cDNA文庫構(gòu)建及EST序列分析陳威、丁立建、黃顯軍、劉振英、毛?；ā⑸瞎偾伸`、朱竹君（按姓氏首字母排列，排名不分先后）cDNA文庫與EST序列分析組員任務(wù)分配陳威：統(tǒng)籌安排、資料收集丁立建：cDNA文庫應(yīng)用、資料收集黃顯軍：背景簡介劉振英：cDNA文庫構(gòu)建原理、資料收集毛?；ā⑸瞎偾伸`、朱竹君：EST序列分析cDNA文庫與EST序列分析目錄一、背景簡介二、cDNA文庫構(gòu)建原理三、cDNA文庫的應(yīng)用四、EST序列分析五、參考文獻(xiàn)cDNA文庫與EST序列分析cDNA文庫構(gòu)建及EST序列分析

背景簡介——黃顯軍cDNA文庫與EST序列分析

cDNA基因文庫：

某生物某一發(fā)育時(shí)期所轉(zhuǎn)錄的mRNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄形成的cDNA片段與某種載體連接而形成的克隆的集合。

cDNA文庫與EST序列分析1.cDNA文庫背景簡介1.1cDNA文庫產(chǎn)生前的技術(shù)概況

隨著生物及信息技術(shù)的迅速發(fā)展，尋找新基因、克隆新基因、進(jìn)而研究基因的功能已成為功能基因組研究中的一項(xiàng)重要工作。在過去尋找新基因的方法有：

a）消減雜交

b）mRNA差異顯示

c）cDNA的代表性差異顯示分析法

d）差異消減展示等方法這些方法在新基因的發(fā)現(xiàn)方面都各有其獨(dú)特的優(yōu)勢，可尋找出一些差異表達(dá)序列，但這些差異表達(dá)序列大部分情況都是不完整的基因。cDNA文庫與EST序列分析1.2cDNA文庫的產(chǎn)生

由于以前技術(shù)的缺點(diǎn)，目前，比較可行而且應(yīng)用較多的方法主要是cDNA文庫的篩選。一方面cDNA文庫只代表一定時(shí)期一定條件下正在表達(dá)的基因，是整個(gè)真核基因組中的少部分序列，因此cDNA克隆的復(fù)雜程度比直接從基因組克隆的要小得多。另一方面由于每個(gè)cDNA克隆只代表一種mRNA序列，因此在基因克隆過程中出現(xiàn)假陽性的概率比較低。所以cDNA文庫的構(gòu)建已成為當(dāng)前分子生物學(xué)研究和基因工程操作的基礎(chǔ)。cDNA文庫與EST序列分析1.3.為什么要構(gòu)建cDNA文庫？

cDNA便于克隆和大量表達(dá)，它不像基因組含有內(nèi)含子而難于表達(dá)，因此可以從cDNA文庫中篩選到所需的目的基因，并直接用于該目的基因的表達(dá)。

cDNA文庫與EST序列分析1.4.怎么構(gòu)建cDNA文庫？cDNA文庫與EST序列分析1.5.cDNA文庫構(gòu)建后能干什么？

1)可保護(hù)瀕危珍惜生物資源

2)可以提供構(gòu)建分子標(biāo)記連鎖圖譜的所用探針

3)可以用于分離全長基因進(jìn)而開展基因功能研究cDNA文庫與EST序列分析1.6.cDNA文庫的優(yōu)勢及價(jià)值

1）優(yōu)勢：cDNA在研究具體某類特定細(xì)胞中基因組的表達(dá)狀態(tài)及表達(dá)基因的功能鑒定方面具有特殊的優(yōu)勢。

2）價(jià)值：在個(gè)體發(fā)育、細(xì)胞分化、細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞衰老和死亡調(diào)控等生命現(xiàn)象的研究中具有更為廣泛的應(yīng)用價(jià)值，是研究工作中最常使用到的基因文庫。cDNA文庫與EST序列分析2.EST序列分析背景簡介

克隆全長cDNA序列的傳統(tǒng)途徑：

a)噬斑原位雜交的方法

b)采用PCR的方法缺點(diǎn)：工作量大、耗時(shí)、耗材這些傳統(tǒng)方法已滿足不了人類基因組時(shí)代迅猛發(fā)展的要求。cDNA文庫與EST序列分析2.1.EST序列分析的產(chǎn)生

