Chapter6

EnzymeKineticsMetabolicControlAnalysis代謝通量分析可以找到需要優(yōu)化的途徑（通量），而如何快速有效地實(shí)現(xiàn)對(duì)目的途徑（通量）的優(yōu)化呢？需要知道途徑中各單個(gè)反應(yīng)速率變化對(duì)目標(biāo)通量的影響程度，顯然改造那些具有較大影響程度的反應(yīng)的效果最好。Metaboliccontrolanalysisisamethodforanalysinghowthecontroloffluxesandintermediateconcentrationsinametabolicpathwayisdistributedamongthedifferentenzymesthatconstitutethepathway.

EnzymekineticsMetabolicControlAnalysis6.1酶動(dòng)力學(xué)單底物的酶催化反應(yīng)動(dòng)力學(xué)模型:由V.C.R.Henri于1902年及L.Michaelis和M.L.Menten于1913年建立的。簡(jiǎn)單的酶催化反應(yīng)動(dòng)力學(xué)通常是指Michaelis-Menten動(dòng)力學(xué)或飽和動(dòng)力學(xué)。E+SESE+P兩個(gè)假定：1.形成ES復(fù)合物的反應(yīng)速度很快.2.第二步的逆反應(yīng)速率可忽略。此假設(shè)僅在反應(yīng)初期產(chǎn)物的累積量很少時(shí)才能成立。（快速平衡假設(shè)）

1925年Briggs及Haldane在快速平衡假設(shè)基礎(chǔ)上做了改進(jìn)：擬穩(wěn)態(tài)假設(shè),此假設(shè)在反應(yīng)初期不成立，經(jīng)過(guò)短暫過(guò)渡期后（ms)成立（P193,note6.1）。（1）米氏方程的推導(dǎo)快速平衡假設(shè)擬穩(wěn)態(tài)假設(shè)E+SESE+PKm’:即ES的解離常數(shù),單位濃度下復(fù)合物解離速度與形成速度之比Km:單位濃度下復(fù)合物總解離速度與形成速度之比Kcat=Vm/[E0]=k2

Kcat/Km

[S]<<Km時(shí)，[S]>>Km時(shí)，[S]=Km時(shí)，參數(shù)的確定：雙倒數(shù)作圖法產(chǎn)物濃度很低時(shí)，即米氏方程I=0I>0競(jìng)爭(zhēng)性抑制的最終作用結(jié)果是使，因此降低了反應(yīng)速度。最大反應(yīng)速度不變。競(jìng)爭(zhēng)性抑制可通過(guò)提高底物濃度來(lái)克服。(2)Competitiveinhibitionenzymekinetics(3)Non-competitiveinhibitionenzymekinetics非競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑不是底物類似物。抑制劑與酶結(jié)合的位點(diǎn)不是酶的活性位點(diǎn)，這種結(jié)合降低了酶的有效濃度。高底物濃度不能克服非競(jìng)爭(zhēng)性抑制。必須加入其它試劑去阻止抑制劑與酶的結(jié)合。I=0I>0(4)Uncompetitiveinhibitionenzymekinetics反競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑只與ES復(fù)合物結(jié)合，而且它與酶無(wú)親和作用。Vm值的降低要比Km值的降低更具顯著作用，其最終結(jié)果是使反應(yīng)速率降低。I=0I>0(5)Substrateinhibitionenzymekinetics如果底物自身有抑制作用：一種反競(jìng)爭(zhēng)抑制，1/v是1/s的雙曲函數(shù)，該雙曲函數(shù)具有一垂直和一傾斜漸近線在低底物濃度時(shí)，[S]2/KSI<<1，觀察不到抑制作用。反應(yīng)速率為

