微生物學實驗技術乳酸菌的分離與純化三、實驗器材：菌種來源：市場銷售的各種新鮮酸乳培養基：BGC牛乳培養基乳酸菌培養基蛋白胨水培養基糖發酵培養基BGC牛乳培養基（A）溶液：脫脂乳粉100g，水500mL，加入1.6%溴甲酚綠(B.G.C)乙醇溶液1mL,80℃滅菌20min。（B）溶液：酵母膏10g，水500mL，瓊脂20g，pH6.8,121℃滅菌20min。以無菌操作趁熱將（A）、（B）溶液混合均勻后倒平板。乳酸菌培養基牛肉膏5g，酵母膏5g，蛋白胨10g，葡萄糖10g，乳糖5g，氯化鈉5g，水1000mL，pH：6.8；1.6%溴甲酚綠蛋白胨水培養基蛋白胨10g，氯化鈉5g，水1000mL，pH：7.2~7.4糖發酵培養基蛋白胨水培養基1000mL，1.6%溴甲酚紫乙醇溶液1~2mL，pH：7.6，另配20%糖溶液（葡萄糖，蔗糖）各10mL。制法：1）將上述含指示劑的蛋白胨水培養基（pH：7.6）分裝于試管中，在每管內放一倒置的小玻璃管。2）將已分裝好的蛋白胨水培養基和20%的各種糖溶液分別滅菌，蛋白胨水培養基121℃滅菌20min，糖溶液112℃滅菌30min。3)滅菌后，每管以無菌操作分別加入20%的糖溶液0.5mL，則成1%的濃度。有關溶液：1.6%溴甲酚紫乙醇溶液：溴甲酚紫1.6g溶于100mL乙醇中，貯存于棕色瓶中保存備用。吲哚試劑：對二甲基氨基苯甲醛8g，95%乙醇760mL，濃鹽酸160mL。10%硫酸2%高錳酸鉀含氨的硝酸鹽溶液：稱取硝酸銀2g，蒸餾水100mL，待硝酸銀溶解后，取出10mL備用，向其余的90mL硝酸銀中滴加氨水，即可形成很厚的沉淀，繼續滴加氨水至沉淀剛剛溶解成為澄清溶液為止，再將備用的硝酸銀慢慢滴入，則溶液出現薄霧，但輕輕搖動后，薄霧狀的沉淀又消失，繼續滴入硝酸銀，直到搖動后仍呈現輕微而穩定的薄霧狀沉淀為止。四、操作步驟：（一）乳酸菌的分離純化

1.稀釋分離培養基的配制滅菌倒平板制備樣品稀釋液接種（涂布法）培養每組準備下列器材（滅菌）

1.培養基A溶液（250ml三角瓶，內裝125ml）2.培養基B溶液（250ml三角瓶，內裝125ml）3.試管7支（內裝9ml水）4.培養皿一包（9個）5.1ml刻度吸管7支2mL，分別接入BGC牛乳培養基瓊脂平板上，用無菌玻璃刮刀依次涂布，置40℃培養48h，如出現圓形稍扁平的黃色菌落及其周圍培養基變黃者初步定為乳酸菌。（A）溶液：脫脂乳粉100g，水500mL，加入1.也證明此菌種不是大腸桿菌，因為如果是大腸桿菌除了產酸反應結果為陽性外，而且杜氏小管內會有氣泡，因為大腸桿菌具有分解葡萄糖和蔗糖產酸并產氣的能力。每組準備下列器材（滅菌）（B）溶液：酵母膏10g，水500mL，瓊脂20g，pH6.（一）乳酸菌的分離純化如果培養液呈黃色，反映結果為陽性。在吲哚試驗中，加入菌種的試管無任何變化，證明為陰性反應培養液中的杜氏小管內有氣泡為陽性反應，杜氏小管內沒有氣泡為陰性反應。在糖發酵試驗中，在加入葡萄糖的發酵培養液中加入菌種后，培養液變為黃色，反應結果為陽性，且杜氏小管內無氣泡挑取單菌落平板劃線，置40℃培養48h。6）分裝于試管中，在每管內放一倒置的小玻璃管。以無菌操作趁熱將（A）、（B）溶液混合均勻后倒平板。（B）溶液：酵母膏10g，水500mL，瓊脂20g，pH6.也說明此菌種不是大腸桿菌，因為大腸桿菌的吲哚試驗證明為陽性。

