6.生物技術與工程(分值:65分)學生用書P257

1.(2024·湖南衡陽模擬)(10分)為調查某地人工湖的水質狀況,科研小組進行了該湖水樣中的細菌培養、分離及計數等工作。回答下列問題。(1)在細菌培養時,培養基中能同時提供碳源、氮源的成分是(填“蛋白胨”“葡萄糖”或“NaNO3”)。通常,制備培養基時要根據所培養細菌的不同來調節培養基的pH,其原因是

。

(2)通常采用法檢測水樣中細菌含量。在接種前應隨機取若干滅菌后的空白平板先行培養一段時間,這樣做的目的是。

(3)在進行樣品稀釋時,取10g水樣,加稀釋得到101倍稀釋液,再從中吸取(操作過程)得到102倍稀釋液,依次類推獲得105倍稀釋液,在該稀釋液倍數下,取3個平板分別接種樣品溶液0.1mL,培養一段時間后,平板上長出的菌落數分別是156、178、191,則每克樣品中的細菌數量為個。

(4)科研人員將得到的菌株接種到液體培養基中并混勻,一部分進行靜置培養,另一部分進行振蕩培養。結果發現,振蕩培養的細菌比靜置培養的細菌生長速度快。主要原因可能是

(寫出2點即可)。

答案(1)蛋白胨不同細菌生長繁殖所需的最適pH不同(2)稀釋涂布平板檢查培養基平板滅菌是否合格(3)90mL無菌水1mL注入9mL無菌水中1.75×108(4)振蕩培養能提高培養液的溶解氧含量;振蕩培養可使菌體與培養液充分接觸,提高培養液中營養成分的利用率解析(1)葡萄糖只能為細菌提供碳源,NaNO3為細菌提供無機鹽,而蛋白胨既可以為細菌提供碳源,也可以為細菌提供氮源。不同的細菌生長繁殖的最適宜pH是不同的,因此制備培養基時要根據所培養的細菌的不同來調節培養基的pH。(2)檢測水樣中細菌含量通常采用稀釋涂布平板法。在接種前應隨機取若干滅菌后的未接種平板先行培養一段時間,以檢查平板滅菌是否合格。(3)在進行樣品稀釋時,取10g水樣,加90mL無菌水稀釋得到101倍稀釋液,再從中吸取1mL注入9mL無菌水中得到102倍稀釋液。在105倍的稀釋倍數下,取3個平板分別接種樣品溶液0.1mL,培養一段時間后,平板上長出的菌落數分別是156、178、191,每個平板中的平均菌落數為175個,則每克樣品中的細菌數量為175×10×105=1.75×108(個)。(4)振蕩培養的細菌比靜置培養的細菌生長速度快,主要原因可能是振蕩培養能提高培養液的溶解氧含量;振蕩培養可使菌體與培養液充分接觸,提高培養液中營養成分的利用率。2.(2024·廣東廣州二模)(10分)癌癥的免疫療法通過重新激活抗腫瘤的免疫細胞,克服腫瘤的免疫逃逸,科研人員在不斷研究中發現多種免疫治療方法的結合是提高治療效果的途徑之一。請回答下列問題。圖1圖2(1)免疫系統能夠識別和清除突變的細胞,這體現了免疫系統的功能。

(2)由于基因突變,癌細胞表面物質發生改變,如某些種類癌細胞表面高表達膜蛋白PSMA和PDL1。圖1中PDL1能抑制T細胞的活化,使癌細胞發生免疫逃逸。臨床上可利用PD1的單克隆抗體進行癌癥治療,據圖1推測,其原因是

。

(3)CD28是T細胞表面受體,T細胞的有效激活依賴于CD28在癌細胞與T細胞結合部位的聚集。因此,科研人員嘗試構建既能結合PSMA又能結合CD28的雙特異性抗體PSMA×CD28,誘導T細胞定向殺傷癌細胞,如圖2所示。制備過程:先將分別注射到小鼠體內,分離出B淋巴細胞,誘導其與小鼠的骨髓瘤細胞融合,篩選得到,再誘導兩種細胞融合。成功融合的細胞會表達兩種L鏈和兩種H鏈,由于會產生多種抗體,因此還需進行篩選,才能獲得所需的雙特異性抗體PSMA×CD28。

