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文檔簡介
Chapter6
EnzymeKineticsMetabolicControlAnalysis代謝通量分析可以找到需要優化的途徑(通量),而如何快速有效地實現對目的途徑(通量)的優化呢?需要知道途徑中各單個反應速率變化對目標通量的影響程度,顯然改造那些具有較大影響程度的反應的效果最好。Metaboliccontrolanalysisisamethodforanalysinghowthecontroloffluxesandintermediateconcentrationsinametabolicpathwayisdistributedamongthedifferentenzymesthatconstitutethepathway.
EnzymekineticsMetabolicControlAnalysis6.1酶動力學單底物的酶催化反應動力學模型:由V.C.R.Henri于1902年及L.Michaelis和M.L.Menten于1913年建立的。簡單的酶催化反應動力學通常是指Michaelis-Menten動力學或飽和動力學。E+SESE+P兩個假定:1.形成ES復合物的反應速度很快.2.第二步的逆反應速率可忽略。此假設僅在反應初期產物的累積量很少時才能成立。(快速平衡假設)
1925年Briggs及Haldane在快速平衡假設基礎上做了改進:擬穩態假設,此假設在反應初期不成立,經過短暫過渡期后(ms)成立(P193,note6.1)。(1)米氏方程的推導快速平衡假設擬穩態假設E+SESE+PKm’:即ES的解離常數,單位濃度下復合物解離速度與形成速度之比Km:單位濃度下復合物總解離速度與形成速度之比Kcat=Vm/[E0]=k2
Kcat/Km
[S]<<Km時,[S]>>Km時,[S]=Km時,參數的確定:雙倒數作圖法產物濃度很低時,即米氏方程I=0I>0競爭性抑制的最終作用結果是使,因此降低了反應速度。最大反應速度不變。競爭性抑制可通過提高底物濃度來克服。(2)Competitiveinhibitionenzymekinetics(3)Non-competitiveinhibitionenzymekinetics非競爭性抑制劑不是底物類似物。抑制劑與酶結合的位點不是酶的活性位點,這種結合降低了酶的有效濃度。高底物濃度不能克服非競爭性抑制。必須加入其它試劑去阻止抑制劑與酶的結合。I=0I>0(4)Uncompetitiveinhibitionenzymekinetics反競爭性抑制劑只與ES復合物結合,而且它與酶無親和作用。Vm值的降低要比Km值的降低更具顯著作用,其最終結果是使反應速率降低。I=0I>0(5)Substrateinhibitionenzymekinetics如果底物自身有抑制作用:一種反競爭抑制,1/v是1/s的雙曲函數,該雙曲函數具有一垂直和一傾斜漸近線在低底物濃度時,[S]2/KSI<<1,觀察不到抑制作用。反應速率為
在高底物濃度時,K’m/[S]<<1,抑制作用顯著。這種情況下反應速率為
P199Example6.1產物是抑制劑的非競爭產物抑制最適底物的判斷:(P204的推導)三個動力學參數的確定:通過上圖得到四條回歸直線在X軸上截距,求得Km(四個數據的平均值)通過下圖回歸直線與Y軸截距得到Km/Vm,進而求出Vm,進而通過斜率求出KI變構酶的特點具有協同作用的酶——變構酶一般具有多個調節位點(效應物)與催化位點(底物)。它們大多是幾個亞基聚集而成的多聚體酶,具有四級結構,這些亞基可以不同,也可以完全相同。動力學特征:S型曲線,而不是米氏方程的雙曲線協同性(Cooperativity)(6)Cooperativityandallostericenzyme與一個底物分子的結合引起酶結構的改變,導致剩余結合位點對底物親和力的升高,隨著更多的底物結合,親和力也越高,稱為正協同效應。底物既是反應物,又是調節分子。即底物自身的濃度充當酶活的調節信號,可以在一個較小的底物濃度變化范圍內引起酶活的快速、急劇的升高。有利于細胞針對生理環境變化采取快速的調控。雙曲線表明:M-M動力學方程中r對s的敏感性不高,除非在底物濃度接近零時S型曲線表明:r對s的敏感性在底物濃度接近零時不高,而在正常底物濃度下十分敏感協同性使變構酶在胞內代謝物處于生理濃度附近(S=Km)起著反應“開關”的作用,對于細胞實現對反應和代謝物濃度的快速調節具有重要意義。變構酶的動力學方程:Hill經驗方程底物同酶的結合具有協同性時,n>1。slpoe=nlns參數n和K的確定:P205:例6.2噻唑籃(MTT)法測定胞內NADH濃度兩種底物MTT0X及乙醇過量,反應中可以認為濃度不變
