中華人民共和國出入境檢驗檢疫行業(yè)標準出口蜂蜜中常見蜜源植物成分的檢測方法實時熒光PCR法第6部分：龍眼I 第5部分：椴樹： 第8部分：紫云英。本部分為SN/T4848的第6部分。1出口蜂蜜中常見蜜源植物成分的檢測方法實時熒光PCR法第6部分：龍眼SN/T4848的本部分規(guī)定了出口蜂蜜中龍眼成分的實時熒光PCR檢測方法。本部分適用于出口蜂蜜中龍眼成分的定性檢測。本部分所規(guī)定方法的最低檢出限(LOD)為0.5%2規(guī)范性引用文件GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格GB14963—2011食品安全國家標準蜂蜜GB/T27403—2008實驗室質(zhì)量控制規(guī)范食品分子生物學檢測DNA:脫氧核糖核酸(deoxyribonule2UNG:尿嘧啶N-糖基化酶(uracilN-glycosylase)BHQ1:黑洞猝滅基團1(Blackholeq引物/探針序列(5'→3')長度靶基因內(nèi)參照F:GCTGAAGCAGCTACTTTCGAR:AGGAGCCGTGTGAGATGAP:FAM-TGGAGTGGGAGAGTCAGAGTCGAAAAGA龍眼P:FAM-CTTCATTGAAAGAAAGGCATAACTA36.4體積分數(shù)為70%的乙醇。8.1.1.5轉(zhuǎn)移上層清液至2mL離心管中；加入0.7倍體積的三氯甲烷，劇烈震蕩混勻，室溫下8.1.1.8加入0.8倍體積的異丙醇混勻，-20℃放置0.548.1.1.9棄上清，用70%乙醇洗滌沉淀一次，12000r/min轉(zhuǎn)速下4℃離心10min。8.1.2蜂蜜上清DNA提取將上清分裝到2個50mL離心管中，每管20mL,參照附錄B步驟進行核酸DNA提取，DNA存放8.2DNA濃度和純度的測定使用核酸蛋白分析儀或紫外分光光度計分別檢測260nm和280nm處的吸光值A(chǔ)?go和A?80。DNA的濃度按照式(1)計算：c——DNA濃度，單位為微克每微升(pg/pL);A——260nm處的吸光值；N——核酸稀釋倍數(shù)。8.3實時熒光PCR擴增8.3.1實時熒光PCR反應體系實時熒光PCR反應體系的反應條件見表2。內(nèi)參照DNA模板(10ng/μL～200ng/μL)無菌ddH?O8.3.2實時熒光PCR反應程序內(nèi)參照基因：50℃2min;95℃預變性10min;95℃15s,60℃1min,40個循環(huán)。龍眼FSDlb基因：50℃2min;95℃預變性10min;95℃15s,60℃1min,50個循環(huán)。9質(zhì)量控制以下條件有一條不滿足時，實驗視為無效：a)空白對照：無熒光對數(shù)增長，相應的Ct值>50.0。b)陰性對照：無熒光對數(shù)增長，相應的Ct值>50.0。5c)45<Ct值<50,則重復實驗一次。再次擴增后Ct值<50,則判定為陽性；Ct值≥50,則判定為6CCCAAGCTTCCTGATTGGGTAAGTTAGCTTCATTGAAAGAAAGTTATCCATTACCCTTTAATCTTTTTTAATTTTTCAGAAGC沉淀溶液