學必求其心得，業必貴于專精學必求其心得，業必貴于專精學必求其心得，業必貴于專精第二節制備和應用固定化酶學習目標重點難點1。能記住固定化酶的概念.2．能說出常見幾種制備固定化酶的方法.3．能記住固定化細胞技術的概念。4．能說出常見細胞固定化的方法。重點：能分析比較常見幾種固定化酶的方法的優點及缺點。難點：1．制備固定化酵母菌細胞的流程。2．說出固定化細胞及酶在實際中的應用。一、固定化酶技術的應用1．固定化酶固定化酶是指用______或______的方法將酶與__________結合在一起形成的仍具有________的酶復合物。在催化反應中,它以固相狀態作用于底物，反應完成后,容易與水溶性反應物和產物分離，可被__________。預習交流1．直接使用的酶能反復利用嗎？2．任何一項新技術有利，也必有弊。固定化酶是將酶固定在不溶于水的載體上的一項新技術，由該特點你是否想到了固定化酶的不足？能否結合過氧化氫酶對過氧化氫的分解實驗對固定化酶的不足之處進行解釋說明?2．制備固定化酶的方法項目吸附法交聯法包埋法方法利用物理吸附、離子鍵作用利用多功能試劑進行酶與載體之間交聯包埋在固化的載體中載體________、________、__________、離子交換樹脂等戊二醛凝膠方式____________________—包埋成格子型微膠囊型預習交流在固定化酶的三種方法中，酶不適合哪種方法?二、固定化細胞技術的應用1．固定化細胞技術通過各種方法將______與一定的載體結合，使其仍保持原有的__________，這一過程稱為____________。2．細胞固定化的方法細胞固定化的方法也有多種，主要有________和________兩大類。________是制備固定化動物細胞的主要方法,此法也可制備固定化植物細胞,它既可將植物細胞吸附在__________的大孔隙或裂縫之中,也可將植物細胞吸附在__________的外壁上。包埋法是指將細胞包埋在______________中，其中，__________是應用最廣泛的細胞固定化方法，它所使用的載體主要有________、__________和______等.固定化細胞技術有許多優點,可以取代____________進行發酵，生產各種物質。預習交流1．固定化細胞的實質是固定酶,那么是胞內酶還是胞外酶呢?2．固定化細胞技術固定的是活細胞還是死細胞？答案：一、1.物理化學固相載體酶活性反復利用預習交流：1．提示:不能,混在產物里難以回收利用.2．提示：將酶固定在不溶于水的載體上,限制了酶分子與底物分子（或離子)的接觸，減少了酶與底物的接觸面積，降低了化學反應的速度。例如，用肝臟研磨液（內含過氧化氫酶)分解過氧化氫就比用成塊的鮮肝分解過氧化氫的速度快,因為成塊的鮮肝過氧化氫酶大部分存在于肝細胞內，與過氧化氫的接觸面積小,不利于過氧化氫的分解,而肝臟研磨液將過氧化氫酶從肝細胞內釋放出來，增加了過氧化氫酶與過氧化氫分子的接觸面積，使反應更容易進行。2．纖維素瓊脂糖多孔玻璃物理吸附、離子結合法、共價鍵結合預習交流:提示：酶不適合用包埋法,因為酶分子太小容易從材料中漏掉。二、1.細胞生物活性細胞固定化2．吸附法包埋法吸附法泡沫塑料中空纖維能固化的載體凝膠包埋法瓊脂糖海藻酸鈉明膠游離的細胞預習交流：1．提示:胞外酶。2．提示：活細胞。在預習中還有哪些問題需要你在聽課時加以關注？請在下列表格中做個備忘吧！我的學困點我的學疑點一、固定化酶技術的應用1．固定化酶的概念指用______________的方法將酶與__________結合在一起形成的仍具有酶活性的酶復合物。2．固定化酶的方法（1）填寫下列固定化酶的方法A________B________C1__________C2__________(2）吸附法是把酶固定在________、________、__________等載體上。（3）交聯法最常用的交聯劑是________.（4）包埋法最常用的載體是______。(5）這三種方法中包埋法適合較大的酶分子還是較小的？原因是什么？3．固定化酶是否可以永遠地利用下去?下列關于固定化酶的說法中，錯誤的是（）.A．固定化酶的活力也受強酸、高溫等因素的影響B．酶固定化后會使酶的利用率提高C．利用固定化酶可降低生產成本D．反應結束后，固定化酶與產物混合成為雜質1．酶的共性及固定化酶的優點（1)酶：起催化作用,絕大多數是蛋白質。（2）酶的活力在受高溫、強酸、強堿和重金屬離子等外界條件影響下變性失活。（3）普通酶促反應的缺陷：①一次性使用難回收，增加生產成本，難以連續化生產.