關于熒光顯微鏡的基本使用方法實驗目的1.了解熒光顯微鏡的基本原理；2.掌握熒光顯微鏡的基本結構和使用注意事項；第2頁,共22頁，星期六，2024年，5月自發性熒光物質神經細胞和心肌細胞等內的脂褐素呈棕黃色熒光。肝貯脂細胞和視網膜色素上皮細胞內的維生素A呈綠色熒光。某些神經內分泌細胞和神經纖維內的單胺類物質（兒茶酚胺、5－羥色胺、組胺等）在甲醛作用下呈不同顏色的熒光。組織內含有的奎寧、四環素等藥物也呈現一定的熒光。嗜中性粒細胞中脫氫酶輔酶呈現一定的熒光。第3頁,共22頁，星期六，2024年，5月第4頁,共22頁，星期六，2024年，5月優點：檢出能力高對細胞的刺激小能進行多重染色用途：物體構造的觀察熒光的有無、色調比較進行物質判別發熒光量的測定對物質定性、定量分析熒光顯微鏡的優點和用途第5頁,共22頁，星期六，2024年，5月實驗原理光源激發濾色鏡分色鏡發射濾色鏡（阻擋濾片）第6頁,共22頁，星期六，2024年，5月實驗原理熒光顯微鏡的光路及主要部件光源激發光擋片激發濾色鏡分色鏡發射濾色鏡第7頁,共22頁，星期六，2024年，5月第8頁,共22頁，星期六，2024年，5月Microscopeswithanupright-styleframearecapableofproducingfluorescenceilluminationeitherthroughepiscopicordiascopicopticalpathways,althoughthelatterisrarelyusedtoday.Epi-illuminatorsusuallyconsistofamercuryorxenonlamphousecoupledtoaverticalilluminatorthatispositionedabovethemainframeinaseparateassembly.Themicroscopenosepieceandtransmittedlightcomponents(diascopicilluminator,condenser,fielddiaphragm,filters,etc.)arebuiltintothemainframe,whilefluorescencecomponentsarehousedintheverticalilluminator.Theseilluminatorsoftencontainarevolvingorslidingturretthathousesfourtosix"cubes"thatcontainamixtureofinterferencefiltersincludingabarrierfilter,dichroicmirror,andanexcitationfilter.Asillustratedabove,lightemittedfromthelamppositionedintheepiscopiclamphousepassesthroughacollectorlensandthenthefieldandaperturediaphragmsbeforeenteringthefirstinterferencefilterinthecubeset,theemissionfilter.Thislightisthendirectedthroughtheobjectiveandontothespecimenbyaspecialdichroicmirrorthatreflectscertainwavelengthswhilepassingothers.Secondaryfluorescence,emittedbyfluorophoresresidinginthespecimen,travelsbackthroughtheobjectiveandthedichroicmirrorbeforepassingthroughabarrierfilterandintothemicroscopeeyepiecesorcamerasystem.第9頁,共22頁，星期六，2024年，5月激發光源高壓汞燈擁有313,337,365,405,436,546,and577

納米的峰值譜。高壓

Xenon燈有連續的可見光光譜范圍,光源強度比較平均。汞燈光譜第10頁,共22頁，星期六，2024年，5月激發濾色塊具有多套激發濾色塊：激發濾色鏡（ExcitationFilter），分光鏡（DichromaticMirror），發射濾色鏡（EmissionFilter）。激發濾色塊六孔激發塊轉盤第11頁,共22頁，星期六，2024年，5月多用途型BX-RFA(適合多種科研要求)及通用型BX-URA2。可同時使用6種熒光激發塊，“輕撥式”激發塊轉換功能，使不同熒光激發之間的迅速轉換非常方便，并可消除震動，有利于復染樣品的熒光觀察。激發塊標識在暗室環境中發光，在暗室中也能很容易地選擇需要的熒光激發塊。另外，根據需要還可以選擇6孔濾色片滑塊(U-RSL6/U-RSL6EM)安放激發濾色片和發射濾色片進行熒光觀察。第12頁,共22頁，星期六，2024年，5月第13頁,共22頁，星期六，2024年，5月BX51在鏡基上裝有3個濾色片（ND6，ND25，LBD），另外，還可以選裝第四個。鏡基側面的拉桿可以很容易地插入/取出濾色鏡。SpecimencolorfadingcanbedelayedbyreducingtheexcitationlightintensitywithNDfilters.UsetheNDfiltersasfarastheydonothinderobservations.InserttheNDfilters(U-25ND6and/orU-25ND25)withthemarkedsidefacingtowardtheobserver.第14頁,共22頁，星期六，2024年，5月第15頁,共22頁，星期六，2024年，5月1、

該鏡可作為明視場顯微鏡使用，也可作為熒光顯微鏡使用，根據需要，做相應的附件連接，開啟相應的電源。禁止亂調設置，以免影響他人正常使用。

2、

作為明視場顯微鏡使用；A、接通電源后，打開顯微鏡底座前的電源開關，按光亮需要調節底座右側的滑竿。B、根據需要，調節底座光柵和聚光器光柵及其高度，可獲得最佳的圖象效果。C、需要圖片，要把鏡體上的相應拉桿拉到綠線位子。按下相應附件上的照相按扭。

3、

作為熒光顯微鏡使用；A、先關閉熒光通道，再打開熒光激發器電源，等待15分鐘。B、等待期間，打開顯微鏡光源，找到需要觀察的樣品，選用合適的物鏡，調整焦距。C、關閉顯微鏡光源，打開熒光通道。D、需要圖片，要把鏡體上的相應拉桿拉到綠線位子。按下相應附件上的照相按扭。第16頁,共22頁，星期六，2024年，5月細胞核與細胞質DNA的直接熒光染色第17頁,共22頁，星期六，2024年，5月線粒體GFP轉基因擬南芥根（顯示葉綠體）葉片第18頁,共22頁，星期六，2024年，5月注意事項激發光擋片的使用----減少淬滅第19頁,共22頁，星期六，2024年，5月注意事項熒光的淬滅與激發光的照射時間成正比，因此應盡量減少觀察時間外激發光對樣品的照射。激發光擋片可以部分或完全阻斷激發光光路。在正式觀察樣品之前，激發光光路應該處于完全阻斷狀態。否則，在我們將樣品放到載物臺上，移動樣品臺將樣品調整到物鏡位置，找到要觀察的細胞并進行調焦的過程中，樣品上的熒光可能已經發生了相當程度的淬滅。為了避免觀察前不必要的淬滅，上述一系列操作需要在透射光源下進行。當眼睛離開物鏡進行記錄或將顯微鏡交給合作實驗者觀察時，要隨手阻斷激發光光路。實踐結果表明，熟練、規范和合理的觀察操作可以將樣品淬滅對觀察和記錄造成的影響降低到最小限度。熒光信號的淬滅還與激發光的強度成正比。因此，在可以觀察到熒光信號的情況下，應該盡量降低激發光的強度。這樣做還有利于降低背景。第20頁,共22頁，星期六，2024年，5月NOTESTheinsideoftheultrahigh-pressuremercuryburnerisveryhotandhazardousduringlightingandforabout10minutesafterturningoff.Donotopenthelamphousinginthisperiod.Themercuryburnerhasaservicelifeperiodof200hours(USH102D)or300hours(HBD103W/2).Whenthehourcounteronthepowersupplyunitindicatesthisvalue,setthemainswitchto“O”(OFF)andwaitformorethan10minutesbeforereplacingthemercuryburner.Unlikeelectricbulbs,themercuryburnerse