在高底物濃度時(shí)，K’m/[S]<<1，抑制作用顯著。這種情況下反應(yīng)速率為

P199Example6.1產(chǎn)物是抑制劑的非競(jìng)爭(zhēng)產(chǎn)物抑制最適底物的判斷：（P204的推導(dǎo)）三個(gè)動(dòng)力學(xué)參數(shù)的確定：通過(guò)上圖得到四條回歸直線在X軸上截距，求得Km(四個(gè)數(shù)據(jù)的平均值）通過(guò)下圖回歸直線與Y軸截距得到Km/Vm，進(jìn)而求出Vm，進(jìn)而通過(guò)斜率求出KI變構(gòu)酶的特點(diǎn)具有協(xié)同作用的酶——變構(gòu)酶一般具有多個(gè)調(diào)節(jié)位點(diǎn)（效應(yīng)物）與催化位點(diǎn)（底物）。它們大多是幾個(gè)亞基聚集而成的多聚體酶，具有四級(jí)結(jié)構(gòu)，這些亞基可以不同，也可以完全相同。動(dòng)力學(xué)特征：S型曲線，而不是米氏方程的雙曲線協(xié)同性(Cooperativity)(6)Cooperativityandallostericenzyme與一個(gè)底物分子的結(jié)合引起酶結(jié)構(gòu)的改變，導(dǎo)致剩余結(jié)合位點(diǎn)對(duì)底物親和力的升高，隨著更多的底物結(jié)合，親和力也越高，稱為正協(xié)同效應(yīng)。底物既是反應(yīng)物，又是調(diào)節(jié)分子。即底物自身的濃度充當(dāng)酶活的調(diào)節(jié)信號(hào)，可以在一個(gè)較小的底物濃度變化范圍內(nèi)引起酶活的快速、急劇的升高。有利于細(xì)胞針對(duì)生理環(huán)境變化采取快速的調(diào)控。雙曲線表明：M-M動(dòng)力學(xué)方程中r對(duì)s的敏感性不高，除非在底物濃度接近零時(shí)S型曲線表明：r對(duì)s的敏感性在底物濃度接近零時(shí)不高，而在正常底物濃度下十分敏感協(xié)同性使變構(gòu)酶在胞內(nèi)代謝物處于生理濃度附近（S=Km)起著反應(yīng)“開(kāi)關(guān)”的作用，對(duì)于細(xì)胞實(shí)現(xiàn)對(duì)反應(yīng)和代謝物濃度的快速調(diào)節(jié)具有重要意義。變構(gòu)酶的動(dòng)力學(xué)方程：Hill經(jīng)驗(yàn)方程底物同酶的結(jié)合具有協(xié)同性時(shí)，n>1。slpoe=nlns參數(shù)n和K的確定:P205:例6.2噻唑籃（MTT)法測(cè)定胞內(nèi)NADH濃度兩種底物MTT0X及乙醇過(guò)量，反應(yīng)中可以認(rèn)為濃度不變

ADH快速將NAD+還原為NADH，反應(yīng)體系中NADH濃度穩(wěn)定不變

d[MTTred]/dt=k[MTT0X][NADH]做標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖6.7），測(cè)定MTTred生成速度后在標(biāo)準(zhǔn)曲線上確定對(duì)應(yīng)的[NADH]

HK,PFK-1,andpyruvate

kinase(PYK)aretherate-limitingstepsbecause:Theyaretheslowestenzymesinthepathwaybyatleastoneorderofmagnitude(theyhavethelowestVmaxvalues).TheyareallostericenzymesInconsequence,tovarytheglycolyticflux,oneoftheseenzymeshastobemodified.GAPDHPGKENOPGAM6.2代謝控制分析EMP途徑通量控制分散，需要多個(gè)酶一起擴(kuò)增控制分析需要解決的問(wèn)題：修飾哪些酶？酶活改變多少？（1）基本概念與定理通量J反應(yīng)速率r

穩(wěn)態(tài)時(shí)，一條途徑的J等于這條途徑中任何一步反應(yīng)的r

線性途徑中最好的情況是：某步反應(yīng)速率r提高a%,達(dá)到新的穩(wěn)態(tài)后，這條途徑的其它所有反應(yīng)速率r均提高a%，從而流經(jīng)該反應(yīng)的通量也提高a%