ADH快速將NAD+還原為NADH,反應體系中NADH濃度穩定不變
d[MTTred]/dt=k[MTT0X][NADH]做標準曲線(圖6.7),測定MTTred生成速度后在標準曲線上確定對應的[NADH]
HK,PFK-1,andpyruvate
kinase(PYK)aretherate-limitingstepsbecause:Theyaretheslowestenzymesinthepathwaybyatleastoneorderofmagnitude(theyhavethelowestVmaxvalues).TheyareallostericenzymesInconsequence,tovarytheglycolyticflux,oneoftheseenzymeshastobemodified.GAPDHPGKENOPGAM6.2代謝控制分析EMP途徑通量控制分散,需要多個酶一起擴增控制分析需要解決的問題:修飾哪些酶?酶活改變多少?(1)基本概念與定理通量J反應速率r
穩態時,一條途徑的J等于這條途徑中任何一步反應的r
線性途徑中最好的情況是:某步反應速率r提高a%,達到新的穩態后,這條途徑的其它所有反應速率r均提高a%,從而流經該反應的通量也提高a%
最差的情況是:某步反應速率r提高a%,達到新的穩態時,其它所有反應速率均不變化,該步反應速率恢復到原水平,流經該反應的通量不能提高。更一般的情況是:某步反應速率r提高a%,達到新的穩態時,其它所有反應速率均提高了b%,該步反應速率從提高a%降至提高b%,流經該反應的通量提高b%。一般性原則:如何對這種影響程度實行量化?通量控制系數(FCCs)
由代謝途徑中一個酶活的無窮小變化所引起的通量的相對變化與該酶活的相對變化之比。通量控制系數(Fluxcontrolcoefficients)Channellingeffect
Channellingreferstomechanismsinwhichtheproductofoneenzymeistransferreddirectlytoanenzymethatusesitassubstratewithoutnecessarilypassingthroughthefreesolution.Onlyindependentcatalysts:酶活=酶濃度Manyenzyme-catalysedreactionratesarelinearintermsoftheenzymeconcentration(atleastinacertainrangeofenzymeconcentrations),controlcoefficientscanbewrittenusingenzymeconcentrations通量控制系數的加和定理
summationtheorem在線性途徑中酶促反應的通量控制系數的和為1:Thesummationsareoverallthestepsofthesystem.Thismayincludenotonlythestepsofthepathwayofinterestbutalsoofotherpathways(aslongastherearelinksbetweenthem).Inprincipleforawholecell,thesummationwouldhavetobeoverallmetabolicstepsofthatcell.Giersch,C.(1988)Controlanalysisofmetabolicnetworks.1.Homogeneousfunctionsandthesummationtheoremsforcontrolcoefficients.Eur.J.Biochem.174,509-513.9濃度控制系數
Concentration-controlCoefficients同樣地,途徑中某個酶活的變化也會影響到胞內代謝物的濃度,這種影響程度用濃度控制系數來量化:I個反應,I-1個胞內代謝物這些系數說明了當第i個酶活性無窮小變化所引起的第j個中間代謝物濃度的相對變化與酶活相對變化之比。濃度控制系數
