V/cm長。通電4~5小時。

6、關閉電源，取出瓊脂板、觀察結果。

（四）實驗結果

三孔均出現沉淀峰，隨抗原濃度增大，沉淀峰也隨之升高。

實驗三補體結合試驗

除凝集反應、沉淀反應外，常用的抗原抗體反應還有補體結合試驗、中和試驗、溶血空斑試驗等。本實

驗介紹補體結合試驗。

一、實驗目的與原理

了解補體結合試驗方法及結果分析。

補體結合試驗是一種有補體參與，并以綿羊紅細胞及溶血素作為指示系統的抗原抗

體反應。如被檢血中有相應抗體存在，則加入相應抗原與補體后。由于抗原抗體形成復合物，可使補體與

之結合，溶液中即無游離補體存在。但由于這種結合肉眼不能區別，故需加入指示系統（綿羊紅細胞及其溶

血素）。如補體已為試驗系統抗原抗體復合物所固定，加入指示系統后，因無補體與之結合，則不發生溶血

（溶血與否、肉眼易于區別），是為補體結合試驗陽性，表明抗原與抗體相對應。如出現溶血。為補體結合

試驗陰性。表明試驗系統中抗原與抗體不相應。補體末被固定，加入指示系統后。補體與之結合。從而發

生溶血反應。

二、實驗材料

1、抗原:甲型（或乙型）副傷寒桿菌菌液、2%綿羊紅細胞懸液。

2、抗體:甲型（或乙型）副傷寒桿菌診斷血清。溶血素（2個單位/0.25ml）。

3、補體:琢鼠血清（2個實用單位/0.25ml）

4、其它:生理鹽水、小試管、吸管等。

三、實驗方法：

1、取5只小試管、排于試管架上并注明管號。

2、第1管加生理鹽水0.4ml,再用吸管取已滅活（56℃加溫30分鐘）的抗體血清、hnl（或被檢血清）加

入第一管，吸吹三次使之充分混勻，然后吸出0。25ml放入第2管，兩管中的血清均為1:5稀釋。

3、按下表所示順序進行操作。

試管號12345

試管種類試驗管血清對照抗原對照溶血素對照羊紅細胞對照

1：5血清0.250.25______

抗原0.25__0.25____

補體0.50.50.50.5__

生理鹽水0.250.250.51.25

搖勻37℃水浴30分鐘

溶血清0.250.250.250.25__

2%羊紅細胞0.250.250.250.250.25

搖勻37℃水浴15分鐘

結果+++

注：“一”無溶血+溶血

四、實驗結果

先觀察有無溶血現象，各對照管結果是否正確。

溶血現象:紅細胞溶解，混濁液變為紅色透明液體;不溶血現象:紅細胞未溶解、混濁液不變。

第2、3、4管因缺乏相應待檢抗原抗體復合物，故應完全溶血，第5管因僅有羊紅細胞和生理鹽水故

不應溶血。以上均為對照管。

第1管不溶血者為補體結合反應陽性。

二、免疫標記技術

免疫標記技術是用易于識別、檢測的標記物如放射性同位素、熒光素、酶等標記已知的抗原或抗體進

行的抗原抗體反應，用以檢測體內超微量的抗體或抗原。

免疫標記技術保持了抗原抗體反應高度的特異性。當標記的抗體或抗原與待測的相應抗原或抗體反應

后，可以不必測定抗原抗體復合物本身，而測定易于識別和檢測的抗原抗體復合物中的標記物。通過標記

物的放大作用，進一步提高了抗原抗體反應的敏感性，使檢測方法的敏感性達到ng?pg/ml水平較常規的血

清學方法至少提高敏感性達兩個數最級以上。

臨床常用的三大標記技求是:酶聯免疫吸附試驗、熒光抗體技術和放射免疫測定。

實驗四熒光抗體技術

滎光抗體技術即免疫熒光技術，是用熒光素與抗體結合成熒光抗體進行的抗原抗體

反應，是將抗原抗體反應的特異性，熒光素的敏感性，顯微鏡檢查法結合起來的一種免疫學檢測方法.