隨著人類基因組計(jì)劃的開展，在基因結(jié)構(gòu)、定位、表達(dá)和功能研究等方面都積累了大量的數(shù)據(jù)，如何充分利用這些已有的數(shù)據(jù)資源，加速人類基因克隆研究，同時(shí)避免重復(fù)工作，節(jié)省開支，已成為一個(gè)急迫而富有挑戰(zhàn)性的課題擺在我們面前。采用生物信息學(xué)方法延伸表達(dá)序列標(biāo)簽（ESTs）序列，獲得基因部分乃至全長cDNAycg，將為基因克隆和表達(dá)分析提供空前的動(dòng)力，并為生物信息學(xué)功能的充分發(fā)揮提供廣闊的空間。cDNA文庫與EST序列分析2.2.EST技術(shù)的作用價(jià)值EST技術(shù)最常見的用途是基因識別，傳統(tǒng)的全基因組測序并不是發(fā)現(xiàn)基因最有效率的方法，這一方法顯得即昂貴又費(fèi)時(shí)。因?yàn)榛蚪M中只有2%的序列編碼蛋白質(zhì)，因此一部分科學(xué)家支持首先對基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行大規(guī)模測序，即從真正編碼蛋白質(zhì)的mRNA出發(fā)，構(gòu)建各種cDNA文庫，并對庫中的克隆進(jìn)行大規(guī)模測序。

Adams等提出的表達(dá)序列標(biāo)簽的概念標(biāo)志著大規(guī)模cDNA測序時(shí)代的到來。雖然ESTs序列數(shù)據(jù)對不精確，精確度最高為97%，但實(shí)踐證明EST技術(shù)可大大加速新基因的發(fā)現(xiàn)與研究。cDNA文庫與EST序列分析目錄一、背景簡介二、cDNA文庫構(gòu)建原理三、cDNA文庫的應(yīng)用四、EST序列分析五、參考文獻(xiàn)cDNA文庫與EST序列分析cDNA文庫的構(gòu)建——?jiǎng)⒄裼DNA文庫與EST序列分析為什么構(gòu)建cDNA文庫cDNA文庫與EST序列分析真核生物基因結(jié)構(gòu)原核生物有很大差異。

真核生物的基因不能直接在原核生物中表達(dá),只有將加工成熟的mRNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄合成互補(bǔ)的DNA（cDNA），并連接相應(yīng)的原核細(xì)胞表達(dá)控制元件，才能在原核生物中表達(dá)。mRNA的不穩(wěn)定性

真核細(xì)胞的基因通常只有一小部分進(jìn)行表達(dá)，由于mRNA的不穩(wěn)定性，因而對真核基因的表達(dá)和相關(guān)的mRNA研究，一般都是通過對cDNA的研究來進(jìn)行。cDNA文庫與EST序列分析But如何構(gòu)建cDNA文庫cDNA文庫與EST序列分析LOGOcDNA文庫與EST序列分析mRNA的分離制備

寡聚胸苷酸〔oligo(dT)〕纖維素或瓊脂糖親和層析法，在高鹽緩沖溶液中poly(A)＋RNA與oligo(dT)結(jié)合，低鹽緩沖溶液使它們解離。LOGOcDNA文庫與EST序列分析cDNA第一鏈的合成

Oligo（dT）引導(dǎo)的

cDNA合成

高濃度的Oligo（dT）引物與

mRNA的

3'末端的

poly（A）配對。優(yōu)點(diǎn)：逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)基本被限定在以mRNA為模板，故即使樣品中混有少量的rRNA時(shí)不會影響cDNA文庫構(gòu)建的質(zhì)量。缺點(diǎn)：只能從mRNA3‘末端其起始引發(fā)cDNA的合成，由于逆轉(zhuǎn)錄酶的能力有限，平均合成出的cDNA長度在1kb以下，因此合成cDNA通常會缺少mRNA5’端的重要信息。LOGOcDNA文庫與EST序列分析cDNA文庫與EST序列分析隨機(jī)引物引導(dǎo)的

cDNA合成

采用

6－10個(gè)隨機(jī)堿基的寡核苷酸短片段來錨定

mRNA并作為反轉(zhuǎn)錄的起點(diǎn)。由于隨機(jī)引物可能在一條

mRNA鏈上有多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)而從多個(gè)位點(diǎn)同時(shí)發(fā)生反轉(zhuǎn)錄，比較容易合成特長的

mRNA分子的

5‘-端序列。優(yōu)點(diǎn)：克服了oligo(dT)合成cDNA時(shí)缺少5‘-端序列的缺點(diǎn)，能更有效的反映出表達(dá)mRNA全長的序列信息。缺點(diǎn)：對mRNA樣品的純度要求苛刻。cDNA文庫與EST序列分析cDNA第二鏈的合成自身引導(dǎo)法置換合成法PCR法cDNA文庫與EST序列分析LOGO方法一：自身引導(dǎo)法cDNA文庫與EST序列分析LOGO方法二：置換合成法cDNA文庫與EST序列分析方法三：PCR法cDNA文庫與EST序列分析cDNA的克?。?）修飾cDNA兩端（2）cDNA與載體相連（3）導(dǎo)入宿主細(xì)胞:

重組體在一定條件下導(dǎo)入宿主細(xì)胞培養(yǎng)或保存宿主細(xì)胞必須是來自一個(gè)細(xì)胞的克隆體，以保證它們的遺傳性狀相同。

LOGOcDNA文庫與EST序列分析

來，看個(gè)cDNA文庫構(gòu)建的視頻吧cDNA文庫與EST序列分析cDNA文庫構(gòu)建的其他方法固相cDNA文庫

1998年，由Roeder開發(fā)的一種快速高效的cDNA文庫構(gòu)建方法。

它基于傳統(tǒng)的cDNA文庫合成方法，包含通常所需的全部步驟。但在cDNA合成過程中引入了固相支持物。cDNA通過一個(gè)生物素基固定在鏈霉卵白素偶聯(lián)的磁珠上，這樣在反應(yīng)中就可以簡便而迅速的實(shí)現(xiàn)酶和緩沖液的更換，因此它將快速與高質(zhì)量的文庫結(jié)合在一起(構(gòu)建文庫只需一天)，并且構(gòu)建的文庫適合于大多數(shù)的研究目的。cDNA文庫與EST序列分析優(yōu)點(diǎn)：可以簡便cDNA合成的操作。在進(jìn)行緩沖液更換時(shí)既沒有cDNA的丟失之憂，也無其他物質(zhì)污染之憂。另外，用此方法可以得到真實(shí)的代表性文庫，它包含有短小的cDNA，這是因?yàn)樵诳寺≈笆∪チ朔旨壏蛛x的步驟?？傊?，固相法結(jié)合了傳統(tǒng)的cDNA合成的優(yōu)點(diǎn)并彌補(bǔ)了其不足。這種方法簡便易行，可靠低廉，所建文庫高質(zhì)量。cDNA文庫與EST序列分析差示cDNA文庫

差示文庫又稱為扣除文庫，是反映不同組織和細(xì)胞或同一細(xì)胞在不同功能狀態(tài)下，基因表達(dá)差異的cDNA文庫。主要用于研究細(xì)胞的發(fā)育、分化、細(xì)胞周期、細(xì)胞對藥物和生長因子的誘導(dǎo)反應(yīng)以及腫瘤等疾病的研究。

基本流程：分別提取不同組織細(xì)胞或同一種細(xì)胞在不同功能狀態(tài)下細(xì)胞的mRNA，將其中一種細(xì)胞的mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA第一鏈，然后將該cDNA與另一細(xì)胞過量的mRNA進(jìn)行雜交，第一種細(xì)胞中若存在不同于第二種細(xì)胞的特殊基因，則會產(chǎn)生特殊基因的mRNA和cDNA，它們不能與第二種細(xì)胞的mRNA形成雜交體。將未形成雜交體的cDNA分出，合成與之互補(bǔ)的cDNA第二鏈，再以此雙鏈cDNA構(gòu)建cDNA文庫，即差示文庫。cDNA文庫與EST序列分析標(biāo)準(zhǔn)cDNA文庫染色體或區(qū)域特異性cDNA文庫限制性cDNA文庫0ligo—capping方法構(gòu)建cDNA文庫cDNA文庫與EST序列分析——丁立建cDNA文庫與EST序列分析大豆干旱和低溫cDNA文庫的構(gòu)建1三疣梭子蟹血細(xì)胞全長cDNA文庫構(gòu)建2cDNA文庫與EST序列分析研究背景：中國是大豆的起源地,已有4000多年的栽培歷史,研究和利用大豆基因資源具有特殊的意義。本研究以栽培大豆為材料,通過干旱和低溫處理,構(gòu)建cDNA融合表達(dá)文庫,為今后分離抗逆相關(guān)基因和分子育種工作奠定了基礎(chǔ)。cDNA文庫與EST序列分析材料：栽培大豆(Glycinemax)品種為吉林35;大腸桿菌菌株DH5α和酵母菌株YM4271;用于構(gòu)建文庫的試劑盒(購自Stratagene公司);提取總RNA的Trizol試劑盒(購自Invitrogen公司);限制性內(nèi)切酶、T4連接酶、DNA片斷回收試劑盒(均購自大連寶(TaKaRa)生物工程公司)等cDNA文庫與EST序列分析方法與步驟：大豆處理低溫處理:將上述植株置于4℃冰箱中,處理4h;