(4)科研人員將癌細胞和T細胞共同培養,加入不同抗體,比較不同抗體對T細胞活化的作用。實驗各組由活化T細胞產生的細胞因子IL2含量如圖3所示,實驗結果說明

。

圖3答案(1)免疫監視(2)PD1的單克隆抗體與PD1結合,阻斷了PD1和PDL1的結合,避免PDL1抑制T細胞的活化(3)PSMA、CD28兩種雜交瘤細胞L鏈和H鏈隨機組合(4)PSMA×CD28和PD1單抗聯合使用能夠顯著激活T細胞,且在一定范圍內激活作用隨PSMA×CD28濃度的增加而增強;單獨使用PSMA×CD28或PD1單抗都不能顯著激活T細胞(合理即可)解析(1)免疫系統能夠識別和清除突變的細胞,這體現了免疫系統的免疫監視功能。(2)圖1中癌細胞表面的PDL1和T細胞表面的PD1結合,抑制T細胞的活化。PD1的單克隆抗體與PD1特異性結合,阻斷了PDL1和PD1的結合,避免PDL1抑制T細胞的活化。(3)制備雙特異性抗體PSMA×CD28,則抗原是CD28和PSMA,將兩種物質分別注射到小鼠體內,分離出兩類B淋巴細胞,將這兩類B淋巴細胞分別和小鼠的骨髓瘤細胞融合,形成雜交瘤細胞,再誘導雜交瘤細胞融合。成功融合的細胞會表達兩種L鏈和兩種H鏈,所需的雙特異性抗體PSMA×CD28是特定的L鏈和H鏈結合形成的,由于L鏈和H鏈隨機組合,因此還需要進行篩選,才能獲得所需的抗體。(4)分析圖3可知,自變量是抗體種類,PSMA×CD28+PD1單抗聯合使用能夠顯著激活T細胞,且在一定范圍內激活作用隨PSMA×CD28濃度的增加而增強;單獨使用PSMA×CD28或PD1單抗都不能顯著激活T細胞。3.(2024·湖南卷)(13分)百合具有觀賞、食用和藥用等多種價值,科研人員對其進行了多種育種技術研究。回答下列問題。圖a圖b圖c(1)體細胞雜交育種。進行不同種百合體細胞雜交前,先用去除細胞壁獲得原生質體,使原生質體融合,得到雜種細胞后,繼續培養,常用(填植物激素名稱)誘導愈傷組織形成和分化,獲得完整的雜種植株。

(2)單倍體育種。常用的方法來獲得單倍體植株,鑒定百合單倍體植株的方法是。

(3)基因工程育種。研究人員從野生百合中獲得一個抵抗尖孢鐮刀菌侵染的基因L,該基因及其上游的啟動子pL和下游的終止子結構如圖a。圖b是一種Ti質粒的結構示意圖,其中基因gus編碼GUS酶,GUS酶活性可反映啟動子活性。①研究病原微生物對L的啟動子pL活性的影響。從圖a所示結構中獲取pL,首先選用酶切,將其與相同限制酶酶切的Ti質粒連接,再導入煙草。隨機選取3組轉基因成功的煙草(P1、P2和P3)進行病原微生物脅迫,結果如圖c。由此可知,三種病原微生物都能誘導pL的活性增強,其中的誘導作用最強。

②現發現栽培種百合B中也有L,但其上游的啟動子與野生百合不同,且抗病性弱。若要提高該百合中L的表達量,培育具有高抗病原微生物能力的百合新品種,簡要寫出實驗思路:

。

答案(1)纖維素酶和果膠酶生長素和細胞分裂素(2)花藥離體培養利用顯微鏡觀察根尖有絲分裂中期細胞中染色體的數目(3)①HindⅢ、BamHⅠ交鏈格孢②利用轉基因技術將百合B中L基因的啟動子替換為野生百合中L基因的啟動子pL解析(1)因植物細胞細胞壁的成分主要是纖維素和果膠,而酶具有專一性,因此獲得原生質體的方法是用纖維素酶和果膠酶對植物細胞進行處理,得到原生質體后使原生質體融合,形成雜種細胞,再用生長素和細胞分裂素誘導愈傷組織形成和分化,從而獲得完整的雜種植株。(2)獲得單倍體植株常用花藥(花粉)離體培養法。細胞有絲分裂中期,染色體形態穩定,數目清晰,便于觀察,故鑒定百合單倍體植株的方法是利用顯微鏡觀察根尖有絲分裂中期細胞中染色體的數目,如果染色體數目減少一半,則獲得的植株為單倍體植株。(3)根據目的片段以及質粒上限制酶的識別位點可知,若要獲得pL并連接到質粒上,可選用限制酶HindⅢ、BamHⅠ進行酶切,以替換Ti質粒中的啟動子,從而達到根據GUS酶活性反映啟動子活性的目的。根據圖c的結果可知,交鏈格孢處理的每一組轉基因煙草中的GUS酶活性都最高,可確定其誘導作用最強。欲培育具有高抗病原微生物能力的百合新品種,可利用轉基因技術將百合B中L基因的啟動子替換為野生百合中L基因的啟動子pL。4.(2024·湖南懷化二模)(12分)抗菌肽是一類具有廣譜抗菌、抗病毒等功能的小分子多肽,細菌不易對其產生耐藥性且無殘留等,被認為是理想的抗生素替代品。為了突破抗菌肽在畜禽養殖業廣泛應用的瓶頸,我國研究人員運用小分子泛素蛋白(SUMO)融合技術將含有重組抗菌肽LLv基因的質粒導入大腸桿菌,表達融合蛋白SUMOLLv,并優化了表達條件,從而能高效獲得重組抗菌肽LLv。所用質粒含有卡那霉素抗性基因(KanR)、LacZ基因及SacⅠ、XhoⅠ酶切位點等,其結構和構建重組質粒的過程如圖1所示。據此分析回答以下問題。圖1圖2注:LacZ基因編碼產生的β半乳糖苷酶可以分解Xgal產生藍色物質,使菌落呈現藍色;否則菌落為白色。(1)擴增LLv基因時,PCR反應體系中含有的酶有;已知該基因序列不含圖1中限制酶的識別序列,為了使其能與已被酶切的質粒連接,需根據設計引物。