1mL瓊脂培養基每管各9mL無菌水

取市售新鮮酸乳稀釋至10-6，取其中的10-4、10-5、

10-63個稀釋度的稀釋液各0.2mL，分別接入BGC牛乳培養基瓊脂平板上，用無菌玻璃刮刀依次涂布，置40℃培養48h，如出現圓形稍扁平的黃色菌落及其周圍培養基變黃者初步定為乳酸菌。2.劃線分離挑取單菌落平板劃線，置40℃培養48h。挑選出乳酸菌進行連續6次以上的傳代，以達到提純。（二）鑒別1吲哚試驗1）試管標記：取裝有蛋白胨水培養基的試管n+1支，分別標記乳酸菌和空白對照。2）接種培養：以無菌操作分別接種少量菌苔到標記乳酸菌的試管中，標記有空白對照的不接種，置37℃恒溫箱中培養24～48h。3）觀察記錄：在培養基中加入乙醚1~2mL，經充分振蕩，使吲哚萃取至乙醚中，靜置片刻后乙醚層浮于培養液的上面，此時沿管壁緩慢加入5~10滴吲哚試劑，如有吲哚存在，乙醚層呈玫瑰色，此為吲哚試驗陽性反應，否則為陰性反應。2.糖發酵試驗1）試管標記：取分別裝有葡萄糖，蔗糖發酵培養液試管各n+1支，每種糖發酵試管中分別標記乳酸菌和空白對照。2）接種培養：以無菌操作分別接種少量菌苔至以上各相應試管中，每種糖發酵培養液的空白對照均不接菌。將裝有培養液的杜氏小管倒置試管中，置37℃恒溫培養箱中培養24h，觀察結果。（一）乳酸菌的分離純化挑選出乳酸菌進行連續6次以上的傳代，以達到提純。加入蔗糖的發酵培養液中加入菌種后的反應結果也為陽性且杜氏小管內無氣泡也證明此菌種不是大腸桿菌，因為如果是大腸桿菌除了產酸反應結果為陽性外，而且杜氏小管內會有氣泡，因為大腸桿菌具有分解葡萄糖和蔗糖產酸并產氣的能力。6）分裝于試管中，在每管內放一倒置的小玻璃管。2mL，分別接入BGC牛乳培養基瓊脂平板上，用無菌玻璃刮刀依次涂布，置40℃培養48h，如出現圓形稍扁平的黃色菌落及其周圍培養基變黃者初步定為乳酸菌。（B）溶液：酵母膏10g，水500mL，瓊脂20g，pH6.（B）溶液：酵母膏10g，水500mL，瓊脂20g，pH6.培養基的配制滅菌倒平板在糖發酵試驗中，在加入葡萄糖的發酵培養液中加入菌種后，培養液變為黃色，反應結果為陽性，且杜氏小管內無氣泡在吲哚試驗中，加入菌種的試管無任何變化，證明為陰性反應如果培養液呈黃色，反映結果為陽性。每組準備下列器材（滅菌）如果培養液呈黃色，反映結果為陽性。8,121℃滅菌20min。3）觀察記錄：與對照管比較，若接種培養液保持原由顏色，其反映結果為陰性；如果培養液呈黃色，反映結果為陽性。培養液中的杜氏小管內有氣泡為陽性反應，杜氏小管內沒有氣泡為陰性反應。3.乳酸的檢測選用已經分離的菌種做小型發酵實驗，取發酵液的上清液約10mL于試管中，加入10%硫酸1mL，再加2%高錳酸鉀1mL，此時乳酸轉化為乙醛，把事先在含氨的硝酸銀溶液中侵泡的濾紙條搭在試管口中，微火加熱試管至沸，觀察濾紙變化。五、結果分析1.乳酸菌的分離提純在平板上出現了圓形稍扁平的黃色菌落，周圍培養基變為黃色，初步定為乳酸菌⑴，取出少量在顯微鏡下觀察到了鏈球狀和桿狀兩種形狀。2.乳酸菌的鑒定該菌種的菌落為圓形稍扁平的黃色菌落，有桿狀和鏈球狀兩種形狀。在吲哚試驗中，加入菌種的試管無任何變化，證明為陰性反應說明該菌不具有分解色氨酸產生吲哚的能力。也說明此菌種不是大腸桿菌，因為大腸桿菌的吲哚試驗證明為陽性。在糖發酵試驗中，在加入葡萄糖的發酵培養液中加入菌種后，培養液變為黃色，反應結果為陽性，且杜氏小管內無氣泡加入蔗糖的發酵培養液中加入菌種后的反應結果也為陽性且杜氏小管內無氣泡在糖發酵試驗中，在加入葡萄糖的發酵培養液中加入菌種后，培養液變為黃色，反應結果為陽性，且杜氏小管內無氣泡選用已經分離的菌種做小型發酵實驗，取發酵液的上清液約10mL于試管中，加入10%硫酸1mL，再加2%高錳酸鉀1mL，此時乳酸轉化為乙醛，把事先在含氨的硝酸銀溶液中侵泡的濾紙條搭在試管口中，微火加熱試管至沸，觀察濾紙變化。在糖發酵試驗中，在加入葡萄糖的發酵培養液中加入菌種后，培養液變為黃色，反應結果為陽性，且杜氏小管內無氣泡也證明此菌種不是大腸桿菌，因為如果是大腸桿菌除了產酸反應結果為陽性外，而且杜氏小管內會有氣泡，因為大腸桿菌具有分解葡萄糖和蔗糖產酸并產氣的能力。6）分裝于試管中，在每管內放一倒置的小玻璃管。C)乙醇溶液1mL,80℃滅菌20min。也證明此菌種不是大腸桿菌，因為如果是大腸桿菌除了產酸反應結果為陽性外，而且杜氏小管內會有氣泡，因為大腸桿菌具有分解葡萄糖和蔗糖產酸并產氣的能力。C)乙醇溶液1mL,80℃滅菌20min。證明該菌種能分解葡萄糖和蔗糖而產酸。蛋白胨水培養基1000mL，1.挑選出乳酸菌進行連續6次以上的傳代，以達到提純。8,121℃滅菌20min。（一）乳酸菌的分離純化6g溶于1