熒光抗體技術的基本方法有直接法，間接法、補體法。本實驗介紹間接法。

內容：熒光抗體技術一一間接法

一、實驗目的與原理

了解實驗原理、方法及觀察結果。

熒光素具有能和抗體蛋白分子結合并保持抗體活性而仍能和相應抗原形成免疫復合

物的特性，并且借助于熒光顯微鏡，通過觀察熒光素而檢測相應抗原。

二、實驗材料

（一）器材1、熒光顯微鏡。

2、37c溫箱。

3、玻片、吸管等。

（二）試劑：

1、抗原。

2、抗體:第一抗體，末標記熒光素的睡IgG。第二抗體:熒光抗體，熒光素標記的抗IgG抗體。

3、其它四PH7.4的FBS緩沖液、甘油緩沖液、丙酮等。

三、實驗方法

1、制備含待檢抗原的玻片，將待檢抗原標本置丙酮中固定10分鐘，用PBS緩沖液沖洗。

2、與第一抗體結合：在玻片上滴加第熒光抗體1?2滴，置濕盒37℃保溫30分鐘，然后以PBS輕輕

洗滌3次，涼干。

3、與熒光抗體作用:在玻片上滴加熒光抗體1一2滴;置濕盒37C保溫30分鐘，PBS洗滌后涼干。

4、封片:在玻片的涂面上加蓋玻片，四周滴甘油緩沖液1?2滴封片。

5、立即將標本置于熒光顯微鏡下觀察。

6、對照:同時設陽性與陰性對照，以排除特異性熒光染色攻游離熒光素的干擾。

四、實驗結果

根據特異熒光強度判走結果，用加號法表示?標準如下：

(-)無熒光。

(±)極弱的可疑熒光。

(+)熒光較弱，但清晰可見。

(++)熒光明亮。

(+++—++-H-)熒光閃亮，且范圍廣。

實驗五放射免疫測定

放射免疫測定是60年代初期由YaloW和Barson創立的一種體外超微量定量分析方法。它將具有高靈

敏度的放射性核素示蹤技術與高度特異性的抗原抗體反應結合起來，具有靈敏度高、特異性強、重復性好、

標本用量小、操作簡便等優點，應用范圍極廣，幾乎可以應用于一切具有活性物質的測定?目前普遍應用

于體液中微量蛋白質、激素:藥物等的測定。

內容：放射免疫測定一一雙抗體法

一、實驗目的與原理

了解實驗原理及實驗方法。

放射免疫測定的基本原理，是標記抗原Ag*和未標記抗原(Ag)對特異性抗體(Ab)的競爭性結合

抑制反應。其反應以下式表示：

Agx+Abr^Ag^—Ab

+

Ag

Ag-Ab

在以上反應式中，當標記抗原(Ag*)與抗體(Ab)的量保持桓定時，則標記抗原抗體復合物(Ag*-Ab)

的形成受未標記抗原(Ag)的制約。如樣品中的未標記抗原含量高，則未標記抗原對特異性抗體的競爭能力

強，未標記抗原抗體復合物的量就增多，標記抗原抗體復合物的量就相對減少。如樣品中未標記抗原含量

低?則標記抗原抗體復合物的量就相對增加。標記抗原抗體復合物的形成量與末標識抗原的含量呈一定的

逆相關函數關系。

實際工作中，通常先以各種已知濃度的禾標記抗原和一定量的標記抗原及其抗體作用，根據測得的各

種末標記抗原標準濃度下標記抗原抗體復合物的放射性結合率?繪制成競爭抑制標準曲線。檢測樣品時，

根據被測抗原的放射性結合率?即可在競爭抑制標準曲線上查出相應的該抗原含量，

圖4火箭電泳示意圖

圖5競爭抑制標準曲線示意圖

例如用放射免疫測定（雙抗體法）檢測乙型肝炎表面抗原。利用.i-HBsAg與乙型肝炎患者血清中

HBSAg對特異性抗體的競爭反應,形成抗原抗體復合物,加入第二抗體，復合物板沉淀，而游離的⑵HBsAg

留在上清液中，離心去取上清液，測定沉淀物的放射性?用以表示血清中HBsAg的濃度。

二、實驗材料

（一）器材:

1、r計數器。

2、塑料試管、吸管等。

3、37℃溫箱，離心機?

（二）1試劑（您J標記試劑盒）

1、11玉?Ag標記液:緩沖液稀釋成，00011?,pm扣,1討.