最差的情況是：某步反應(yīng)速率r提高a%,達(dá)到新的穩(wěn)態(tài)時(shí)，其它所有反應(yīng)速率均不變化，該步反應(yīng)速率恢復(fù)到原水平，流經(jīng)該反應(yīng)的通量不能提高。更一般的情況是：某步反應(yīng)速率r提高a%,達(dá)到新的穩(wěn)態(tài)時(shí)，其它所有反應(yīng)速率均提高了b%，該步反應(yīng)速率從提高a%降至提高b%，流經(jīng)該反應(yīng)的通量提高b%。一般性原則：如何對(duì)這種影響程度實(shí)行量化？通量控制系數(shù)（FCCs)

由代謝途徑中一個(gè)酶活的無(wú)窮小變化所引起的通量的相對(duì)變化與該酶活的相對(duì)變化之比。通量控制系數(shù)（Fluxcontrolcoefficients)Channellingeffect

Channellingreferstomechanismsinwhichtheproductofoneenzymeistransferreddirectlytoanenzymethatusesitassubstratewithoutnecessarilypassingthroughthefreesolution.Onlyindependentcatalysts:酶活=酶濃度Manyenzyme-catalysedreactionratesarelinearintermsoftheenzymeconcentration(atleastinacertainrangeofenzymeconcentrations),controlcoefficientscanbewrittenusingenzymeconcentrations通量控制系數(shù)的加和定理

summationtheorem在線性途徑中酶促反應(yīng)的通量控制系數(shù)的和為1：Thesummationsareoverallthestepsofthesystem.Thismayincludenotonlythestepsofthepathwayofinterestbutalsoofotherpathways(aslongastherearelinksbetweenthem).Inprincipleforawholecell,thesummationwouldhavetobeoverallmetabolicstepsofthatcell.Giersch,C.(1988)Controlanalysisofmetabolicnetworks.1.Homogeneousfunctionsandthesummationtheoremsforcontrolcoefficients.Eur.J.Biochem.174,509-513.9濃度控制系數(shù)

Concentration-controlCoefficients同樣地，途徑中某個(gè)酶活的變化也會(huì)影響到胞內(nèi)代謝物的濃度，這種影響程度用濃度控制系數(shù)來(lái)量化：I個(gè)反應(yīng)，I-1個(gè)胞內(nèi)代謝物這些系數(shù)說(shuō)明了當(dāng)?shù)趇個(gè)酶活性無(wú)窮小變化所引起的第j個(gè)中間代謝物濃度的相對(duì)變化與酶活相對(duì)變化之比。濃度控制系數(shù)

Concentration-controlCoefficients濃度控制系數(shù)的加和定理所有酶按同樣的程度a改變時(shí)（見(jiàn)注釋6.3），中間產(chǎn)物濃度保持不變：這表明對(duì)每個(gè)中間產(chǎn)物，至少有一個(gè)酶施加負(fù)控制，即當(dāng)該酶的濃度增加時(shí)代謝物濃度卻下降了Asaconsequenceofthesummationtheorems,oneconcludesthatthecontrolcoefficientsareglobalpropertiesandthatinmetabolicsystems,controlisasystemicproperty,dependentonallofitselements(steps).同樣地，代謝物濃度的變化對(duì)途徑中的某些反應(yīng)速率也有影響，這種影響程度用彈性系數(shù)來(lái)描述：代謝物j對(duì)于第i個(gè)酶的彈性系數(shù)可定義為：彈性系數(shù)Elasticitycofficients第i個(gè)反應(yīng)速率對(duì)于第j個(gè)代謝物濃度的彈性：在假定其它系統(tǒng)變量保持不變的條件下，由代謝物濃度的無(wú)窮小變化所引起的反應(yīng)速率相對(duì)變化與代謝物濃度相對(duì)變化之比負(fù)的彈性系數(shù)表明當(dāng)?shù)趈個(gè)中間產(chǎn)物濃度增加時(shí)第i個(gè)反應(yīng)速率降低，反之亦然。如果第j個(gè)中間產(chǎn)物不影響第i個(gè)酶反應(yīng)的反應(yīng)速率（此反應(yīng)的速率可能與sj的濃度無(wú)關(guān)或酶被飽和），那么Unlikecontrolcoefficients,elasticitycoefficientsarenotsystemicpropertiesbutrathermeasurehowisolatedenzymesaresensitivetochangesinparameters.（反應(yīng)速率只和底物、產(chǎn)物、調(diào)節(jié)物這三類代謝物有關(guān)）AparticularlyusefulandimportantfeatureofMCAisthatitcanrelatethekineticpropertiesoftheindividualreactions(localproperties)with(global)propertiesofthewholeintactpathway.Thisisdonethroughtheconnectivitytheoremsthatrelatethecontrolcoefficientsandtheelasticitycoefficientsofstepswithcommonintermediatemetabolites

