基因工程的應用、蛋白質工程及生物技術的安全性和倫理問題練習一、選擇題1.限制性內切酶EcoRⅠ識別并切割雙鏈DNA，用EcoRⅠ完全酶切果蠅基因組DNA，理論上得到DNA片段的平均長度(堿基對)約為()A.6 B.250C.4000 D.240002.下列有關DNA連接酶的說法，正確的是()A.DNA連接酶和限制酶的作用恰好相反，DNA連接酶可以將限制酶切開的雙鏈DNA片段“縫合”起來B.DNA連接酶和DNA聚合酶一樣能連接單鏈DNA片段C.E.coliDNA連接酶可以連接有平末端的DNA片段，也能連接有黏性末端的DNA片段D.T4DNA連接酶只能連接有平末端的DNA片段3.轉基因抗蟲棉培育過程中，下列有關目的基因檢測與鑒定方法的敘述，錯誤的是()A.檢測抗蟲基因是否導入——農桿菌轉化法B.檢測抗蟲基因是否轉錄——PCR技術等C.檢測抗蟲基因是否翻譯——抗原—抗體雜交D.檢測抗蟲蛋白生物功能——抗蟲接種實驗4.構建基因表達載體時，可利用堿性磷酸單酯酶催化載體的5′－P變成5′－OH，如圖所示。將經過該酶處理的載體與外源DNA連接時，由于5′－OH與3′－OH不能連接而形成切口(nick)。下列說法錯誤的是()A.經堿性磷酸單酯酶處理的載體不會發生自身環化B.外源DNA也必須用堿性磷酸單酯酶處理C.T4DNA連接酶可連接黏性末端和平末端D.重組DNA經過2次復制可得到不含nick的子代DNA5.我國科研人員在實驗室中通過構建多種酶催化體系的方法，首次實現了在細胞外從二氧化碳固定到合成淀粉的過程。下列有關敘述錯誤的是()A.可采用PCR技術從不同物種的基因組中擴增得到多酶催化體系中的目標酶基因B.在多酶催化體系中，可能會因為酶的最適反應條件不同而使反應中斷C.該方法可在分子水平上直接改變氨基酸的序列，實現對酶特性的改造和優化D.若該科研成果成熟后推廣應用有助于擺脫耕地和自然環境限制，解決糧食危機6.下圖是一種靶向基因敲除技術即TALEN技術。該技術的敲除工具是由DNA識別域TALE和非特異性內切核酸酶FoKI兩個部分組成的蛋白質。TALE的二連氨基酸(字母N、I、G、H、D分別代表一種氨基酸)與四種堿基(A、G、C、T)有恒定的對應關系。FoKI是一種形成二聚體后具有內切核酸酶活性的蛋白單體。下列相關敘述錯誤的是()A.單獨使用FoKI對基因的切割敲除具有隨機性B.TALE蛋白的合成通常涉及PCR技術和蛋白質工程C.二連氨基酸能與四種含氮堿基發生恒定的堿基互補配對D.TALE蛋白左右臂的二連氨基酸序列的設計依據靶基因堿基序列7.(多選)B基因存在于水稻基因組中，其僅在體細胞(2n)和精子(n)中正常表達，但在卵細胞中不轉錄。為研究B基因表達對卵細胞的影響，設計了如下實驗(Luc基因表達的熒光素酶能催化熒光素產生熒光，融合基因表達的蛋白質能保留兩種蛋白質各自的功能)。下列相關敘述正確的是()A.由于DNA聚合酶不能合成導致B基因在水稻卵細胞中不能轉錄B.過程①中T－DNA以單鏈形式整合到受體細胞的染色體DNA上C.過程②轉化篩選水稻愈傷組織時，需在培養基中加入潮霉素D.可通過檢測加入熒光素的卵細胞中是否發出熒光鑒定B基因是否表達二、非選擇題8.中國甜柿的自然脫澀與乙醛代謝關鍵酶基因(PDC)密切相關，推測澀味程度可能與PDC基因的表達情況有關。為篩選PDC基因的調控蛋白，科研人員構建了質粒A和質粒G(如圖1、圖2所示)，利用酵母菌進行了相關實驗探究。(1)啟動子位于基因首端，是________的位點，啟動子區域還存在著許多調控蛋白的結合位點，可影響基因的轉錄水平。PDC基因的啟動子序列未知，為獲得大量該基因啟動子所在片段，可利用限制酶將基因組DNA進行酶切，然后在________的作用下將已知序列信息的接頭片段連接在PDC基因的上游，根據接頭片段和PDC基因編碼序列設計引物進行________。(2)利用質粒A構建含有PDC基因啟動子片段的重組質粒并導入代謝缺陷型酵母菌，用不含________的培養基可篩選出成功轉化的酵母菌Y1H。質粒G上的AD基因表達出的AD蛋白與啟動子足夠靠近時，能夠激活后續基因轉錄，因此需獲得待測蛋白與AD蛋白的融合蛋白用于后續篩選。科研人員從中國甜柿中提取RNA，將逆轉錄形成的各種________與質粒G連接后導入酵母菌，此時應選擇質粒G中的位點________(填序號1～5)作為cDNA的插入位點，最終獲得攜帶不同cDNA片段的酵母菌群Y187。(3)重組酵母Y187與Y1H能夠進行接合生殖，形成的接合子含有兩種酵母菌質粒上的所有基因。