Concentration-controlCoefficients濃度控制系數的加和定理所有酶按同樣的程度a改變時(見注釋6.3),中間產物濃度保持不變:這表明對每個中間產物,至少有一個酶施加負控制,即當該酶的濃度增加時代謝物濃度卻下降了Asaconsequenceofthesummationtheorems,oneconcludesthatthecontrolcoefficientsareglobalpropertiesandthatinmetabolicsystems,controlisasystemicproperty,dependentonallofitselements(steps).同樣地,代謝物濃度的變化對途徑中的某些反應速率也有影響,這種影響程度用彈性系數來描述:代謝物j對于第i個酶的彈性系數可定義為:彈性系數Elasticitycofficients第i個反應速率對于第j個代謝物濃度的彈性:在假定其它系統變量保持不變的條件下,由代謝物濃度的無窮小變化所引起的反應速率相對變化與代謝物濃度相對變化之比負的彈性系數表明當第j個中間產物濃度增加時第i個反應速率降低,反之亦然。如果第j個中間產物不影響第i個酶反應的反應速率(此反應的速率可能與sj的濃度無關或酶被飽和),那么Unlikecontrolcoefficients,elasticitycoefficientsarenotsystemicpropertiesbutrathermeasurehowisolatedenzymesaresensitivetochangesinparameters.(反應速率只和底物、產物、調節物這三類代謝物有關)AparticularlyusefulandimportantfeatureofMCAisthatitcanrelatethekineticpropertiesoftheindividualreactions(localproperties)with(global)propertiesofthewholeintactpathway.Thisisdonethroughtheconnectivitytheoremsthatrelatethecontrolcoefficientsandtheelasticitycoefficientsofstepswithcommonintermediatemetabolites
Kacser,H.&Burns,J.A.(1973)Thecontrolofflux.Symp.Soc.Exp.Biol.27,65-104.Connectivitytheorem通量-控制的連接定理
Flux-controlconnectivitytheorem
P215證明具有低的通量控制系數的反應具有高彈性系數反之,具有高的通量控制系數的反應具有低彈性系數因為:具有高通量控制系數的反應的速率變化將使其它所有反應速率(具有低的通量控制系數)也發生較大的變化,而這種變化是由代謝濃度的變化傳遞的。所以其它反應對代謝物濃度變化一定比較敏感,即具有較高的彈性系數。相反,具有低通量控制系數的反應的速率變化也將引起代謝物濃度變化,但代謝物濃度變化不能使其它反應發生較大的變化濃度-控制的連接定理
Concentration-controlconnectivitytheorem利用矩陣符號,可以將(6.34)、(6.36)、(6.38)、(6.39)、(6.40)中所有的法則概括為:I個反應,I-1個胞內代謝物下標j、k表示代謝物,i表示反應加和連接通量濃度I-1個等式(I-1)2-(I-1)個等式(I-1)I個I個I(I-1)個代謝物1代謝物2代謝物I-1代謝物1代謝物2代謝物I-1此時I為單位陣(維數I×I)。對于非奇異陣E,控制系數為:例6.3由彈性系數求通量控制系數(P216)由式6-41得:由于知道動力學方程后求彈性系數比較容易,所以可以方便地通過彈性系數得到通量控制系數C1J是x的減函數,P217,Figure6.96.28例6-4代謝控制分析舉例4個反應,3個胞內代謝物FCCsr1r2r3r4S1S2S3中間產物s3濃度的增加將阻礙第二步反應(s1轉化為s2)因此增加處于反饋控制的酶E2的濃度的方法并不是提高通量的最佳方法
FCCsr1r2r3r4S1S2S3從濃度控制系數可以看出:當最后一個酶的活性提高時,最后一個中間產物s3及第一個中間產物s1的濃度迅速降低然而同時第二個中間產物s2的濃度增加
在引入FCCs的概念之前,一個調節酶經常意味著一個限速步驟,但在引入FCCs的概念后發現這并不是實情。MCA理論表明限速步驟這一概念是毫無道理的,取而代之的應是FCCs值和限速程度!
