NAD蘋果酸酶（NAD-ME）活性檢測試劑盒（微量法）原理蘋果酸酶（ME）廣泛存在于微生物、培養細胞、動物和植物胞漿中，尤其在植物組織中活性較高。ME催化蘋果酸氧化脫羧的可逆反應，產生丙酮酸和CO2，以及伴隨NAD(P)+的還原反應，是蘋果酸代謝的關鍵酶。ME活性與生物合成和抗氧化密切相關。根據輔酶專一性和對底物特異性的不同，可將ME分為NAD-ME(EC8)和NADP-ME(EC0)，其中NAD-ME能夠催化NAD+還原成NADH，在340nm下測定NADH的增加速率可反映其活力。包裝清單試劑盒組分規格儲存條件48T96TExtractionBuffer60mL60×2mL4℃ReagentI15mL30mL4℃ReagentIIPowder×1vialPowder×1vial-20℃，避光保存ReagentIIIPowder×1vialPowder×1vial-20℃注意：正式檢測前，建議選擇2-3個預期差異較大的樣本進行預實驗。自備耗材·酶標儀或紫外分光光度計（能測340nm處的吸光度）·96孔UV板或微量石英比色皿、可調節式移液槍及槍頭·恒溫水浴鍋、制冰機、離心機·去離子水·研缽或勻漿器試劑準備ExtractionBuffer：即用型；使用前，平衡到室溫；4℃保存。ReagentI：即用型；使用前，平衡到室溫；4℃保存。WorkingReagentII：臨用前配制；48T加入12mLReagentI，96T加入24mLReagentI，充分溶解待用；用不完的試劑-20℃分裝避光可保存4周，避免反復凍融。WorkingReagentIII：臨用前配制；48T加入1.25mL去離子水，96T加入2.5mL去離子水，充分溶解待用；用不完的試劑-20℃分裝可保存4周，避免反復凍融。樣本制備注意：推薦使用新鮮樣本，如果不立即進行實驗，樣本可在-80℃保存1個月。測定時，應控制解凍的溫度和時間。室溫環境下解凍時，需在4h內完成樣品解凍。動植物組織：稱取約0.1g樣本，加入1mLExtractionBuffer，冰浴勻漿，14,000g，4℃離心10min，取上清液，置冰上待測。細胞或細菌：收集1,000萬細胞或細菌到離心管內，用冷PBS清洗細胞或細菌，離心后棄上清，加入1mLExtractionBuffer，冰浴超聲波破碎細胞或細菌5min（功率20%或200W，超聲3s，間隔7s，重復30次），然后14,000g，4℃離心10min，取上清液，置冰上待測。血清（漿）等液體樣本：直接檢測。注意：1.如需測定蛋白濃度，推薦使用Abbkine貨號：KTD3001的蛋白質定量試劑盒（BCA法）進行樣本蛋白質濃度測定。該試劑盒提取的動植物組織樣本也可以適用于KTB1018的測定。實驗步驟酶標儀或紫外分光光度計預熱30min，調節波長到340nm。紫外分光光度計用去離子水調零。在微量石英比色皿或96孔UV板中加入10μL樣本上清和170μLWorkingReagentII，混勻，30℃孵育5min后，加入20μLWorkingReagentIII，混勻后立即記錄340nm處初始吸光值A1和1min后的吸光值A2，計算ΔA=A2-A1。注意：實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗，如果ΔA小于0.005可將反應時間延長至5min或10min，即繼續記錄340nm處5min或10min后的吸光值并計算相應的ΔA，計算結果中除以實際反應時間。如果ΔA大于0.5，樣本上清液可用ExtractionBuffer進一步稀釋，計算結果乘以稀釋倍數。結果計算注意：我們為您提供的計算公式，包括推導過程計算公式和簡潔計算公式。兩者完全相等。建議以加粗的簡潔計算公式為最終計算公式。A.使用96孔UV板測定的計算公式如下1.按樣本蛋白濃度計算：單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘生成1nmolNADH定義為一個酶活力單位。NAD-ME(U/mgprot)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(Cpr×V樣)÷T=6,431×ΔA÷Cpr2.按樣本鮮重計算：單位的定義：每g組織每分鐘生成1nmolNADH定義為一個酶活力單位。NAD-ME(U/g鮮重)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(W×V樣÷V樣總)÷T=6,431×ΔA÷W3.按細胞或細菌數量計算：單位的定義：每104細胞或細菌每分鐘生成1nmolNADH定義為一個酶活力單位。NAD-ME(U/104)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(1,000×V樣÷V樣總)÷T=6.431×ΔA4.按液體體積計算：單位的定義：每mL樣本每分鐘生成1nmolNADH定義為一個酶活力單位。NAD-ME(U/mL)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷V樣÷T=6,431×ΔAV反總：反應體系總體積，2×10-4L；ε：NADH摩爾消光系數，6.22×103L/mol/cm；d：96孔UV板光徑，0.5cm；109：1mol=1×109nmol；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；T：反應時間，1min；V樣：加入反應體系中樣本體積，0.01mL；V樣總：加入ExtractionBuffer體積，1mL；W：樣本質量，g；1,000：細菌或細胞總數，1,000萬個。使用微量石英比色皿測定的計算公式將上述計算公式中光徑d:0.5cm調整為d:1cm進行計算即可。注意事項實驗時，樣本上清和ReagentII在冰上放置，以免變性和失活。實驗中96孔UV板和石英比色皿中反應液的溫度需保持在30℃。結果展示Figure1.本試劑盒測定石竹葉子和兔腎臟中NAD-ME的活性相關產品CatalogNo.Pro