干旱處理:將上述植株置于恒溫箱中,25℃下處理4hcDNA文庫與EST序列分析總RNA提取和質(zhì)量檢測cDNA雙鏈的合成采用磁珠法從總RNA中分離出mRNA采用試劑盒進(jìn)行文庫的構(gòu)建cDNA文庫的質(zhì)量鑒定cDNA文庫與EST序列分析結(jié)果與分析

總RNA與mRNA的質(zhì)量檢

cDNA文庫與EST序列分析

cDNA文庫插入片段長度的PCR分析cDNA文庫與EST序列分析三疣梭子蟹是我國沿海重要養(yǎng)殖品種之一,近年來養(yǎng)殖病害呈逐年上升趨勢,制約了三疣梭子蟹養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展。為大規(guī)模克隆三疣梭子蟹免疫相關(guān)基因,研究其免疫基因的功能和免疫機(jī)制,構(gòu)建了三疣梭子蟹血細(xì)胞全長cDNA文庫可以提供三疣梭子蟹病害防治理論基礎(chǔ)。為深入研究免疫相關(guān)基因的功能和免疫機(jī)制奠定基礎(chǔ)。研究背景：cDNA文庫與EST序列分析1、三疣梭子蟹采自浙江海域;2、總RNA提取Trizol試劑盒(TrizolPlusRNAPurificationKit)與mRNA分離試劑盒(FastTrack2.0Kit)購自Invitrogen公司;3.、SMARTTMcDNALibraryConstructionKit與Advantage2PCRKit購自Clontech公司;pGEM2TeasyT載體購自Promega公司。其余試劑均為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純試劑。材料：cDNA文庫與EST序列分析FastTrack2.0Kit試劑盒，通過poly(T)纖維素柱進(jìn)行親和層析,從三疣梭子蟹血細(xì)胞總RNA中得polyA+mRNA。成年雄性三疣梭子蟹采集后飼養(yǎng)于恒溫水族箱(25℃)取1只蟹收集血細(xì)胞采用Trizol試劑盒提取三疣梭子蟹血細(xì)胞總RNA.1.2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定,同時(shí)測定OD260和OD280值,分析所提取RNA的濃度和純度。方法：cDNA文庫與EST序列分析轉(zhuǎn)化至高效感受態(tài)細(xì)胞DH10B,在37℃、200r/min培養(yǎng)1h,加入5mL預(yù)冷LB培養(yǎng)基(含25%甘油),即為全長cDNA原始文庫。polyA+mRNA在反轉(zhuǎn)錄酶作用下轉(zhuǎn)錄合成cDNA第1鏈Advantage2PCRKit(Clontech)試劑盒作用下合成cDNA第2鏈,并取5μL凝膠電泳檢測通過ChromaSPIN2400分級分離,除去小于500bp的片段處理后的dscDNA與載體pGEM2TEASY在16℃過夜連接cDNA文庫與EST序列分析cDNA文庫的質(zhì)量鑒定與隨機(jī)測序文庫滴度的鑒定文庫重組率及平均插入片段的鑒定部分序列測定及分析cDNA文庫與EST序列分析總RNA電泳分析

方法：cDNA文庫與EST序列分析克隆插入片段的PCR檢測cDNA文庫與EST序列分析丁立建cDNA文庫與EST序列分析EST序列分析原理方法應(yīng)用——毛?；?、上官巧靈、朱竹君cDNA文庫與EST序列分析ESTs（Expressed

Sequence

tags

）是從已建好的cDNA庫中隨機(jī)取出一個(gè)克隆，從5’末端或3’末端對插入的cDNA片段進(jìn)行一輪單向自動(dòng)測序，所獲得的約60-500bp的一段cDNA序列。BACK原理cDNA文庫與EST序列分析分析EST序列的目的獲得EST序列的方法分析EST序列的方法如何提交EST序列BACK方法cDNA文庫與EST序列分析分析EST序列的目的基因識別獲得全長cDNA研究基因可變剪接類型SNP的發(fā)現(xiàn)表達(dá)量比較applicationBACKcDNA文庫與EST序列分析獲得EST序列的方法從數(shù)據(jù)庫下載dbESTCGAPUniGeneTigrGeneIndexcDNA文庫測序BACKcDNA文庫與EST序列分析分析EST序列的方法RawESTPre-processingclusteringAssemblyAnnotationEST分析流程cDNA文庫與EST序列分析1.RawEST從cDNA文庫隨機(jī)挑取單一克隆進(jìn)行5’或3’端測序；測序方向的選擇，根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇不同的測序方向：◆