Kacser,H.&Burns,J.A.(1973)Thecontrolofflux.Symp.Soc.Exp.Biol.27,65-104.Connectivitytheorem通量－控制的連接定理

Flux-controlconnectivitytheorem

P215證明具有低的通量控制系數(shù)的反應(yīng)具有高彈性系數(shù)反之，具有高的通量控制系數(shù)的反應(yīng)具有低彈性系數(shù)因?yàn)椋壕哂懈咄靠刂葡禂?shù)的反應(yīng)的速率變化將使其它所有反應(yīng)速率（具有低的通量控制系數(shù)）也發(fā)生較大的變化，而這種變化是由代謝濃度的變化傳遞的。所以其它反應(yīng)對(duì)代謝物濃度變化一定比較敏感，即具有較高的彈性系數(shù)。相反，具有低通量控制系數(shù)的反應(yīng)的速率變化也將引起代謝物濃度變化，但代謝物濃度變化不能使其它反應(yīng)發(fā)生較大的變化濃度－控制的連接定理

Concentration-controlconnectivitytheorem利用矩陣符號(hào)，可以將（6.34）、（6.36）、（6.38）、（6.39）、（6.40）中所有的法則概括為：I個(gè)反應(yīng)，I-1個(gè)胞內(nèi)代謝物下標(biāo)j、k表示代謝物，i表示反應(yīng)加和連接通量濃度I-1個(gè)等式（I-1）2-（I-1)個(gè)等式（I-1）I個(gè)I個(gè)I(I-1)個(gè)代謝物1代謝物2代謝物I-1代謝物1代謝物2代謝物I-1此時(shí)I為單位陣（維數(shù)I×I）。對(duì)于非奇異陣E，控制系數(shù)為：例6.3由彈性系數(shù)求通量控制系數(shù)(P216)由式6－41得：由于知道動(dòng)力學(xué)方程后求彈性系數(shù)比較容易，所以可以方便地通過(guò)彈性系數(shù)得到通量控制系數(shù)C1J是x的減函數(shù)，P217,Figure6.96.28例6－4代謝控制分析舉例4個(gè)反應(yīng)，3個(gè)胞內(nèi)代謝物FCCsr1r2r3r4S1S2S3中間產(chǎn)物s3濃度的增加將阻礙第二步反應(yīng)（s1轉(zhuǎn)化為s2）因此增加處于反饋控制的酶E2的濃度的方法并不是提高通量的最佳方法

FCCsr1r2r3r4S1S2S3從濃度控制系數(shù)可以看出：當(dāng)最后一個(gè)酶的活性提高時(shí)，最后一個(gè)中間產(chǎn)物s3及第一個(gè)中間產(chǎn)物s1的濃度迅速降低然而同時(shí)第二個(gè)中間產(chǎn)物s2的濃度增加

