CCSC05T/LNSI009-2024 II 12規(guī)范性引用文件 13術(shù)語(yǔ)和定義 14符號(hào)和縮略語(yǔ) 25技術(shù)要求 26檢驗(yàn)方法 37檢驗(yàn)規(guī)則 48使用說(shuō)明 59標(biāo)簽 10包裝、儲(chǔ)存及運(yùn)輸 611廢棄物處理 6附錄A（規(guī)范性）細(xì)胞標(biāo)志性蛋白和純度檢測(cè)流式細(xì)胞測(cè)定法 T/LNSI009-2024本文件按照GB/T1.1-2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化的文件結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。本文件由沈陽(yáng)艾米奧生物工程技術(shù)研發(fā)中心有限公司、沈陽(yáng)市再生生物醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提出。本文件由遼寧省免疫學(xué)會(huì)歸口。本文件起草單位：沈陽(yáng)艾米奧生物工程技術(shù)研發(fā)中心有限公司、沈陽(yáng)市再生生物醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、中國(guó)醫(yī)科大學(xué)干細(xì)胞與再生醫(yī)學(xué)研究室、沈陽(yáng)干細(xì)胞與再生醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、遼寧艾米奧干細(xì)胞與再生醫(yī)學(xué)研究院有限公司、遼寧省細(xì)胞生物學(xué)學(xué)會(huì)、遼寧省生物技術(shù)協(xié)會(huì)、沈陽(yáng)市干細(xì)胞與再生醫(yī)學(xué)產(chǎn)業(yè)技術(shù)創(chuàng)新聯(lián)盟、沈陽(yáng)藥科大學(xué)、中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院、中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院、中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院、艾米奧國(guó)際干細(xì)胞醫(yī)院有限公司。本文件主要起草人：龐希寧、龐然、施萍、赫甡、高航、姜雯宇、宋揚(yáng)、郭然、單風(fēng)平、王竟、孟濤、劉純燕、李曉航、王莉莎、徐東芬、荊晶、謝光麟、邵錫柱、張美玲、聶宏光、郎宏鑫、劉曉玉、王喜良、張濤、趙峰、張殿寶、王瑞、李彩虹、李宏圖、潘長(zhǎng)偉、孔娟、王哲、王蔚、殷軍、張寧、李津陽(yáng)、王靜、王嬌。1T/LNSI009-2024人自然殺傷細(xì)胞本文件規(guī)定了人自然殺傷細(xì)胞的技術(shù)要求、檢驗(yàn)方法、檢驗(yàn)規(guī)則、使用說(shuō)明、標(biāo)簽、包裝、儲(chǔ)存、運(yùn)輸和廢棄物處理要求。本文件適用于人體組織分離的活干細(xì)胞分化或轉(zhuǎn)分化獲得的人自然殺傷細(xì)胞的質(zhì)量控制。本文件適用于抗體誘導(dǎo)的純因子培養(yǎng)法培養(yǎng)的人自然殺傷細(xì)胞。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件。不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。WS213丙型肝炎診斷WS273梅毒診斷WS293-2019《艾滋病和艾滋病病毒感染診斷》T/CSCB0001-2022《人干細(xì)胞研究倫理審查技術(shù)規(guī)范》T/CSCB0002-2022《人自然殺傷細(xì)胞》中華人民共和國(guó)藥典（2020年版）全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程3術(shù)語(yǔ)和定義3.1人自然殺傷細(xì)胞humannaturalkillercells人體組織分離的或干細(xì)胞分化或轉(zhuǎn)分化獲得的，具有非特異性殺傷、抗體依賴(lài)性細(xì)胞毒性、免疫調(diào)節(jié)功能的固有淋巴細(xì)胞。