2、干燥抗HBsAg血清:以PH7.410ml0.05mol/LPBS溶解。

3、第二抗體:羊抗馬IgG。

4、稀釋液，用蒸憎水稀釋至100mL

5、參考皿清:凍干品，以0.5ml蒸儲水溶解。

三、實驗方法

1、取6只塑料試管，排于試管架上并注明管號。

2、按下表所示順序進行操作。

試劑1~2（陰性對照管）3~4（陽性對照管）5?6（樣品管）

陰性對照血清0.05ml一—

陽性對照血清—0.05ml—

待測血清一一0.05ml

稀釋液0.05ml0.05ml0.05ml

抗血清0.1ml0.1ml0.1ml

,25I—HBsAg0.1ml0.1ml0.1ml

充分混勿后置37℃1小時

第二抗體

0.1ml0.1ml0.1ml

（羊抗馬IgG）

充分混勻，置37℃30分鐘后，測各管總叩m（T）?

離心（3000r/min）15分鐘，傾上清液，測各管沉淀epm（B）

四、實驗結果

結合率（％）=0x100%

T

比值—陽性對照管結合率

一_測定管結合率

比值>1.5為陽性，V1.5為陰性。

實驗六酶聯免疫吸附實驗

免疫酶技術是免疫標記技術的一種，是把抗原體反應和酶的高效催化作用原理有機的結合起來，具有

免疫熒光技術和放射免疫測定的優點，克服了上述二種方法的缺點的一種新的免疫測定方法。酶標試劑制

備容易、穩定、有效期長，敏感性接近放射免疫試驗。可肉眼觀察也可借助儀器作定量測定。所得結果比

較客觀。目前，酶標記技術廣泛地應用于微生物學、寄生蟲學等基礎免疫試驗及臨床免疫實驗中。其中，

尤以1971年Engvall和VanWeeman建立的醐聯免吸附試驗（ELISA）最為常用，ELISA有間接法（測抗

體）、雙抗體夾心法（測大?抗原）及競爭法（測小分子抗原）三種，以前二塔較為常用。

內容：酶聯免疫吸附試驗一一雙抗體夾心法

一、實驗目的與原理

了解實驗方法原理及結果觀察與判斷。

這是已知抗體測定未知抗原的一種方法。將純化的抗體結合到固相載體上。加待檢血清（欲測抗原）然

后加辣根過氧比物酶（HRP）?使之與被固相抗體結合的待檢抗原體起反應，最后結合在免疫復合物上的

酶遇到相應底物時，使其氧化，從而產生顏色。顏色的深淺與待檢血清中抗原量成正比?