若接合子能在含有金擔子素的培養基中生存，則推測待測蛋白是PDC基因的調控蛋白，請結合圖3闡述作出該推測的理由________________________________________________________________________________________________________________________________________。(4)篩選出PDC基因的調控蛋白后，為滿足生產上的需要對其進行改良，這種技術屬于________工程，該工程的起點是_________________________________。9.干擾素是動物體內的一種蛋白質，可以用于治療病毒的感染和癌癥，但在體外保存相當困難。如果將其分子上的一個半胱氨酸變成絲氨酸，就可在－70℃下保存半年，給廣大患者帶來福音。回答下列問題：Ⅰ.(1)天然蛋白質合成的過程是按照克里克提出的________進行的，而蛋白質工程卻與之相反。依據蛋白質工程原理，設計實驗流程，讓動物生產可以保存的干擾素，其基本途徑是：預期蛋白質的功能→設計________→推測應有的氨基酸序列→找到并改變相對應的脫氧核苷酸序列(基因)或合成新的基因→獲得所需要的蛋白質。(2)上述過程設計的脫氧核苷酸序列________(填“是”或“不是”)唯一的。該方法獲得的干擾素基因與細胞內干擾素基因相比，結構上不同之處有________________________________________________________________________________________________________________________________________。(3)設計改造干擾素，最終還必須通過________來完成，原因是___________________________________________________________________。Ⅱ.我國研究人員通過利用一只Bmal1基因(影響生物節律)敲除徹底，且生物節律紊亂特征最為明顯的獼猴的體細胞細胞核，成功獲得5只克隆疾病猴。請回答下列問題：(1)為得到更多的卵母細胞用于核移植，可對卵細胞供體猴使用________處理，使其超數排卵，收集并選取處于________(時期)的卵母細胞。(2)在體細胞的細胞核移植到受體卵母細胞之前，必須去掉____________________，原因是________________________________________________________________________________________________________。(3)體細胞克隆猴常作為人類疾病研究的實驗動物模型，與用多只普通猴做實驗相比，使用遺傳背景相同的克隆猴做實驗的優點是________________________________________________________________________________________________________________________________________。10.β－地中海貧血是一種常染色體隱性遺傳病，我國南方這種遺傳病的常見病因是血紅蛋白β珠蛋白基因(HBB)編碼區4個堿基(3′－CTTT－5′)缺失。下圖1是一種基因治療β－地中海貧血的技術路線，圖2是圖1過程③外源DNA導入iPS細胞(誘導多能干細胞)后，在細胞內利用CRISPR/Cas9基因編輯系統和外源單鏈DNA及DNA自我修復系統進行基因治療的主要過程。請據圖回答問題。圖2(1)利用患者的成纖維細胞誘導形成iPS細胞，不僅可以避免在進行細胞移植時發生________，還因為iPS細胞能_______________________________________________________________________________________________________，可獲得足夠多的回輸細胞。(2)根據圖2分析，在利用CRISPR/Cas9基因編輯技術進行基因修復時，需要根據_______________________________________________________________________________________________________________________________________設計2種gRNA；導入單鏈DNA作為修復模板的目的是___________________________________________________________________。(3)圖1過程③中，研究人員將gRNA基因與Cas9基因分別整合到不同的載體中，這是因為整合到同一載體中會__________________________________________，不容易導入細胞。