2T/LNSI009-20244符號(hào)和縮略語(yǔ)下列符號(hào)和縮略語(yǔ)適用于本文件。ADCC——抗體依賴(lài)細(xì)胞毒性（Antibody-DependentCellularCytotoxicity）NK——自然殺傷細(xì)胞（NaturalKillerCells）CD——自然殺傷細(xì)胞膜表面分化抗原簇（ClusterofDifferentiation）STR——短串聯(lián)重復(fù)序列（ShortTandemRepeat）Calein-AM——鈣黃綠素乙酰氧基甲酯（CalceinAcetoxymethylEsterr）5技術(shù)要求5.1細(xì)胞形態(tài)體外培養(yǎng)呈懸浮狀，活化后體積變大或形狀變?yōu)椴灰?guī)則，周?chē)梢?jiàn)一個(gè)或多個(gè)偽足樣突起。5.2染色體核型正常核型應(yīng)為46,XX或46,XY。5.3細(xì)胞標(biāo)志蛋白CD3陰性CD56陽(yáng)性率≥70%。5.4細(xì)胞純度具有CD56標(biāo)志蛋白陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞含量≥80%。5.5細(xì)胞存活率新鮮制備未凍存細(xì)胞≥90%；凍存細(xì)胞復(fù)蘇后應(yīng)用前≥70%5.6微生物真菌、細(xì)菌、支原體、衣原體、HIV、HBV、HCV、HTLV、EBV、HCMV、TP等均應(yīng)為陰性。5.7內(nèi)毒素內(nèi)毒素應(yīng)≤0.5EU/mL。5.8細(xì)胞STR鑒定3T/LNSI009-2024人體組織分離的或干細(xì)胞分化或轉(zhuǎn)分化獲得的人自然殺傷細(xì)胞，應(yīng)進(jìn)行STR檢測(cè)及分型鑒定，無(wú)樣品間的交叉污染。6檢驗(yàn)方法6.1細(xì)胞形態(tài)使用倒置顯微鏡×400倍觀察細(xì)胞，體外二維懸浮培養(yǎng)條件中，靜息狀態(tài)下呈圓形或不規(guī)則形懸浮生長(zhǎng)，激活后形態(tài)變大變長(zhǎng)。6.2染色體核型按照《中華人民共和國(guó)藥典(2020年版)》中“生物制品生產(chǎn)檢定用動(dòng)物細(xì)胞基質(zhì)制備及檢定規(guī)程”項(xiàng)檢驗(yàn)。注：根據(jù)目的樣本特性確定應(yīng)有的核型結(jié)果。正常核型應(yīng)為46,XX或46,XY。6.3細(xì)胞標(biāo)志性蛋白按照附錄A的方法檢驗(yàn)。6.4細(xì)胞純度按照附錄A的方法檢驗(yàn)。6.5細(xì)胞存活率按照T/CSCB0002—2020檢驗(yàn)。6.6微生物真菌、細(xì)菌、支原體和衣原體按照《中華人民共和國(guó)藥典(2020年版)》檢驗(yàn)。人類(lèi)免疫缺陷病毒按照WS293-2019檢驗(yàn)。乙型肝炎病毒、人類(lèi)嗜T細(xì)胞病毒、人類(lèi)皰疹病毒、人巨細(xì)胞病毒按照《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》檢驗(yàn)。丙型肝炎病毒按照WS213檢驗(yàn)。梅毒螺旋體按照WS273檢驗(yàn)。6.7內(nèi)毒素內(nèi)毒素按照《中華人民共和國(guó)藥典(2020年版)》檢驗(yàn)。6.8細(xì)胞STR鑒定4T/LNSI009-2024按照T/CSCB0002—2020檢驗(yàn)。7檢驗(yàn)規(guī)則7.1批在一個(gè)生產(chǎn)周期在中，同一生產(chǎn)線、同一來(lái)源、同一代次、同一方法制備出來(lái)的產(chǎn)品為一批。7.2抽樣在同一批的產(chǎn)品中隨機(jī)抽取3個(gè)最小包裝單位。7.3出廠檢驗(yàn)7.3.1每批產(chǎn)品應(yīng)進(jìn)行出廠檢驗(yàn)，并附檢驗(yàn)報(bào)告。7.3.2出廠檢驗(yàn)項(xiàng)目應(yīng)包括第5章規(guī)定的所有項(xiàng)目。