②反應結束后，雜質與產物混合在一起，不利于產物進一步純化。（4)固定化酶的優點：①可以使反應過程管道化、自動化，產物易從反應液中回收；②酶的穩定性有所改進；③酶的使用效率提高。2．固定化酶的應用實例—-生產高果糖漿（1）高果糖漿高果糖漿是指果糖含量為42%左右的糖漿。（2）固定化酶反應的過程將葡萄糖異構酶固定在顆粒狀載體上↓放入底部有許多小孔的反應柱（酶顆粒不能通過，反應液能通過)↓葡萄糖溶液從反應柱的上端注入↓流經反應柱↓與固定化葡萄糖異構酶接觸，轉化成果糖↓果糖從反應柱的下端流出二、固定化細胞技術的應用1．固定化細胞的概念：通過各種方法將細胞與一定的______結合，使細胞仍保持原有的__________,這一過程稱為細胞的固定化。2．閱讀教材P54內容，填寫表格內容。細胞固定化的方法方法________；________優點①________________________②________________________缺點①__________________________②____________________③____________________下列關于固定化細胞技術的說法中,正確的是()。A．吸附法的優點是操作簡單、吸附牢固B．包埋法的優點是操作復雜、條件溫和、對細胞無毒性C．吸附法容易對酶活性產生影響D．凝膠包埋法常用的凝膠種類有瓊脂、海藻酸鈉凝膠、角叉菜膠和明膠等在固定化細胞技術中，載體的主要作用是固定細胞,不讓細胞溶于產物中，要保證酶和底物盡可能多地接觸，所以多孔。當然，也要考慮固定的材料盡可能對酶的催化不產生影響或產生的影響最小。固定化細胞在催化化學反應的同時，自身獲得了物質和能量，因此，不需額外提供營養物質。三、制備固定化酵母菌細胞1．寫出制備固定化酵母菌細胞的流程（閱讀教材P54“酵母菌細胞的固定化技術”）制備________→______________→__________________→________洗滌→____________2．制備固定化酵母菌細胞中麥芽汁的作用是什么?3．制備固定化酵母菌細胞中活化的目的是什么?4．將海藻酸鈉冷卻的目的是什么?5．飽和硼酸-氯化鈣溶液的作用是什么？6．將注射器中的溶液如何放入CaCl2溶液中?7．此實驗成功的關鍵是什么?8．濃度高低對結果有何影響?9．配制海藻酸鈉時小火加熱并不斷攪拌的目的是什么?10．發酵過程中錐形瓶為什么要密封？11．當觀察到哪些現象時，可以說明實驗獲得成功?下列有關固定化酵母細胞制備步驟，正確的是（）。A．應使干酵母與自來水混合并攪拌，以利于酵母菌活化B．配制海藻酸鈉溶液時要用小火或間斷加熱的方法C．向剛溶化好的海藻酸鈉溶液中加入已活化的酵母菌細胞，充分攪拌并混合均勻D．將與酵母菌細胞混勻的海藻酸鈉溶液注入CaCl2溶液中，會觀察到CaCl2溶液中有球形或橢球形的凝膠珠形成制備固定化酵母菌細胞的注意事項（1）酵母菌細胞的活化：在缺水的狀態下，微生物會處于休眠狀態.活化就是讓處于休眠狀態的微生物重新恢復正常的生活狀態.酵母菌細胞所需要的活化時間較短,一般需要1h左右，要提前作好準備。此外，酵母菌細胞活化時體積會變大，因此活化前應該選擇體積足夠大的容器,以避免酵母菌細胞的活化液溢出容器。（2)加熱：加熱使海藻酸鈉溶化是操作中最重要的一環，影響到實驗的成敗。海藻酸鈉的濃度影響固定化細胞的質量。如果海藻酸鈉濃度過高，將很難形成凝膠珠；如果濃度過低，形成的凝膠珠所包埋的酵母菌細胞的數目少，影響實驗效果。（3)凝膠珠的檢測：剛形成的凝膠珠應在CaCl2溶液中浸泡一段時間,以便形成穩定的結構。檢驗凝膠珠的質量是否合格可以使用下列方法：一是用鑷子夾起一個凝膠珠放在實驗桌上用手擠壓，如果凝膠珠不容易破裂，沒有液體流出，就表明凝膠珠的制作成功。二是在實驗桌上用力摔打凝膠珠，如果凝膠珠很容易彈起,也能表明制備的凝膠珠是成功的.（4)觀察凝膠珠的顏色和形狀.如果制作的凝膠珠顏色過淺、呈白色，說明海藻酸鈉的濃度偏低,固定的酵母菌細胞數目較少;如果形成的凝膠珠不是圓形或橢圓形，則說明海藻酸鈉的濃度偏高，制作失敗，需要再作嘗試。四、直接使用酶、固定化酶、固定化細胞的比較填寫表格內容。