研究人員將gRNA載體、Cas9載體和單鏈DNA按一定比例與iPS細胞混合后，對混合液進行瞬時高壓電激處理，其目的是_______________________________________________________________________________________________________________________________________。(4)導入iPS細胞的gRNA基因和Cas9基因需要利用細胞中的________催化合成gRNA和Cas9mRNA，后者指導合成Cas9蛋白，并組裝成CRISPR/Cas9系統。圖2中酶B的功能是________。(5)為檢測iPS細胞中HBB基因是否正確修復，研究人員設計特異引物時，最好將插入片段(CTTT)或互補序列設計在引物的________端。在PCR時可________，以提高引物結合的特異性。11.乳腺炎和口蹄疫分別是由細菌和病毒引起的危害奶牛養殖業的兩種嚴重疾病。研究者利用生物技術培育出轉牛乳鐵蛋白肽(抗細菌)和干擾素(抗病毒)基因的雙轉基因奶牛品種。下圖1為基因表達載體，圖2為培育流程。請據圖回答問題：(1)構建基因表達載體時需要用到的工具酶是__________________________________________________________________。(2)基因表達過程包括________，圖1中一般能同時表達的基因是___________________________________________________________________。新霉素抗性基因的作用是____________________________________________。(3)圖2中研究者可利用_______________________________________________技術篩選出干擾素基因成功表達的胚胎進行移植。(4)若利用PCR技術增加目的基因的數量，由圖3可知，A、B、C、D四種單鏈DNA片段中應選取________作為引物(DNA復制子鏈的延伸方向5′→3′)。若上圖所示基因復制2次，則共需要這兩種引物各________個；PCR程序中“適溫延伸”中的適溫是________酶的最適溫度。答案：1.C據題意可知，限制性內切核酸酶EcoRⅠ的識別序列為則理論上，該序列出現的概率為1/(4×4×4×4×4×4)＝1/4096，即4096個堿基對序列中會出現一個限制性內切核酸酶EcoRⅠ的識別序列，故用限制性內切核酸酶EcoRⅠ完全酶切果蠅基因組DNA，理論上得到DNA片段的平均長度(堿基對個數)約為4000，C符合題意。2.ADNA連接酶不能連接單鏈DNA片段，DNA聚合酶是將單個脫氧核苷酸加到已有的核苷酸片段上，B錯誤；E.coliDNA連接酶只能連接有黏性末端的DNA片段，C錯誤；T4DNA連接酶既可以連接有黏性末端的DNA片段，也可以連接有平末端的DNA片段，D錯誤。3.A將抗蟲基因導入受體細胞可以采用農桿菌轉化法，但檢測目的基因是否導入受體細胞一般采用PCR等技術，A錯誤；檢測抗蟲基因是否轉錄mRNA，用PCR等技術，B正確；檢測目的基因是否翻譯成蛋白質，常用抗原—抗體雜交技術，C正確；檢測抗蟲蛋白生物功能，可在個體水平進行抗蟲接種實驗，讓害蟲來食用棉花葉片，做毒性檢測，D正確。4.B將經過堿性磷酸單酯酶處理的載體與外源DNA連接時，由于5′－OH與3′－OH不能連接而形成切口(nick)，因此經堿性磷酸單酯酶處理的載體不會發生自身環化，A正確；外源DNA不能用堿性磷酸單酯酶處理，如用堿性磷酸單酯酶處理，載體與外源DNA不能連接形成重組DNA，B錯誤；T4DNA連接酶可連接黏性末端和平末端，C正確；DNA進行半保留復制，1個重組DNA經過2次復制，可得到2個不含nick的子代DNA，D正確。5.C獲得的目的基因可利用PCR技術在體外反應體系中擴增，A正確；酶的作用條件較溫和，不同的酶其適宜的溫度和pH不同，在多酶催化體系中，可能會因為酶的最適反應條件不同而使反應中斷，B正確；該方法在分子水平上，通過改變基因的堿基序列，間接改變氨基酸的序列，從而改變蛋白質的結構，實現對酶特性的改造和優化，C錯誤；該科研實現了在細胞外從二氧化碳固定到合成淀粉的過程，若成熟后推廣應用有助于擺脫耕地和自然環境限制，解決糧食危機，D正確。6.CFoKI是非特異性內切核酸酶，單獨使用FoKI對基因的切割敲除具有隨機性，A正確；TALE蛋白的合成通常涉及PCR技術(擴增得到很多TALE基因)和蛋白質工程(對基因進行改造，得到很多蛋白質)，B正確；氨基酸內沒有堿基，不能與四種含氮堿基發生恒定的堿基互補配對，只是存在恒定的對應關系，C錯誤；由于TALE的二連氨基酸(字母N、I、G、H、D分別代表一種氨基酸)與四種堿基(A、G、C、T)有恒定的對應關系，TALE蛋白左右臂的二連氨基酸序列的設計依據靶基因堿基序列，D正確。