7.4復(fù)核檢驗(yàn)若客戶(hù)需要，應(yīng)由第三方專(zhuān)業(yè)細(xì)胞檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)或?qū)嶒?yàn)室進(jìn)行復(fù)核檢驗(yàn)，檢驗(yàn)項(xiàng)目應(yīng)包括第5章規(guī)定的所有項(xiàng)目。7.5判定規(guī)則7.5.1出廠檢驗(yàn)項(xiàng)目全部符合第5章規(guī)定，判為合格品；有1項(xiàng)及以上不符合本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，則判為不合格品。7.5.2復(fù)核檢驗(yàn)項(xiàng)目全部符合第5章規(guī)定，判為合格品；有1項(xiàng)及以上不符合本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，則判為不合格品。8產(chǎn)品使用說(shuō)明書(shū)至少包括以下內(nèi)容：a）產(chǎn)品名稱(chēng)；b）細(xì)胞代次；c）細(xì)胞數(shù)量；d）生產(chǎn)日期；5T/LNSI009-2024e）生產(chǎn)批號(hào)；f）生產(chǎn)組織；g）儲(chǔ)存條件；h）運(yùn)輸條件；i）使用方法；j）執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)號(hào)；k）生產(chǎn)地址；l）聯(lián)系方式；m）郵政編碼；n）注意事項(xiàng)。注：根據(jù)用戶(hù)需求，可標(biāo)注內(nèi)毒素含量。9產(chǎn)品標(biāo)簽至少包括以下內(nèi)容：a）產(chǎn)品名稱(chēng)；b）細(xì)胞代次；c）細(xì)胞數(shù)量；d）生產(chǎn)批號(hào)；e）生產(chǎn)組織；f）生產(chǎn)日期。10包裝、儲(chǔ)存及運(yùn)輸10.1包裝應(yīng)選擇對(duì)人自然殺傷細(xì)胞關(guān)鍵質(zhì)量屬性無(wú)影響的袋或瓶中，應(yīng)選用100毫升0.9%生理鹽水袋或瓶。10.2儲(chǔ)存10.2.1應(yīng)符合T/CSCB0001—2020要求。10.2.2應(yīng)在低于-130℃環(huán)境下儲(chǔ)存。10.3運(yùn)輸6T/LNSI009-202410.3.1應(yīng)符合T/CSCB0001—2020要求。10.3.2凍存的細(xì)胞應(yīng)在干冰或低于-130℃條件下運(yùn)輸，非凍存細(xì)胞建議在2℃~8℃下運(yùn)輸。11廢棄物處理11.1建立廢棄細(xì)胞管理文檔人自然殺傷細(xì)胞生產(chǎn)和檢查過(guò)程中產(chǎn)生的廢棄物應(yīng)建立廢棄細(xì)胞管理文檔，嚴(yán)格執(zhí)行管理規(guī)范并詳細(xì)記錄。11.2不合格的細(xì)胞、剩余廢棄的細(xì)胞或捐贈(zèng)物處理辦法人自然殺傷細(xì)胞研究和生產(chǎn)中不合格的細(xì)胞、剩余廢棄的細(xì)胞或捐贈(zèng)物，應(yīng)進(jìn)行合法、妥善并符合倫理的處理。T/LNSI009-2024細(xì)胞標(biāo)志性蛋白和純度檢測(cè)流式細(xì)胞測(cè)定法A.1儀器和設(shè)備A.1.1流式細(xì)胞儀。A.1.2離心機(jī)。A.2試劑A.2.1PBS溶液。A.2.22%胎牛血清液（2%FBS）。A.2.3CD3、CD56抗體。A.2.4按照相應(yīng)要求配制流式檢驗(yàn)所需的液體：洗滌液、抗體稀釋液。A.3樣品保存洗滌液和染色后的樣品于2℃~8℃保存。相關(guān)抗體按說(shuō)明書(shū)保存。A.4檢測(cè)步驟A.4.1樣品準(zhǔn)備和抗體孵育收集單細(xì)胞，250g離心3min。棄上清，加入適量稀釋后的抗體進(jìn)行孵育（按照抗體說(shuō)明書(shū)進(jìn)行稀釋使用）。A.4.2流式細(xì)胞術(shù)分析用洗滌液重懸細(xì)胞，然后通過(guò)40μm濾網(wǎng)轉(zhuǎn)移到流式管中，按流式細(xì)胞儀