在引入FCCs的概念之前，一個(gè)調(diào)節(jié)酶經(jīng)常意味著一個(gè)限速步驟，但在引入FCCs的概念后發(fā)現(xiàn)這并不是實(shí)情。MCA理論表明限速步驟這一概念是毫無(wú)道理的，取而代之的應(yīng)是FCCs值和限速程度！

如果反饋抑制能被解除，即

32＝0，則可計(jì)算出控制系數(shù)矩陣：

S1S2S3r1r2r3r4此時(shí)速率控制步驟現(xiàn)在為酶促反應(yīng)中的第二個(gè)酶。因此它為潛在的速率控制酶，即：如果抑制被去除或大量減少時(shí)，第二個(gè)反應(yīng)將控制總體通量當(dāng)反饋抑制去除后，最后一行的所有三個(gè)濃度系數(shù)成為負(fù)值。增加最后一個(gè)酶的活性將降低所有中間產(chǎn)物的濃度。上游代謝物（底物）為負(fù)值，下游代謝物（產(chǎn)物）為正值假設(shè)構(gòu)建一個(gè)新菌株，該菌株擁有一與E2相似的酶但是彈性系數(shù)不同。第二步酶促反應(yīng)的彈性系數(shù)為：s3的反饋抑制減小并且變小。具有細(xì)微差別E2的生產(chǎn)菌株代替了原始菌株，控制系數(shù)矩陣變?yōu)椋翰捎眯旅负笞詈笠粋€(gè)酶的通量控制能力減少，每種酶的通量控制系數(shù)都接近平均值0.25。通量控制分散，因此沒(méi)有酶在酶促反應(yīng)的通量控制中占優(yōu)勢(shì)上面的討論沒(méi)有包括操作條件對(duì)細(xì)胞特性的影響，需要注意的是通量控制系數(shù)可能隨著操作條件的變化發(fā)生巨大變化當(dāng)對(duì)具有大的通量控制系數(shù)的反應(yīng)（酶）進(jìn)行操作后，通量控制系數(shù)的值大小變得差不多，但是這并不一定表明經(jīng)由途徑的通量要比原始菌株的通量高很多。進(jìn)一步改進(jìn)需要繼續(xù)增加途徑中所有酶的劑量當(dāng)知道s、p及動(dòng)力學(xué)方程時(shí)，可通過(guò)計(jì)算得到所有胞內(nèi)代謝物濃度。并計(jì)算出彈性系數(shù)（si的復(fù)雜函數(shù)），最后求出控制系數(shù)矩陣C(包括通量控制和濃度控制系數(shù)）在對(duì)酶進(jìn)行修飾前（動(dòng)力學(xué)參數(shù)的改變）必須最優(yōu)化當(dāng)前反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)：通過(guò)模擬在不同s及p值下的通量實(shí)現(xiàn)通量最大化。胞內(nèi)代謝物濃度的變化較小的原則（2）FCCs的確定方法直接法：通過(guò)對(duì)通量和酶活的測(cè)量來(lái)直接確定控制系數(shù)的值，活力的變化很小但并不是無(wú)窮小間接法：確定彈性系數(shù)的值，隨后通過(guò)MCA定理計(jì)算得出控制系數(shù)瞬時(shí)代謝物濃度法大偏差理論：通過(guò)測(cè)量由酶活的大范圍波動(dòng)所導(dǎo)致的通量變化來(lái)計(jì)算FCCs的方法

linlogkineticsmethod直接法

在某一酶活處的FCC值等于曲線中該酶活處切線的斜率用相應(yīng)的通量酶活比J/E歸一化基因工程方法:構(gòu)建大量的突變株，這些突變株中某個(gè)酶的表達(dá)量不同（或酶活不同），測(cè)定所有突變株在同一操作條件下的通量:得到J-E關(guān)系圖滴定法：純化酶提高酶活或?qū)Ｒ恍砸种苿┙档兔富睿瑱z測(cè)產(chǎn)物或底物變化得到通量

