學必求其心得，業必貴于專精學必求其心得，業必貴于專精學必求其心得，業必貴于專精第二課時無菌操作和接種技術及微生物的分離、培養與數量測定學習目標重點難點1。能說出接種技術的概念和基本過程。2．能記住無菌操作的基本流程和方法。3．能說出微生物分離的基本方法和操作過程。4．能說出“土壤微生物的分離和計數"的操作流程。重點：1．能解決在無菌操作技術中的注意問題.2．會分析接種和培養大腸桿菌中出現的問題。3．能解決“土壤微生物的分離和計數"出現的基本問題和操作技術.難點：能解決如何分離土壤中微生物的問題。一、無菌操作和接種技術1．接種通常把在______條件下將微生物接入________的操作過程叫做接種。由于接種方法的不同,采用的接種工具也有區別，如用________進行固體培養基劃線接種；用________穿刺接種；用__________涂抹平板等。2．無菌操作__________是微生物接種技術的關鍵。通常在酒精燈________進行接種操作,其原因是：酒精燈火焰附近的________使微生物不能存活。預習交流1．根據接種工具的區別,分析有哪些接種技術。2．接種過程中在接種環從菌種管中抽出時，應該注意什么問題？3．無菌技術除了用來防止實驗室的培養物被其他外來微生物污染外，還有什么目的？二、微生物的分離、培養與數量測定1．分離微生物的依據分離微生物時,根據微生物對________、______、______等要求的不同，通過只提供目的微生物生長的必需條件，或加入__________使____________不能生長，從而達到選擇分離微生物的目的。2．菌落單個微生物在適宜的固體培養基表面或內部生長、繁殖到一定程度，可以形成肉眼可見的、有____________的______________,稱為菌落.當______培養基表面眾多菌落連成一片時，便成為______.當多種微生物混雜在一起時，根據它們在平板上形成的菌落的________可初步將所需的微生物與其他微生物區分開，并在此基礎上獲得所需微生物的________.3．分離微生物的常用方法______分離法能將單個微生物______和固定在______培養基表面或里面，每個孤立的活微生物經過______、______均可形成便于移植的菌落。最常用的分離、培養微生物的固體培養基是________________平板。平板分離法有多種，如__________和____________就是常用的兩種________的方法。分離土壤中能分解纖維素的微生物所采用的培養基從功能上分是__________,其特點是__________________。平板劃線法也是常用的平板分離法。平板劃線法有________、________、________、________等。在“土壤微生物的分離與計數"實驗中，在高度稀釋條件下，微生物在固體培養基上可以形成__________,即一個菌落可代表一個________，通過菌落數的統計可計算出樣品中的含菌數。需準備的實驗器材:滅菌處理過的移液管、試管、錐形瓶、試管架、培養皿、記號筆、燒杯、土壤樣品、相關培養基、無菌水和________。選擇適于分離特定微生物的培養基：利用不同微生物________的不同，可以通過選擇培養基排除其他微生物的生長,從而選出所需要的特定微生物.預習交流1．分類、鑒定微生物的重要依據是什么？2．涂布平板法和混合平板法分離細菌和數量測定時，首先要做的操作是什么？3．纖維素存在于何種細胞的何種結構中？有何功能?4．自然界中的纖維素是如何被利用的？答案：一、1.無菌培養基接種環接種針玻璃刮鏟2．無菌操作火焰附近局部高溫預習交流：1．提示：微生物接種技術很多,除了最常用的平板劃線法和稀釋涂布平板法外，還包括斜面接種、穿刺接種等方法。2．提示：注意帶菌部分不要觸及管壁或通過火焰.3．提示：無菌技術還能有效避免操作者自身被微生物感染。二、1.營養成分氧氣pH某些抑制劑非目的微生物2．一定形態結構子細胞生長群體固體菌苔形態特征純培養物3．平板分離固體生長繁殖瓊脂固體培養基涂抹平板法混合平板法定量測定選擇培養基以纖維素為唯一碳源扇形劃線連續劃線交叉劃線方格劃線單個的菌落單細胞玻璃刮鏟代謝特性預習交流：1．