直接使用酶固定化酶固定化細胞酶的種類____________________________常用載體-高嶺土、皂土、硅膠、凝膠明膠、瓊脂糖、海藻酸鈉、醋酸纖維素、聚丙烯酰胺制作方法—____________、________________________是否需要營養物質____________催化反應__________________________反應底物各種物質（大分子、小分子）各種物質（大分子、小分子）小分子物質缺點①對環境條件非常敏感,易失活②難回收，成本高，影響產品質量________________反應物不易與酶接近，尤其是大分子物質，反應效率下降優點__________________________________________________________________________________下列關于固定化酶和固定化細胞的敘述,正確的是（)。A．固定化細胞技術在多步連續催化反應方面優勢明顯B．固定化酶的應用中，要控制好pH、溫度和溶解氧C．利用固定化酶降解水體中有機磷農藥，需提供適宜的營養條件D．利用固定化酵母菌細胞進行發酵,糖類的作用只是作為反應底物一般來說，酶更適合采用化學結合法和物理吸附法固定，而細胞多采用包埋法固定。這是因為細胞體積大，而酶分子很小；體積大的細胞難以被吸附或結合,而體積小的酶容易從包埋材料中漏出。答案：活動與探究一：1．物理學或化學固相載體2．（1）吸附法交聯法凝膠包埋法微膠囊法（2）纖維素瓊脂糖多孔玻璃（3)戊二醛(4）凝膠(5)提示：較大的酶分子；較小的容易從包埋材料中漏出。3．提示:不能.酶是生物催化劑，其活性受環境影響較大,隨著時間推移活性降低，一般一個反應柱可以連續使用半年。遷移與應用：D解析：固定化酶容易與產品分離，有利于產物的純化；能反復使用提高了酶的利用率，因此可降低成本；固定化酶本質是蛋白質，活力也受強酸、高溫等因素的影響.活動與探究二:1．載體生物活性2．吸附法包埋法不用破碎細胞提取酶，又能充分利用細胞內的酶保留細胞內多酶系統,能催化多步連續反應只能用于生產胞外酶和分泌到細胞外的產物營養物質和產物的擴散受載體限制溶解氧的傳遞和輸送限制好氧性發酵遷移與應用:D解析:細胞固定化的方法主要有吸附法和包埋法.它們各有利弊,吸附法的主要優點是酶活性不受影響，但吸附過程相當復雜，這一過程與細胞的性質、載體的性質以及兩者之間的相互作用等有關，吸附力較弱且吸附不牢固，細胞容易脫落。包埋法操作簡單，條件溫和，對細胞無毒性，適合于生長細胞的固定化。活動與探究三：1．麥芽汁活化酵母菌細胞制備固定化細胞無菌水發酵麥芽汁2．提示：為酵母細胞提供營養物質。3．提示：使酵母細胞從休眠狀態恢復到正常狀態。4．提示：防止將酵母菌細胞凍死。5．提示：使膠體聚沉，形成凝膠珠。6．提示：以恒定的速度滴加。7．提示：海藻酸鈉溶液的濃度.8．提示：濃度高會很難形成凝膠珠，濃度低包埋數目過少。9．提示：防止海藻酸鈉焦糊.10．提示：酵母菌的酒精發酵需要無氧條件.11．提示:利用固定的酵母菌細胞發酵產生酒精，可以看到產生了很多氣泡，同時會聞到酒味。遷移與應用：B解析：由于在缺水狀態下，微生物處于休眠狀態,為了加速酵母菌細胞的活化，將干酵母與蒸餾水混合后用玻璃棒充分攪拌。為避免海藻酸鈉發生焦糊，溶化時要用小火或間斷加熱.如果將剛溶化好的海藻酸鈉與已活化的酵母菌細胞混合，有可能會殺死酵母菌細胞.將與酵母菌細胞混勻的海藻酸鈉用注射器緩慢滴加到CaCl2溶液中，而不是注入。活動與探究四:一種或幾種一種一系列酶化學結合法固定化物理吸附法固定化包埋法固定化否否是單一或多種單一一系列不利于催化一系列酶促反應催化效率高、耗能低、低污染①既能與反應物接觸，又能與產物分離②可以反復利用成本低、操作容易遷移與應用：A解析:A項中，固定化細胞技術由于保留了細胞內原有的多酶系統,連續催化反應的優勢非常明顯。B項中，固定化酶的應用中,不需控制溶解氧；C項中，不需各種營養條件；D項中,糖類的作用不只是作為反應底物，還能維持酵母菌細胞的滲透壓，防止酵母菌細胞過多地吸水或失水.1．若用固定化酵母菌細胞發酵葡萄糖溶液時發現無酒精產生，原因不可能是（）。A．實驗瓶蓋了塞子B．瓶內氧氣充足，進行了有氧呼吸C．固定化酵母菌細胞內可能沒有酵母菌細胞D．所謂的葡萄糖溶液可能是其他物質2．下列敘述正確的是（)。A．一種固定化酶能催化一系列的化學反應B．固定化細胞能產生一系列酶C．酵母菌細胞活化就是使酵母菌細胞由無氧呼吸變成有氧呼吸D．固定化酶更適合大分子反應物3．在制備固定化酵母菌細胞的實驗中,CaCl2溶液的作用是（)。A．用于調節溶液pH B．用于進行離子交換C．用于膠體聚沉 D．用于為酵母菌提供Ca2＋4．固定化細胞常用包埋法固定化，原因是（).A．包埋法固定化操作最簡便 B．包埋法對酶活性的影響最小C．包埋法固定化