二、實驗材料

（-）器材：

1、酶聯免疫檢測儀。

2,37℃溫箱。

3、40孔聚苯乙烯板。

4、微量加液器（50ul>lOOul）,

（二）試劑：

1、0.05MPH9.6碳酸緩沖液。

2、稀釋緩沖液（KCL0.2g,KH2PO4.H2O2.9g,NaC118g,蒸儲水稀釋至1000mL使用時，加10%免

血清。

3、洗滌緩沖液（同稀釋緩沖液，但以0.05%Tween-20代替10%兔血清）

4、底物溶液（PH5.0磷酸鹽、檸博酸鹽緩沖液：將0.2MNa2Hpe）425.3ml和01M24.7ml檸檬酸混合后，

加蒸館水至1000ml,臨用前，上述溶液10ml加鄰苯二胺4mg,溶解后加入15nl30%H2O2o

5、2NH2sO4。

6、抗原:HBsAg阻性對照血清及陰性對照血清。

7、抗體，抗一HBs與醐標抗一HBs。

三、實驗方法

1、包被：用PH9.60.05M碳酸緩沖液將抗-HBs稀釋至蛋自量為50ug/mI。在聚苯乙烯板的反應孔

中加色0.1ml4℃過夜。次日，棄去孔內溶液，用洗滌緩沖液洗3次、每次3分鐘。

2、加樣：加待檢樣品0.1ml于上述己包被的反應孔中，37c2小時。保溫后如上洗滌三次。同時做空

白對照（空白孔中不加血清），陰性對照（孔中加正常人血清）和陽性對照（孔中加病人陽性血清）。

3、加酶標抗體，各孔中加入新配制醯標記抗體一HBs（一般1：2000到1：8000稀釋0.1mL37℃保溫2

小時，保溫后洗滌3次。

4、加底物顯色：各反應孔中加底物溶液0.1ml,37℃保溫20分鐘。

5、終止反應：各反應孔中加入2NH2so4。0.5mL

四、實驗結果

肉眼觀察：

空白對照與陰性對照孔為無色或接近無色。

陽性對照孔呈深紅棕色。

待檢樣品孔呈色反應即為陽性，

酶聯檢測儀讀取的OD值，可直接作為EL1SA結果報告。

細胞免疫檢測

細胞免疫檢測的主要目的，是對患者的免疫功能進行評價，以輔助疾病的診斷，療效的判斷及對疾病

的預后進行分析。

細胞免疫檢測的王要項目包括淋巴細胞數量和功能的測定。

實驗七T細胞計數

體外測走人外周血中T淋巴細胞數量的方法有多種，以玫理花環試驗最為簡易常用，T淋巴細胞數量的

變化與機體的細胞免疫叨黑狀態有一走關系。臨床上多用于產些疾病的診斷及療效韻觀察。

內容：一、E玫瑰花結試驗

二、Ea玫瑰花結試驗

一、E攻瑰花結試驗

（-）實驗目的與原理

了解E玫瑰花結試驗方法、觀察花結形成現象。

人周圍血液中T淋巴細胞表面有綿羊紅細胞受體，與羊紅細泡相遇時.，在其周圍形

成花環詳細胞團，凡能結合三個以上綿羊紅細胞者稱為E攻瑰花結形成細胞。正常人的

花環形成率為50-70%,大致可以代表周圍血中T細胞的百分數。

（二）實驗材料

1、淋巴細胞分層液（Ficou）。

2、1%綿羊紅細胞。

3、肝素抗凝人血。

4、無鈣鎂Hanks液。

5、水平離心機。

6、0.8%戊二醛。

7,37℃水浴箱。

8、顯微鏡。

9、其他。

（三）實驗方法

1、取肝素抗凝血卜2ml,用分層液分出淋巴細胞并洗滌，用Hanks液調整細胞濃度為2—2.5

2、取小試管加入巴1ml淋巴細胞懸液及1%羊紅細胞0.1,nl?混勻?置37C水浴箱5分鐘。

3、800?1000r/min低速離心5分鐘,放4℃冰箱2小時。

4、輕輕旋轉試管使團塊混勻，加2滴0.8%戈二醛液，搖勻，室溫靜置10分鐘，使F花環固定。

5、取懸液一滴放于載玻片上，將稀釋的瑞氏染液加入玻片上染色3分鐘。

6、棄去染液，待干后油鏡觀察，計數200個淋巴細胞中形成花環的細胞效，算出百分率。

（四）實驗結果

1、淋巴細胞染成深蘭色，羊紅細胞染成淡紅色。

2、每個淋巴拙胞上粘附三個以上羊紅細胞者即為玫瑰花環形成細胞，

二、En攻瑰花結形成試驗（活性E花環形成試驗）

（一）實驗目的與原理

了解Ea花環形成試驗方法、觀察現象。

T淋巴細胞中有不同的異質性亞群，他們對羊紅細胞有不同程度的親合力，形成活性E花環的細胞稱