(2)LLv基因以a鏈為轉錄模板鏈,轉錄時mRNA自身的延伸方向為5'→3'。該基因內部沒有SacⅠ、XhoⅠ這兩種酶切位點。圖1中酶切位點1和2所對應的酶分別是。

(3)將重組質粒導入大腸桿菌時,需用CaCl2處理大腸桿菌,其目的是

。

(4)為了將成功導入重組質粒的大腸桿菌篩選出來,甲同學在添加了卡那霉素、Xgal等成分的培養基中進行接種,結果如圖2,該同學采用的接種方法是。圖2中出現的菌落即成功導入重組質粒的大腸桿菌菌落,判斷的理由是

。

答案(1)耐高溫的DNA聚合酶LLv基因兩端的部分核苷酸序列和SacⅠ、XhoⅠ的識別序列(2)XhoⅠ、SacⅠ(二者順序不可調換)(3)使大腸桿菌變為感受態細胞,便于從周圍環境吸收DNA分子(4)稀釋涂布平板法白色目的基因(或LLv基因)的插入破壞了LacZ基因的結構,使其不能正常表達形成β半乳糖苷酶,不能分解底物Xgal產生藍色物質解析(1)PCR技術的基本原理是在模板DNA、引物和四種脫氧核糖核苷酸存在下,依賴于TaqDNA聚合酶的酶促合成反應,即擴增LLv基因時,PCR反應體系中含有的酶有耐高溫的DNA聚合酶。PCR過程需要兩種引物,能分別與目的基因兩條鏈的3'端通過堿基互補配對結合。目的基因需要與質粒進行連接,但已知LLv基因序列不含圖1中限制酶(SacⅠ、XhoⅠ)的識別序列,為了使LLv基因能與被酶切的質粒連接,需要根據LLv基因兩端的部分核苷酸序列和SacⅠ、XhoⅠ的識別序列設計引物。(2)LLv基因以a鏈為轉錄模板鏈,轉錄時mRNA自身的延伸方向為5'→3',DNA模板被轉錄方向是從3'→5',即圖1中酶切位點1對應的酶為XhoⅠ,酶切位點2對應的酶為SacⅠ。(3)將目的基因導入微生物細胞,常用Ca2+處理微生物,使微生物細胞處于感受態,便于從外界環境吸收DNA分子。(4)分析菌落分布可知,采用的接種方法是稀釋涂布平板法。為了將成功導入重組質粒的大腸桿菌篩選出來,甲同學在添加了卡那霉素、Xgal等成分的培養基中進行接種,目的基因(LLv基因)的插入破壞了LacZ基因的結構,使其不能正常表達形成β半乳糖苷酶,底物Xgal不會被分解,不能產生藍色物質使菌落為白色,因此圖2中出現的白色菌落即成功導入重組質粒的大腸桿菌菌落。5.(2024·山東濟寧二模)(10分)某種小麥的雄性不育由核基因M控制,其整個花藥在發育早期停止發育進程,因此其雄性不育比較徹底。研究發現所有的雄性不育植株都特異性地攜帶了TRIM序列,且M及其等位基因的編碼區相同;為研究該序列與雄性不育之間的關系,科研人員在野生型小麥中獲得了M等位基因的啟動子并利用Ti質粒構建表達載體,表達載體TDNA部分結構如圖1所示,GFP表達后會發出綠色熒光。將不同表達載體轉入幼胚獲得轉基因小麥,分別對核不育小麥、野生型小麥及轉基因小麥的表型和M基因表達情況進行檢測,部分結果如表。圖1組別實驗材料載體組成Ⅰ、Ⅱ植株表型M基因表達情況第一組核不育小麥無雄性不育eg第二組野生型小麥無可育fg第三組野生型小麥ad死亡第四組野生型小麥①