如果反饋抑制能被解除,即
32=0,則可計算出控制系數矩陣:
S1S2S3r1r2r3r4此時速率控制步驟現在為酶促反應中的第二個酶。因此它為潛在的速率控制酶,即:如果抑制被去除或大量減少時,第二個反應將控制總體通量當反饋抑制去除后,最后一行的所有三個濃度系數成為負值。增加最后一個酶的活性將降低所有中間產物的濃度。上游代謝物(底物)為負值,下游代謝物(產物)為正值假設構建一個新菌株,該菌株擁有一與E2相似的酶但是彈性系數不同。第二步酶促反應的彈性系數為:s3的反饋抑制減小并且變小。具有細微差別E2的生產菌株代替了原始菌株,控制系數矩陣變為:采用新酶后最后一個酶的通量控制能力減少,每種酶的通量控制系數都接近平均值0.25。通量控制分散,因此沒有酶在酶促反應的通量控制中占優勢上面的討論沒有包括操作條件對細胞特性的影響,需要注意的是通量控制系數可能隨著操作條件的變化發生巨大變化當對具有大的通量控制系數的反應(酶)進行操作后,通量控制系數的值大小變得差不多,但是這并不一定表明經由途徑的通量要比原始菌株的通量高很多。進一步改進需要繼續增加途徑中所有酶的劑量當知道s、p及動力學方程時,可通過計算得到所有胞內代謝物濃度。并計算出彈性系數(si的復雜函數),最后求出控制系數矩陣C(包括通量控制和濃度控制系數)在對酶進行修飾前(動力學參數的改變)必須最優化當前反應網絡:通過模擬在不同s及p值下的通量實現通量最大化。胞內代謝物濃度的變化較小的原則(2)FCCs的確定方法直接法:通過對通量和酶活的測量來直接確定控制系數的值,活力的變化很小但并不是無窮小間接法:確定彈性系數的值,隨后通過MCA定理計算得出控制系數瞬時代謝物濃度法大偏差理論:通過測量由酶活的大范圍波動所導致的通量變化來計算FCCs的方法
linlogkineticsmethod直接法
在某一酶活處的FCC值等于曲線中該酶活處切線的斜率用相應的通量酶活比J/E歸一化基因工程方法:構建大量的突變株,這些突變株中某個酶的表達量不同(或酶活不同),測定所有突變株在同一操作條件下的通量:得到J-E關系圖滴定法:純化酶提高酶活或專一性抑制劑降低酶活,檢測產物或底物變化得到通量
1.Theperturbationsshouldbeverysmall-becausethesteadystatemoveswhentheperturbationsarefinite,thereisanerrorassociatedwithlargeperturbations(thelargertheyare,thebiggertheerror.Tominimizethiserrortheperturbationsshouldbesmall,somethinglike1%wouldbeideal.However,theeffectsofsmallperturbationsareusuallyalsosmallandsoareverydifficulttodetect.Moreoftenperturbationsofover10%areused,eventhoughtheyimplysomeerrorintheresults.2.Inhibitorsmustbespecific-ifwewanttoperturbtherateofonereactionbyaddinganinhibitor,thismustonlyaffectthatreactionalone,notanyoftheothersinthesystem.Itisoftendifficulttofulfilthisrequirement.3.Therateofreactionmustchangelinearlywiththeenzymeconcentration,ifwewanttousetheenzymeconcentrationastheparametertoperturb.Iftherelationbetweenrateandenzymeconcentrationisnotlinear,thentheresultingcontrolcoefficientswillnotconformtothesummationtheorems.Severalproblemsassociatedwiththeseapproaches:這種方法有兩個重要的前提條件:代謝系統中的所有反應和有關的調節作用都被充分的描述系統處于穩態,初始底物和最后產物的濃度是定值為了確保這些條件得到滿足,最好至少直接測定系統的一個控制系數來對結果進行檢驗。測定彈性系數的方法:
a.通過動力學模型計算彈性系數
胞內酶動力學是否正確描述了胞內酶的功能?大多數酶動力學的研究是基于對初始反應速度的測量,而此時反應產物并不存在,顯然這并不代表胞內的真實情況胞內環境的復雜性,包括很多可能是效應物的代謝物,而體外實驗可能會遺漏某些重要效應物。
間接法b.雙調法此反應的速度依賴于式中所示化合物的濃度,即r=f(cA,cB)。在穩態下J=r
,因此有:測定穩態時兩個代謝物的濃度和通量,然后引入很小的一個擾動,例如改變細胞外底物的濃度,來產生一組新的通量和代謝物濃度的測量值。通過用有窮差異來對上式的微分進行近似化,這個干擾實驗就產生了一個方程。換一種干擾,例如改變產物濃度產生了第二個方程。兩個干擾實驗就可以求得兩個彈性系數。兩組干擾產生的數據不能線性相關!干擾實驗的數目取決于函數f!如果知道其中一個彈性系數,則另一個可通過單調節實驗獲得這種方法的優點是可以應用幾個同類型的但調節幅度不同的調節,并且可用作圖法來確定方程中的微分部分
c.單調法d.Top-down:自上向下法在許多情況下,并不需要知道所有的FCCs值,最重要的是知道那些(個)反應具有最大的控制系數分割代謝途徑,通過雙調法實驗或單調法實驗確定組彈性系數,求出GroupFCCs重新分割,直到找到對通量實行主要控制的反應或反應組反應組之間只能通過X發生相互作用!大偏差理論Largedeviations注意到斜率ΔJ/ΔE與原始點處的dJ/dE不同,因此用ΔJ/ΔE來代替dJ/dE計算通量控制系數就會導致錯誤的結果e:酶活Ki:常數雙曲線關系式E’大偏差理論是一種強有力的分析工具,它將MCA的無窮小的限制擴展到可測量的實驗領域。但是該強調的是:前面公式的推導是通過一個經過簡化的一級動力學的近似表達式來實現的。所以用這些公式來分析一個具有高度非線性特點的系統就可能導致不確定的結果通量控制系數估算表達式的推導
例:鼠肝細胞中的色氨酸代謝基態:無誘導物時擾動后狀態:有誘導物
通過激素誘導,色氨酸2,3-加雙氧酶的活性(vmax)從基本態的13.7升至101μmol(gDWh)--1,通量由基本態的2.6升至7.8μmol(gDWh)--1
代謝主要包括兩步:細胞吸收色氨酸和色氨酸2,3-加雙氧酶分解色氨酸基態:擾動后的誘導狀態:大偏差法能同時確定擾動前、后兩個狀態的通量控制系數大偏差理論的基礎E為酶活,R為比例因子(a)ci<<Kmi,;cj<<Kmj,,ks≈1(b)當所觀察的酶活變化并沒有引起底物對酶的飽和度的大幅變化時。對于任一酶來說,當其它酶活不變時如果所有的其它酶活保持不變,上式可以產生一個象圖示那樣形狀的通量——酶活關系曲線,這證實了簡化的動力學表達式符合基本的準則瞬時代謝物濃度法這種方法的應用有四個假定:
1.外部代謝物庫對代謝途徑的動力學沒有影響,或它們的濃度被控制在一個穩態水平。這也是一個MCA的普遍假定。
2.穩態條件下酶動力學的線性近似在一個較寬的代謝物濃度范圍內是有效的。
3.在理論上必須可以通過對代謝物濃度的測量來確定流經途徑中每一反應的瞬時通量。
4.代謝物在體系中均勻分布(另一個MCA的普遍假定)P22
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