5’端

5’上游非翻譯區(qū)校短且含有較多的調(diào)控信息。一般在尋找新基因或研究基因差異表達(dá)時(shí)用5’端EST較好，大部分EST計(jì)劃都是選用5’端進(jìn)行測序的，而且從5’端測序有利于將EST拼接成較長的基因序列。◆

3’端

3’端mRNA有一20－200bp的plyA結(jié)構(gòu)，同時(shí)靠近plyA又有特異性的非編碼區(qū)，所以從3’端測得EST含有編碼的信息較少．但研究也表明，10％的mRNA3’端有重復(fù)序列，這可以作為SSR標(biāo)記；非編碼區(qū)有品種的特異性，可以作為STS標(biāo)記．◆兩端測序獲得更全面的信息。cDNA文庫與EST序列分析2.Pre-processing去除低質(zhì)量的序列（Phred）

應(yīng)用BLAST、RepeatMasker或Crossmatch遮蔽數(shù)據(jù)組中不屬于表達(dá)的基因的贗象序列(artifactual

sequences)●載體序列()●重復(fù)序列(RepBase,)

●污染序列

(如核糖體RNA、細(xì)菌或其它物種的基因組DNA等)

去除其中的鑲嵌克隆。

最后去除長度小于100bp的序列。cDNA文庫與EST序列分析鑲嵌克隆的識別

?

Back-to-back

poly(A)+

tails?

Linker-to-linker

in

middle

of

the

seq-uence?

Blastn/Blastx

searchcDNA文庫與EST序列分析3.Clustring聚類作用：※產(chǎn)生較長的一致性序列(consensus

sequence)

，用于注釋※降低數(shù)據(jù)的冗余，糾正錯(cuò)誤數(shù)據(jù)※可以用于檢測選擇性剪切ESTs聚類的數(shù)據(jù)庫主要有三個(gè)：UniGene

()

TIGR

Gene

Indices

()

STACK

()

聚類的目的就是將來自同一個(gè)基因或同一個(gè)轉(zhuǎn)錄本的具有重疊部分(over－lapping)的ESTs整合至單一的簇(cluster)中。cDNA文庫與EST序列分析常用的拼接軟件◆

Phrap

ap.cfm◆

CAP3(Xiaoqiu

Huang,huan)

◆

d2_cluster

()cDNA文庫與EST序列分析錯(cuò)拼漏拼的原因錯(cuò)拼

3‘?dāng)鄍olyA尾巴的存在鑲嵌clone的存在重復(fù)序列漏拼拼接參數(shù)太嚴(yán)格重復(fù)序列鑲嵌clonecDNA文庫與EST序列分析解決方法調(diào)整拼接參數(shù)EST和consensus進(jìn)行對比根據(jù)注釋結(jié)果來判斷cDNA文庫與EST序列分析4.Cluster的連接

利用cDNA克隆的信息和5’，3’端Reads的信息，不同的Cluster可以連接在一起。cDNA文庫與EST序列分析5.基因注釋注釋：◆序列聯(lián)配

，一級序列同源對比Blastn，

Blastx

◆蛋白質(zhì)功能域搜索(二結(jié)構(gòu)比對)

，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域和功能位點(diǎn)預(yù)測Pfam

InterprocDNA文庫與EST序列分析后續(xù)分析

比較基因組學(xué)分析基因表達(dá)譜分析新基因研究基因可變剪切分析實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

?

MicroArray

?

GeneChip

?

RTPCR

?

Northen

blotingBACKcDNA文庫與EST序列分析如何提交EST序列提交至dbEST?發(fā)郵件至batch-su?準(zhǔn)備以下文件a.Publicationb.Libraryc.Contactd.ESTbackcDNA文庫與EST序列分析應(yīng)用Goal日本血吸蟲（中國大陸株）表達(dá)基因的分離和ＥＳＴ序列測定３cDNA文庫與EST序列分析研究背景1995年，F(xiàn)anco首先應(yīng)用EST法對曼氏血吸蟲(Sm)

的基因進(jìn)行了分離和序列測定。到目前為止(