提示：不同微生物在特定的培養基上生長形成的菌落或菌苔一般具有穩定的特征，可以成為對該類微生物進行分類、鑒定的重要依據.2．提示：將待分離的材料進行稀釋。3．提示:纖維素主要存在于植物細胞的細胞壁中，是植物細胞壁的主要組成成分，細胞壁越發達,纖維素的含量越多.纖維素不是一種生物活性物質，由纖維素構成的細胞壁具有保護和支持作用。4．提示：自然界中的纖維素主要被土壤中的微生物分解利用;一部分被植食性動物取食利用（實質上也離不開微生物的分解作用)；一部分作為能源被人類燃燒利用。在預習中還有哪些問題需要你在聽課時加以關注？請在下列表格中做個備忘吧!我的學困點我的學疑點一、無菌操作1．在微生物的培養過程中為什么要進行無菌操作？怎樣進行無菌操作？2．下列各項中采用什么樣的無菌操作？①操作者的衣物、手；②器皿、接種工具和培養基。微生物實驗過程中許多操作都要消毒或滅菌，下列消毒或滅菌措施不恰當的是().A．接種環可用火焰灼燒B．若條件優越，一些操作可在超凈工作臺上進行C．接種后,應先進行滅菌再放入培養箱中培養D．試管、培養皿等玻璃器具可用高壓蒸汽滅菌1．無菌操作是微生物接種技術的關鍵.2．實驗室常用的消毒或滅菌方法滅菌或消毒種類主要方法應用范圍灼燒滅菌酒精燈火焰灼燒接種環、接種針及試管口等干熱滅菌干熱滅菌箱內，在160～170℃加熱1～2h玻璃器皿、金屬用具等巴氏消毒70～75℃下煮30min牛奶、啤酒等一些不耐高溫的液體高壓蒸汽滅菌法高壓蒸汽滅菌鍋內，100kPa，121℃持續加熱15～30min培養基等紫外線消毒30W紫外線燈照射30min接種室、超凈工作臺等化學藥物消毒用體積分數為70%～75%的乙醇、碘酒涂抹等用于皮膚、傷口、動植物組織表面消毒等二、接種與培養大腸桿菌根據教材“接種與培養大腸桿菌”回答下面的問題.1．第2步中，將接種環在火焰上來回灼燒多次的目的是什么？2．第3步中，迅速將試管口通過火焰2～3次的目的是什么？3．第4步中，將滅菌的接種環先接觸培養基斜面頂端等部位使其冷卻，然后再挑取少許菌體的原因是什么？4．平板劃線法和稀釋涂布平板法有何區別？下列有關接種與培養大腸桿菌操作過程的敘述，不正確的是（）.A．灼燒接種環是為了避免接種環上可能存在的微生物污染培養基B．將試管口通過火焰2～3次，是為了殺滅試管口上沾染的微生物C．接種結束后可直接將接種環放回原處D．接種過菌種的試管,放在恒溫箱中（37℃）培養24h平板劃線操作（1）第一次劃線及每次劃線之前都需要灼燒接種環滅菌，劃線操作結束仍需灼燒接種環，每次灼燒目的如下:操作的第一步灼燒接種環是為了避免接種環上可能存在的微生物污染培養基;每次劃線前灼燒接種環是為了殺死上次劃線結束后接種環上殘留的菌種；劃線結束后灼燒接種環，能及時殺死接種環上殘留的菌種，避免細菌污染環境和感染操作者。（2)灼燒接種環之后,要冷卻后才能伸入菌液,以免溫度太高殺死菌種。（3）劃線時最后一區域不要與第一區域相連.（4）劃線用力大小要適當,防止用力過大將培養基劃破。三、土壤微生物的分離和計數1．教材P17表1－2的培養基配方中，為微生物的生長提供碳源和氮源的分別是什么物質？該培養基是液體培養基還是固體培養基？2．實驗中如何設置對照實驗？3．第4步中,每個濃度設置3個重復的目的是什么？4．想一想，如何從平板上的菌落數推測出每克土壤樣品中的細菌數？下列有關“土壤微生物的分離和計數"實驗的說法,錯誤的是（）。A．該實驗采用了唯一氮源為尿素的鑒別培養基B．將培養皿倒置于恒溫箱中37℃培養C．計算時，選取菌落數在30~300的一組為代表，進行統計D．每次用無菌移液管吸取土壤懸液前都要振蕩該實驗中的注意事項(1)設立重復組：統計某一稀釋度下平板上的菌落數時,要至少涂布3個平板作重復組,增強實驗結果的說服力與準確性.(2)對照原則①判斷培養基中是否有雜菌污染，需將未接種的培養基同時進行培養.②判斷選擇培養基是否具有篩選作用,需設立牛肉膏蛋白胨培養基進行接種后培養,觀察兩種培養基上菌落數目,進行對比得出結論。四、分離土壤中能分解纖維素的微生物閱讀教材P19旁欄中的纖維素分解菌選擇培養基的成分回答下列問題。1．旁欄中的配方是液體培養基還是固體培養基？為什么？2．這個培養基對微生物是否具有選擇作用？如果有，是如何進行選擇的？