②

eg注:a.通用的強啟動子;b.M等位基因啟動子;c.插入TRIM序列的M等位基因啟動子;d.M編碼區;e.僅在花藥發育早期表達;f.在花藥發育各時期均不表達;g.在根、莖、葉、雌蕊中均不表達。(1)表中①處應分別選擇(填表注中字母序號),②處植株表型是,結果發現在存活的轉基因小麥花藥中均能檢測到綠色熒光。根據實驗結果推測,導致雄性不育的原因是

。

(2)實驗過程中(填“需要”或“不需要”)設置將bd導入野生型小麥的實驗組,理由是

。

(3)科研人員為檢測(1)中TDNA插入受體細胞染色體中的位置,利用反向PCR技術對插入位點兩側序列進行了分析,過程如圖2。已知TDNA的一條單鏈序列為:5'GCAATGCGTAGCCTCT……AACTATGCGCTCATGA3'(虛線處省略了部分核苷酸序列)。應選下列引物中的(填序號)用于步驟Ⅲ,引物的作用是

。

A.5'CGCGAGTACT3'B.5'GCGCTCATGA3'C.5'CGTAGCCTCT3'D.5'TACGCATTGC3'圖2答案(1)c、d雄性不育TRIM序列的插入引起啟動子序列改變,導致M基因在花藥發育早期表達(2)不需要野生型小麥本身具有bd,不需要另外導入(3)BD使DNA聚合酶能夠從引物的3'端開始連接脫氧核苷酸解析(1)本實驗的目的是研究TRIM序列與雄性不育之間的關系,因此野生型小麥需要選擇插入TRIM序列的M等位基因啟動子,即c,TRIM序列的M等位基因啟動子的作用是啟動M基因的表達,因此在構建載體組成Ⅰ、Ⅱ時需要在插入TRIM序列的M等位基因啟動子之后加入M編碼區,故表中①處應分別選擇c、d。已知所有的雄性不育植株都特異性地攜帶了TRIM序列,且第一組實驗結果和第四組的實驗結果中M基因表達情況是相同的,因此②處植株表型是雄性不育。第二組實驗野生型小麥M基因在花藥發育各時期均不表達,在根、莖、葉、雌蕊中均不表達,而第四組和第一組雄性不育植株中M基因僅在花藥發育早期表達,在根、莖、葉、雌蕊中均不表達,綜上推測導致雄性不育的原因是TRIM序列的插入引起啟動子序列改變,導致M基因在花藥發育早期表達。(2)由于野生型小麥本身具有bd,不需要另外導入b和d。(3)反向PCR技術指的是擴增TDNA的兩側序列,以TDNA的一條單鏈序列5'GCAATGCGTAGCCTCT……AACTATGCGCTCATGA3'為模板,擴增其5'一側序列,因此對應的引物是5'TACGCATTGC3',以TDNA的另一條單鏈序列3'CGTTACGCATCGGAGA……TTGATACGCGAGTACT5'為模板,擴增其5'一側序列,因此對應的引物是5'GCGCTCATGA3',故選BD。引物的作用是使DNA聚合酶能夠從引物的3'端開始連接脫氧核苷酸。6.(2024·湖南衡陽三模)(10分)真核生物轉錄起始過程十分復雜,RNA聚合酶往往需要與一類特定的蛋白質結合,并在其引導下與啟動子結合起始轉錄,我們將這類蛋白稱作轉錄因子。某科研團隊在對山葡萄的研究過程中發現其Va基因具有編碼轉錄因子作用,并對此展開研究。(1)研究人員欲利用PCR技術從山葡萄基因組DNA中提取并擴增Va基因,除基因組DNA和引物外還需向PCR儀中加入

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(2)研究人員設計并合成如圖所示4種可與Va基因結合的引物,結果無論是哪對引物均擴增出了除Va基因外的其他DNA片段,原因可能是。在利用現有引物的前提下,為盡可能減少非目的片段的產生,可先加入引物進行初次擴增,再以初次擴增產物為模板,并加入引物進行第二次擴增。

(3)為進一步驗證Va基因的轉錄激活功能,科研人員利用pG載體首先構建了重組質粒,導入敲除GAL4基因的酵母AH109菌株中,如下圖所示。GAL4基因可編碼酵母中具有轉錄激活功能的蛋白,AH109菌株為色氨酸、組氨酸缺陷