4505TechnicalspecificationforecologicI前言 III 12規范性引用文件 13術語和定義 14海域選擇 24.1自然條件 24.2海水理化條件 25物種選擇 26種苗培育及苗種要求 27苗種檢驗檢疫 27.1檢驗資質機構要求 27.2抽檢原則與數量要求 37.3檢驗內容與方法 38生態增殖 38.1苗種的適應性馴化及優選 38.2苗種運輸方法 38.3底播增殖 49增殖容量 410貝類豐度監測 4 410.2潛水斷面設置 410.3豐度監測與計算 411效果評估 411.1基于貝類豐度的增殖效果評估 4 511.3基于增殖群體回捕占比率的增殖效果評估 5 6附錄A(規范性)貝類生態增殖放流情況記錄表 7附錄B(資料性)基于環境DNA的貝類豐度計算 8B.1特異性qPCR擴增引物設計 8 8 8 8附錄C(資料性)基于微衛星分子標記的貝類增殖群體回捕占比率計算 C.6貝類回捕抽樣樣本的遺傳區分及回 本文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結構和起草規則》的規定1島礁貝類生態增殖技術規范GB/T12763.6海洋調查規范第6部分：海洋SC/T9401.6水生生物增殖放流技術規程第6部SC/T9401.11水生生物增殖放流技術規程第11部分：投放農業部公告第1125號一、二、三類動物疫病病種目錄（水生動生態增殖ecologicalenhanc適應性馴化adaptivedome通過播撒底棲生物苗種到適合的海底生境中，利用天然生產力增加放流種群產量的過從環境樣本中提取的所有DNA的集合，包括環境微生物以及從生物體上脫落下來的活細胞DNA和因24海域選擇類的貝類，篩選確定貝類生態增殖的海域。增殖海域應生態環4.2海水理化條件表1增殖海域海水理化因子要求5物種選擇馬氏珠母貝(P.fucata)、珠母貝(P.margaritifera)、企鵝珍珠貝(Pteriapenguin)、雜色鮑(Haliotisdiversicolor)、塔形馬蹄螺(Trochuspyramis)和福建牡蠣(Crassostreaangulata)。6種苗培育及苗種要求6.1參照SC/T216.2用于生態增殖的貝苗應活力強、外觀無損傷、無畸形、規格整齊。規格應符合表2的要求。表2生態增殖貝類苗種規格中規格7苗種檢驗檢疫3規格合格率≥90%以上，死亡個體比例、傷殘率生動物疫病病種8生態增殖b)投放貝類小規格苗種10000個或中規格苗種4000個或大規格苗種2000個，每10m2投放與貝類苗種等規格的蟹5只，在底播生態增殖前對貝類苗種進行為期7d的躲避天敵能力的適應性c)第8d不投喂飼料，只進行大量換水，并進行吸底，以去除貝苗的排泄物。8.2.1水運法一般采用水車，在車內用空調將溫度控制在20℃~30℃,車內配備充氣裝置及降溫設備，運輸時間宜控制在48h以內，運輸時間大于48h時，需就地暫養后再進行運輸。8.2.2干運法8.2.2.1充氣干運法：適合短途運輸。將貝類苗種放入雙層塑料袋內，密度控制在小規格貝苗150個/L或中規格貝苗100個/L或大規格貝苗50個/L,注入純氧后，將塑料袋放入泡沫箱內，密封。將泡沫箱放入轉運框中，蓋上頂蓋以防貝類逃逸。運輸時間宜控制在10h以內。8.2.2.2非充氣干運法：適合部分牡蠣苗種的短途運輸。此方法一般用濕毛巾覆蓋在苗種上，保持苗4貝類苗種宜在每年的3～12月進行底播。選擇晴朗、多云或陰天進行貝類底播生態增殖，海面最大風力≤5級，氣溫≤35℃。采用本文件8.2中的方法將貝類苗種運輸至底播預定海域。船速：2m/s~4m/s,投放密度：0.1個/m2~0.2個/m2,苗種底播按照SC/T9401.11中的方法進行，記錄投放中心位點的經緯度、投放數量和覆蓋范圍，填寫貝類增殖放流情況記錄表(見附錄A)。不超過增殖海域歷史上礁棲貝類最大捕撈產量的2倍。按GB/T12763.6的規定進行潛水員配備和設備準備。10.2潛水斷面設置在生態增殖海域每平方公里設置1個監測斷面，斷面應均勻分布于增殖海域，每個斷面寬1.2m,直線距離50m,斷面設置方法為：在監測海域內，通過潛水設定起點，沿礁石走向拉皮尺至終點，起點到終點總距離為50m。10.3豐度監測與計算潛水員沿皮尺方向進行斷面內貝類調查，觀察到的貝類個體均計入貝類數量，并根據貝類形態辨別貝類種類，進行斷面內貝類數量統計。調查海域的貝類豐度計算見公式(1):式中：A調查海域的貝類豐度，單位為個/hm2;S第i個斷面內觀察到的貝類數量，單位為個。11效果評估11.1基于貝類豐度的增殖效果評估11.1.1生態增殖實施一年后，潛水調查貝類豐度，基于貝類豐度的生態增殖效果評估值(Ro)計算見5公式(2):Re=[(Ae?-Ae?)/Aq?]×100%……2)增殖效果評估分級優良差B),基于環境DNA的貝類生態增殖效果評估值(RE)計算見公式(3):增殖效果評估分級優良差增殖效果評估分級優良差67pH8分別針對所有用于生態增殖的貝類種類的線粒體COI基因或基因組DNA特異區域設計種特異性qPCRST——質粒濃度，單位為拷貝/μL；CON——質粒檢測濃度，單位為μg/μL；NT——質粒堿基數量，單位為bp。用本文件B.1設計的特異性引物進行qPCR擴增，以測得的擴增循環數(Ct值)為縱坐標，以質粒濃度的對使用標準采水器收集貝類生態增殖海域的底層海水，每個點采集膜對底層海水進行過濾，剪碎濾膜，采用海洋動物組織基因組DNA提取試劑盒對濾膜上的生物樣本進行B.4.2環境DNA的qPCR擴增及增殖種擴增體系為20μL，測量樣品Ct值，通過標準曲線，求得Ct值9在調查海域至少設置采樣點6個，采集采樣點海域的底層海水500mL，提取環境DNA，并按照本文件B.4.2的方法對樣品中生態增殖種類貝類的DNA進行定量，底層海水中生態增殖種類貝類DNA豐度的計算）：a——生態增殖的貝類種類個數；AEij——調查海域第i個采樣點底層海水中第j種生態增殖種類貝類DNA豐度，單位為拷貝/mL。樣本采集后，用剪刀剪取一塊200mg～500mg的貝類體壁組織，置于10mL離心管中，加入5mL95%采用常規的海洋動物組織基因組DNA提取試劑盒提取貝類樣本DNA，DNA濃度≥50ng/μL，對于每個用于生態增殖的貝類種類，分別篩選具有種特異性的高度多態性SSR標記。篩選方法為：采集不同地理分布的各種貝類群體，進行基因組測序并利用MISA軟件分別查找具有地理差異的各種貝組中分別篩選出20個～30個具有高度多態性C.6貝類回捕抽樣樣本的遺傳區分及回捕占利用本文件C.5的分型結果，通過GenAIEx6.51b2和原生種群間的遺傳距離，如某一種類貝類回捕抽樣樣本與該種類增殖苗種群體具有相似的分子遺傳特征，且