纖維素分解菌的選擇培養基有選擇作用，原因在于其含有(）。A．NH4NO3B．NaClC．酵母浸膏D．微晶纖維素粉剛果紅染色法鑒別纖維素分解菌的原理剛果紅（CongoRed，簡稱CR）是一種染料,它可以與像纖維素這樣的多糖物質形成紅色復合物，但并不和水解后的纖維二糖和葡萄糖發生這種反應。當我們在含有纖維素的培養基中加入剛果紅時，剛果紅能與培養基中的纖維素形成紅色復合物。當纖維素被纖維素酶分解后，剛果紅—纖維素的復合物就無法形成，培養基中會出現以纖維素分解菌為中心的透明圈。這樣，我們就可以通過是否產生透明圈來篩選纖維素分解菌。答案：活動與探究一：1．提示:無菌操作的目的是防止受到空氣中的雜菌污染。培養微生物用的試管、培養皿和微生物培養基等，在接種之前都需要滅菌；接種操作時要在酒精燈火焰附近的無菌區進行.2．提示:①清潔消毒;②進行滅菌。遷移與應用：C解析:接種用具、器皿、空氣中都充滿了微生物，都有污染的可能，必須嚴格地消毒滅菌.A、B、D三項措施都是合理可行的。但接種后再滅菌會將菌種殺死導致實驗失敗。活動與探究二：1．提示:殺滅接種環上的雜菌.2．提示：殺滅試管口上沾染的微生物。3．提示：防止接種環過熱將細菌殺死。4．提示：這兩種方法都是分離微生物的方法。二者的操作方法不同，平板劃線法是挑單個菌落在瓊脂固體培養基表面劃線，將微生物分離;稀釋涂布平板法則是將菌液進行一系列的梯度稀釋，然后將不同稀釋度的菌液分別涂布到瓊脂固體培養基的表面，進行培養。平板劃線法主要用于分離純化，稀釋涂布平板法主要用于計數.遷移與應用：C解析：接種過菌種的試管，應放在恒溫箱中（37℃）培養24h。接種結束后，灼燒接種環后，放回原處。活動與探究三：1．提示：碳源:葡萄糖，氮源:尿素；因配方中含有凝固劑瓊脂，該培養基為固體培養基.2．提示：另設置一份不加氮源（以等體積的無菌水代替)的對照。3．提示：增加實驗結果的說服力與準確性。4．提示:統計某一稀釋度下平板上的菌落數，最好能統計三個平板,計算出平板菌落數的平均值，然后根據公式（每克土壤樣品的細菌數＝某一稀釋度幾次重復培養后的菌落平均數×稀釋倍數）進行計算。遷移與應用:A解析：土壤微生物的分離和計數實驗中采用的是以尿素為唯一氮源的選擇培養基.活動與探究四：1．提示：是固體培養基，因為配方中有凝固劑——瓊脂。2．提示:有選擇作用，本配方中的唯一碳源是微晶纖維素粉，所以能分解纖維素的微生物可以大量繁殖。遷移與應用:D解析：在以纖維素為唯一碳源的培養基上，只有分解纖維素的微生物能夠正常生長而其他微生物不能正常生長,對微生物起選擇作用。1．無菌操作包括以下幾個方面的敘述,其中錯誤的是()。A．對實驗操作的空間、操作者的衣著和手進行滅菌B．將培養器皿、接種用具和培養基等進行滅菌C．為避免周圍環境中微生物的污染，實驗操作應在酒精燈火焰附近進行D．實驗操作時應避免已經滅菌處理的材料用具與周圍物品相接觸2．用來判斷選擇培養基是否起到了選擇作用需要設置的對照是（）.A．未接種的選擇培養基B．未接種的牛肉膏蛋白胨培養基C．接種了的牛肉膏蛋白胨培養基D．接種了的選擇培養基3．在涂布平板操作時錯誤的是（)。A．將涂布器在酒精燈火焰上灼燒，直到燒紅,為防止微生物再次污染，不需冷卻可直接在平板上涂抹B．取少量菌液滴加在培養基表面C．將沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃待酒精燃盡后，冷卻8~10s再用D．涂布時可轉動培養皿，使涂布均勻4．下列是關于檢測土壤中細菌總數實驗操作的敘述，其中錯誤的是（)。A．用蒸餾水配制牛肉膏蛋白胨培養基,經高溫、高壓滅菌后倒平板B．取104、105、106倍的土壤稀釋液和無菌水各0。1mL，分別涂布于各組平板上C．將實驗組和對照組平板倒置，37℃恒溫培養24～48小時D．確定對照組無菌后，選擇菌落數在300以上的實驗組平板進行計數5．以纖維素為唯一碳源篩選出多種具有較高纖維素降解能力的微生物，其中有真菌和細菌，試分析此類微生物在生態系統中的作用與下列哪種生物類似（).A．硝化細菌B．藍藻C．蚯蚓D．兔子答案：1．A解析：對實驗操作的空間、操作者的衣著和手進行清潔和消毒而不是滅菌。2．C解析：將菌液稀釋相同的倍數，在牛肉膏蛋白胨培養基上生長的菌落