活性花環形成細胞，它可能是T淋巴細胞中對羊紅細胞有高度親合力的一個亞群，在室溫中幾分鐘即可形

成玫瑰花環。活性E花環形成細胞數可能反映機體的細胞免疫水平。凡能結合三個以上羊紅細胞者稱為

Ea玫瑰花環（活性玫瑰花環）。

（二）、實驗材料（同E玫瑰花結試驗）

（三）、實驗方法

1、制備好的淋巴細胞0.1ml（含30萬個淋巴細胞）置于小試管中。再各加入0.1ml綿

蘭紅細胞（含600萬個羊紅細胞）。再各加入0.05ml小牛血清（最好是五頭小牛血清混合后并經羊紅細胞吸

收過）。

2、混勻后,立即800混000r/min離心5分鐘。

3、離心后，立即將管拿在手中，慢慢旋轉、約1分鐘左右將下沉的細胞搖勻，但不致使花環散開。

4、向小管中加新配制的0.8%戊二醛溶液0.1ml,輕輕搖勻，4℃冰箱中固定15分鐘。

5、取潔凈玻片二張，將固定好的細胞懸液全部吸出，輪流滴在二張玻片上、至滴完為止。用毛細管

將懸液鋪干、待干。

6、用稀釋的瑞氏染液染3分鐘，棄去染液，高倍鏡觀察，如淋巴細胞染或深蘭色，SRBC呈淡紅色時，

用水沖去染液，待干后油鏡計數。二片共汁400個淋巴細胞，算出形成花環細胞占全細胞數的百分率。

（四）實驗結果

淋巴細胞呈深蘭色、SRBC呈淡紅色。每個淋巴細胞上粘附3個SRBC以上，即為攻瑰花環。但SRBC

必須與淋巴細胞膜附著。

實驗八淋巴細胞轉化試驗

T淋巴細胞受到特異性抗原或非特異性抗原（PHA、PWM和ConA）刺激均能使細

胞發生轉化。T淋巴細胞轉化率的高低可反映人體細胞免疫功能水平，常被作為細胞免疫功能指標之一。

淋巴細胞轉化試驗可從周圍血中分離出淋巴細胞，也可采用全血試驗。試驗方法主要有形態學方法和3H

胸腺嗓噬核甘酸dH-TdR）修入法二種。前法簡單易行，不需特殊設備，本試驗介紹這種方法。

一、實驗目的與原理

了解淋巴細胞轉化試驗方法、原理及其臨床意義。

T淋巴細胞有植物血凝素（PHA）受體，在體外受刺激后，可發生形態改變而轉化為淋巴母細胞。用姬姆

薩染色后，計算200個淋巴細胞中轉化為母細胞的細胞數（包括過渡型、母細胞和分裂相淋巴細胞），依

轉比的百分率判定T淋巴細胞的功能。

二、實驗材料

1、正常人淋巴細胞（用分層液分出）。

2、培養液：0.5%水解乳蛋白Hanks氏液（含20%小牛血清和青霉素100單位/ml、鏈霉素100微克/ml）。

用5.6%NaHCC）3調整PH至7.2?7.4。

3、植物血凝素（PHA）。

4、青霉素小瓶、吸管、載玻片、姬姆薩染液等。

三、實驗方法

1、制備細胞懸液:用培養液將淋巴細胞稀釋成2Xl（）6/mi,細胞懸液。

2、分裝：向兩個小瓶中各加2ml,細胞懸液,一瓶加PHA0.1mI1（100單位），另瓶不加作對照。

3、370c培養72小時。離心沉淀，用Hanks液洗兩次。

4、用沉淀推成血片，加姬姆薩染液栗色，鏡下觀察計數200個以上淋巴細胞，算出轉化率。

四、實驗結果

對照管轉化率1%左右，加PHA之管轉化主約為70%左右。

1、成熱的淋巴細胞:與外周血中小淋巴細胞形態一致、直徑6-8微米，核染色質網

密、無核仁、胞漿略大于核貢輕度嗜堿性。

2、過度型淋巴細胞:直徑10—20微米核質密，但有明顯核仁。

3、淋巴母細胞，細胞增大，形態不規則，直徑20?30微米，核也增大，染色質網纖細有核仁1?2個,

胞漿擴大，強嗜堿性可見數個空泡及顆粒。

4、網狀細胞樣母細胞：細胞增，形態不規則，核淡染有1一2個大小不規則的核仁，胞漿擴大、含

空泡，嗜堿性不強有透明感。

實驗九移動抑制試驗

正常淋巴細胞受相應抗原或非特異性刺激物作用時，能產生移動抑制因子(MIF)可用巨噬細胞或白細

胞作為實驗系統中的指示細胞而被檢測出米。前者稱為巨噬細胞移動抑制試驗，后者稱為日細胞移動抑制

試驗，是測定遲發型變態支應的二種常用的體外試驗，也是檢測細胞免辭功能的一個指標。

內容：白細胞移動抑制試驗

一、實驗目的與原理

了解試驗方法、結果測定及其意義

白細咆移動抑制試驗是一種恃異性的體外。免疫試驗。體內玫敏淋巴細胞在相應抗原作用下古生多種

淋巴因子，其中