1.Theperturbationsshouldbeverysmall-becausethesteadystatemoveswhentheperturbationsarefinite,thereisanerrorassociatedwithlargeperturbations(thelargertheyare,thebiggertheerror.Tominimizethiserrortheperturbationsshouldbesmall,somethinglike1%wouldbeideal.However,theeffectsofsmallperturbationsareusuallyalsosmallandsoareverydifficulttodetect.Moreoftenperturbationsofover10%areused,eventhoughtheyimplysomeerrorintheresults.2.Inhibitorsmustbespecific-ifwewanttoperturbtherateofonereactionbyaddinganinhibitor,thismustonlyaffectthatreactionalone,notanyoftheothersinthesystem.Itisoftendifficulttofulfilthisrequirement.3.Therateofreactionmustchangelinearlywiththeenzymeconcentration,ifwewanttousetheenzymeconcentrationastheparametertoperturb.Iftherelationbetweenrateandenzymeconcentrationisnotlinear,thentheresultingcontrolcoefficientswillnotconformtothesummationtheorems.Severalproblemsassociatedwiththeseapproaches:這種方法有兩個(gè)重要的前提條件：代謝系統(tǒng)中的所有反應(yīng)和有關(guān)的調(diào)節(jié)作用都被充分的描述系統(tǒng)處于穩(wěn)態(tài)，初始底物和最后產(chǎn)物的濃度是定值為了確保這些條件得到滿足，最好至少直接測(cè)定系統(tǒng)的一個(gè)控制系數(shù)來(lái)對(duì)結(jié)果進(jìn)行檢驗(yàn)。測(cè)定彈性系數(shù)的方法：

a.通過(guò)動(dòng)力學(xué)模型計(jì)算彈性系數(shù)

胞內(nèi)酶動(dòng)力學(xué)是否正確描述了胞內(nèi)酶的功能？大多數(shù)酶動(dòng)力學(xué)的研究是基于對(duì)初始反應(yīng)速度的測(cè)量，而此時(shí)反應(yīng)產(chǎn)物并不存在，顯然這并不代表胞內(nèi)的真實(shí)情況胞內(nèi)環(huán)境的復(fù)雜性，包括很多可能是效應(yīng)物的代謝物，而體外實(shí)驗(yàn)可能會(huì)遺漏某些重要效應(yīng)物。

間接法b.雙調(diào)法此反應(yīng)的速度依賴于式中所示化合物的濃度，即r=f(cA,cB)。在穩(wěn)態(tài)下J=r

，因此有：測(cè)定穩(wěn)態(tài)時(shí)兩個(gè)代謝物的濃度和通量，然后引入很小的一個(gè)擾動(dòng)，例如改變細(xì)胞外底物的濃度，來(lái)產(chǎn)生一組新的通量和代謝物濃度的測(cè)量值。通過(guò)用有窮差異來(lái)對(duì)上式的微分進(jìn)行近似化，這個(gè)干擾實(shí)驗(yàn)就產(chǎn)生了一個(gè)方程。換一種干擾，例如改變產(chǎn)物濃度產(chǎn)生了第二個(gè)方程。兩個(gè)干擾實(shí)驗(yàn)就可以求得兩個(gè)彈性系數(shù)。兩組干擾產(chǎn)生的數(shù)據(jù)不能線性相關(guān)！干擾實(shí)驗(yàn)的數(shù)目取決于函數(shù)f!如果知道其中一個(gè)彈性系數(shù)，則另一個(gè)可通過(guò)單調(diào)節(jié)實(shí)驗(yàn)獲得這種方法的優(yōu)點(diǎn)是可以應(yīng)用幾個(gè)同類型的但調(diào)節(jié)幅度不同的調(diào)節(jié)，并且可用作圖法來(lái)確定方程中的微分部分

