油菜抗根腫病人工接種鑒定技術規程TechnicalRegulationsforArtificialInoculationofHYPERLINK安徽省質量技術監督局發布I本標準根據GB/T1.1-2009給出的規則起草。本標準由安徽省農業科學院作物研究所提出。本標準由安徽省農業標準化技術委員會歸口。本標準主要起草單位：安徽省農業科學院作物研究所。本標準參與起草單位：安徽省黃山市農業科學研究所。本標準主要起草人：費維新、胡寶成、李強生、侯樹敏、陳鳳祥、榮松柏、王淑芬、初明光、江瑩芬、郝仲萍。1油菜抗根腫病人工接種鑒定技術規程本標準規定了油菜品種根腫病抗性鑒定依據、實驗菌株的擴繁與保存、育苗基質的配置、接種液的制備、接種苗的培養、人工接種技術和抗性評價方法等。本標準適用于油菜品種資源根腫病的抗性鑒定及評價。2規范性引用文件下列文件對于本文件的應用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB/T6682分析實驗室用水規格和試驗方法GB15981消毒與滅菌效果的評價方法與標準SN/T2632微生物菌種常規保藏技術規程3術語和定義下列術語和定義適用于本文件。一種能夠被病原菌侵染并引起病害的生物體。病原菌株pathogenicisolate從植物發病部位通過人工培養、純化、再接種和分離等方法獲得的病原菌的分離培養物。3.3休眠孢子懸浮液restingsporessuspension病菌休眠孢子均勻分散于水中不下沉，與水混合形成孢子懸浮液。接種濃度inoculumsconcentration用于人工接種的單位體積內病菌休眠孢子的數量。2DB34/T2785—根腫病clubrootdiseasePlasmodiophoromycetes,根腫菌目Plasmodiophorales。由Plasmodiophorabrassicae病菌侵染引苗期油菜根腫病分級標推詳見附豪流使用，請勿傳播或其他用途電子天平(感量0.01g),移液器，離心管，吸管，三角瓶，醫用血球計，育苗盤及托盤。6主要試劑與材料75%乙醇酒精，濃鹽酸，根腫菌的主要致病生理小種病原菌株，油菜根腫病感病對照品種Westar和抗病對照品種Mendel,泥炭土，蛭石，珍珠巖。37實驗菌株的擴繁實驗用菌株用油菜感病品種Westar或速生2號接種擴繁，方法同人工接種，接種后60天(d)收獲腫根，并用自來水洗凈后登記繁殖寄主品種、生理小種類型、日期、人員等信息，并于-20℃冰箱儲存備用。8育苗基質的配置使用的營養基質為接種用專用配方土，主要成分為泥炭土、蛭石、珍珠巖，并按照體積比1:1:1均勻混合。在使用前將配置的營養基質先用高壓滅菌鍋滅菌處理(121℃,30min),參照GB15981標準；然后將滅菌的營養基質分裝入50孔(每孔100ml)的育苗盤中，接種前營養土用自來水澆透，并放在配套的托盤上。9接種液的制備從冰柜中取出儲藏在-20℃下的一個油菜腫根(30g左右),置于室溫下1小時(h),將解凍軟化后的腫根放入粉碎攪拌機(型號JYL-C16D,功率250W)中，加入100ml的無菌去離子水(ddH?O)攪拌粉碎(轉數為18000～22000r/min),水質參照GB/T6682分析實驗室用水規格和試驗方法；待腫根充分粉碎后，獲取的腫根粉碎攪拌混合液用8層紗布過濾，得到根腫菌休眠孢子懸浮液在50g離心5min,收集上清液(含有休眠孢子),再從上清液中取樣1ml稀釋10倍，用醫用血球計數板檢查根腫菌休眠孢子數量并計算休眠孢子的濃度，然后在三角瓶標簽上標記注明休眠孢子懸浮液的濃度，并置入4℃冰箱中保存備用；人工接種前用ddH?O將休眠孢子懸浮液的濃度調配到所人工接種需要的接種濃度。10接種苗的準備供接種用的油菜種子需先用75%(v/v)乙醇消毒30秒(s)后用無菌去離子水(ddH?O)震蕩漂洗3次，然后將消毒滅菌處理的種子置入發芽盒的發芽濾紙上催芽，發芽盒并在人工氣候箱中培養，設置氣候箱條件參數：溫度為24℃(光照)/18℃(黑暗),濕度為60%～80%,光周期為16h光照/8h流請勿傳播或其他用途11人工接種開始接種工作前提前半天將營養缽中裝有的滅菌處理過的營養基質用自來水澆透，接種時將接種苗在接種濃度為1×10?個/ml的休眠孢子懸浮液中蘸根5s后栽入營養缽中，每營養缽中栽入1棵接種苗，每個重復接種苗25棵，設4次重復，移栽完畢后用滴管吸取接種濃度為1×10?個/ml的休眠孢子懸浮液1ml接種于幼苗根部土壤，接種實驗設感病對照和抗病對照。油菜幼苗接種后使用酸水(pH6.0,用濃鹽酸配置)澆入托盤中，并將接種苗移入人工氣候溫室中；油菜幼苗接種后6w調查植株發病情況。12環境條件的控制4DB34/T2785—2016人工接種鑒定試驗接種后的苗移入溫室中，接種苗需要在人工氣候溫室中培養6w,溫室的控制參數設置：溫度為24℃(光照)/18℃(黑暗),濕度為75%～85%,光周期為16h光照/8h黑暗，光照強度為15000～20000Lux。油菜幼苗接種后2w內每隔1天(d)在托盤中澆入酸水(pH6.0,用濃鹽酸調制),并保持育苗營養缽中的基質土水分充足，油菜幼苗接種2w以后根據苗情補充水分。13數據采集與結果判定接種后6w調查病害發病，以油菜根腫病為害癥狀病害分級(0-3級)計算病情指數(diseaseindex,縮寫為DI),計算公式(1)如下。DI——病情指數；病級數(0～n);Xi——病情為i級的植株數量；Si——病情為i級的病級代表值；Sn—病情為最高病級代表值?！?<高抗HR≤5;——10<中抗MR≤20;見附錄B。14菌株保存與處理分離鑒定的菌株應妥善保存，孢子懸浮液可置于4℃冰箱中臨時保存，病原菌株用感病品種Westar擴繁后于零下20℃冰柜中長期保存，每間隔5年(y)用感病品神Westar1促期繁殖。參照SN/T2632對于不需長期保存的菌株應及時采用高壓濕熱滅菌法滅活處理，參照GB15981標準。15結果記錄與資料保存完整的實驗記錄包括樣品的來源、種類、時間，測試的時間、地點、方法和結果，實驗人員和審核人員簽字。見附錄C。5(規范性附錄)根部沒有附著根腫。1級根部有細小腫瘤，根腫只附著在側根上，數量占根系全部的1-25%。2級根部有中等腫瘤，主根上有根腫附著，側根上根腫數量占根系全部25%以上。根部有異常大腫瘤，主根上有根腫附著，根腫數量占50%以上的根系。6(規范性附錄)油菜根腫病抗性評價標準表B.1油菜根腫病抗性評價標準病情指數的數值范圍免疫Immune(I)5≥病情指數>0高抗HighlyResistant(HR)10≥病情指數>5抗病Resistant(R)20≥病情指數>10中抗ModeratelyResi