7.CD轉錄需要RNA聚合酶，DNA聚合酶與DNA復制有關，A錯誤；T－DNA以雙鏈形式整合到受體細胞的染色體DNA上，B錯誤；重組質粒上含有潮霉素抗性基因，可以在培養基中加入潮霉素，篩選含有重組質粒的水稻細胞，C正確；Luc基因表達的熒光素酶能催化熒光素產生熒光，融合基因表達的蛋白質能保留兩種蛋白質各自的功能，B－Luc融合基因表達，會使加入熒光素的卵細胞中發出熒光，D正確。8.(1)RNA聚合酶識別和結合DNA連接酶PCR(2)尿嘧啶cDNA2(3)接合子中待測蛋白與AD蛋白形成了融合蛋白，若待測蛋白是PDC基因的調控蛋白，就能與PDC基因啟動子結合，AD蛋白也能靠近PDC基因啟動子并激活金擔子素抗性基因的表達，使酵母菌表現出金擔子素抗性(4)蛋白質預期蛋白質的功能解析(1)啟動子是RNA聚合酶識別和結合的位點，直接決定轉錄起始。限制酶切割后需要在DNA連接酶的作用下將已知序列信息的接頭片段連接在PDC基因的上游；已知接頭片段連接在PDC基因的上游，且已知序列信息，則可以按照PDC基因啟動子上游的接頭片段與PDC基因編碼序列設計引物進行PCR擴增。(2)由質粒A的圖譜可知帶有選擇功能的基因片段有尿嘧啶合成基因、金擔子素抗性基因兩種，但是金擔子素抗性基因無法啟動，所以選擇尿嘧啶合成基因作為選擇依據，則在選擇培養基配制時不加尿嘧啶。從中國甜柿中提取的RNA可以通過逆轉錄形成各種cDNA，將各種cDNA片段與質粒G連接后導入酵母菌，插入時不能破壞其他蛋白質基因的表達，而且需要插入到啟動子和終止子之間才能保證表達，因此選擇位點2作為cDNA的插入位點。(3)依據題干，重組酵母Y187與Y1H接合子應同時含有質粒A、質粒G，質粒A為含有PDC基因、金擔子素抗性基因的質粒；質粒G為可正常表達AD蛋白、待測蛋白的質粒，接合子中待測蛋白與AD蛋白形成了融合蛋白，若待測蛋白是PDC基因的調控蛋白，就能與PDC基因啟動子結合，則AD蛋白攜帶的待測蛋白靠近PDC基因啟動子，激活PDC基因的轉錄，并激活金擔子素抗性基因的表達，使酵母菌表現出金擔子素抗性。(4)篩選出PDC基因的調控蛋白后，為滿足生產上的需要對其進行改良，這種技術屬于蛋白質工程，蛋白質工程的設計流程為預期蛋白質的功能→設計預期的蛋白質結構→推測應有的氨基酸序列→找到并改變相對應的脫氧核苷酸序列(基因)，所以起點是預期蛋白質的功能。9.Ⅰ.(1)中心法則預期的蛋白質結構(2)不是該方法獲得的干擾素基因不含內含子、啟動子和終止子(3)改造基因基因控制蛋白質的合成，并且基因能遺傳給下一代Ⅱ.(1)促性腺激素MⅡ(2)受體卵母細胞的細胞核確保核移植的胚胎或動物細胞核中的遺傳物質全部來自供體細胞(3)避免個體間差異對實驗的干擾解析Ⅰ.(1)天然蛋白質合成的過程是按照克里克提出的中心法則進行的，蛋白質工程基本途徑是預期蛋白質的功能→設計預期蛋白質的結構→推測應有的氨基酸序列→改變相對應的脫氧核苷酸序列(基因)或合成新的基因→獲得所需要的蛋白質。(2)因為密碼子的簡并性，由氨基酸序列推測得到的相應脫氧核苷酸序列不是唯一的，通過該方法獲得的干擾素基因序列是由氨基酸序列推測的，所以與細胞內的干擾素基因相比，缺少內含子、啟動子和終止子等片段。(3)干擾素的本質是蛋白質，是由基因控制編碼的，基因控制蛋白質的合成，并且基因能遺傳給下一代，所以改造干擾素最終需要改造基因。Ⅱ.(1)為得到更多的卵母細胞，可以對供體猴使用促性腺激素處理，使其超數排卵，收集處于MⅡ時期的卵母細胞。(2)本實驗使用細胞核移植技術，為了使核移植的胚胎或動物細胞核中的遺傳物質全部來自供體細胞，在體細胞的細胞核移植到受體卵母細胞之前，必須去掉受體卵母細胞的細胞核。(3)使用遺傳背景相同的克隆猴做實驗的優點是避免個體間差異對實驗的干擾。10.(1)免疫排斥在體外培養時不斷增殖，并可誘導分化形成造血干細胞(2)HBB堿基缺失部位兩側的核苷酸序列正確修復基因(能獲得在指定部位插入缺失堿基CTTT的正常HBB基因)(3)使重組DNA分子過大使重組載體和單鏈DNA更易導入iPS細胞(4)RNA聚合酶催化游離脫氧核苷酸連接到核苷酸鏈上(催化以導入的單鏈DNA為模板的核苷酸鏈的延伸)(5)3′適當提高復性溫度解析(1)由于iPS細胞是從病人體內獲取并改造的，故將iPS細胞增殖分化出的不同細胞移植回病人體內，理論上可以避免免疫排斥反應；iPS細胞具有干細胞的特點，能夠在體外培養時不斷增殖，并可誘導分化形成造血干細胞，故在體外培養可獲得足夠多的回輸