c.單調(diào)法d.Top-down：自上向下法在許多情況下，并不需要知道所有的FCCs值，最重要的是知道那些（個(gè)）反應(yīng)具有最大的控制系數(shù)分割代謝途徑，通過(guò)雙調(diào)法實(shí)驗(yàn)或單調(diào)法實(shí)驗(yàn)確定組彈性系數(shù)，求出GroupFCCs重新分割，直到找到對(duì)通量實(shí)行主要控制的反應(yīng)或反應(yīng)組反應(yīng)組之間只能通過(guò)X發(fā)生相互作用！大偏差理論Largedeviations注意到斜率ΔJ/ΔE與原始點(diǎn)處的dJ/dE不同，因此用ΔJ/ΔE來(lái)代替dJ/dE計(jì)算通量控制系數(shù)就會(huì)導(dǎo)致錯(cuò)誤的結(jié)果e:酶活Ki:常數(shù)雙曲線關(guān)系式E’大偏差理論是一種強(qiáng)有力的分析工具，它將MCA的無(wú)窮小的限制擴(kuò)展到可測(cè)量的實(shí)驗(yàn)領(lǐng)域。但是該強(qiáng)調(diào)的是:前面公式的推導(dǎo)是通過(guò)一個(gè)經(jīng)過(guò)簡(jiǎn)化的一級(jí)動(dòng)力學(xué)的近似表達(dá)式來(lái)實(shí)現(xiàn)的。所以用這些公式來(lái)分析一個(gè)具有高度非線性特點(diǎn)的系統(tǒng)就可能導(dǎo)致不確定的結(jié)果通量控制系數(shù)估算表達(dá)式的推導(dǎo)

例：鼠肝細(xì)胞中的色氨酸代謝基態(tài)：無(wú)誘導(dǎo)物時(shí)擾動(dòng)后狀態(tài)：有誘導(dǎo)物

通過(guò)激素誘導(dǎo)，色氨酸2，3-加雙氧酶的活性（vmax）從基本態(tài)的13.7升至101μmol(gDWh)--1,通量由基本態(tài)的2.6升至7.8μmol(gDWh)--1

代謝主要包括兩步：細(xì)胞吸收色氨酸和色氨酸2，3-加雙氧酶分解色氨酸基態(tài)：擾動(dòng)后的誘導(dǎo)狀態(tài)：大偏差法能同時(shí)確定擾動(dòng)前、后兩個(gè)狀態(tài)的通量控制系數(shù)大偏差理論的基礎(chǔ)E為酶活，R為比例因子（a）ci<<Kmi,；cj<<Kmj,,ks≈1（b）當(dāng)所觀察的酶活變化并沒(méi)有引起底物對(duì)酶的飽和度的大幅變化時(shí)。對(duì)于任一酶來(lái)說(shuō)，當(dāng)其它酶活不變時(shí)如果所有的其它酶活保持不變，上式可以產(chǎn)生一個(gè)象圖示那樣形狀的通量——酶活關(guān)系曲線，這證實(shí)了簡(jiǎn)化的動(dòng)力學(xué)表達(dá)式符合基本的準(zhǔn)則瞬時(shí)代謝物濃度法這種方法的應(yīng)用有四個(gè)假定：

1.外部代謝物庫(kù)對(duì)代謝途徑的動(dòng)力學(xué)沒(méi)有影響，或它們的濃度被控制在一個(gè)穩(wěn)態(tài)水平。這也是一個(gè)MCA的普遍假定。

2.穩(wěn)態(tài)條件下酶動(dòng)力學(xué)的線性近似在一個(gè)較寬的代謝物濃度范圍內(nèi)是有效的。

3.在理論上必須可以通過(guò)對(duì)代謝物濃度的測(cè)量來(lái)確定流經(jīng)途徑中每一反應(yīng)的瞬時(shí)通量。

4.代謝物在體系中均勻分布（另一個(gè)MCA的普遍假定）P22