土壤蔗糖酶的測定本標準規定了土壤蔗糖酶的測定方法（3,5-二硝基水楊酸比色法）。本標準適用于各類土壤蔗糖酶的測定（3,5-二硝基水楊酸比色法）。2規范性引用文件下列文件對于本文件的應用是必不可少的。凡是注日期的應用文件，僅注日期的版本適用于本文件，凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T601化學試劑標準滴定溶液的制備GB/T6682分析實驗室用水規格和試驗方法NY/T1121.1土壤檢測第一部分：土壤樣品的采集、處理和貯存3原理土壤蔗糖酶將蔗糖酶促水解為還原糖，還原糖與3,5-二硝基水楊酸在沸水浴中反應而生成橙色的3-氨基-5-硝基水楊酸，顏色深度與還原糖量呈正相關，因而可用還原糖量來表示蔗糖酶的活性。4試劑和溶液除非另有說明外，本方法均使用符合國家標準的分析純試劑，分析用水為GB/T6682規定的三級水。4.2蔗糖（C12H22O11）。4.3磷酸氫二鈉（Na2HPO4）。4.4磷酸二氫鉀（KH2PO4）。4.5葡萄糖（C6H12O6）。4.63,5-二硝基水楊酸（C7H4N2O7）。4.7酒石酸鉀鈉（KNaC4H4O6·4H2O）。4.8酶促反應試劑4.8.1蔗糖水溶液（80g/L）稱取8g（精確至0.01g）蔗糖加水溶解后并定容至100mL。4.8.2磷酸緩沖液（pH5.5）磷酸氫二鈉溶液：稱取11.876g（精確至0.0001g）二水合磷酸氫二鈉用水溶解定容7結果計算至1L（A液）；磷酸二氫鉀溶液：稱取9.078g（精確至0.0001g）磷酸二氫鉀用水溶解定容至1L（B液）；取A液0.5mL，B液9.5mL混合均勻即可。4.9葡萄糖標準液（1mg/mL）預先將葡萄糖置98℃~100℃干燥2h，準確稱取50mg（精確至0.0001g）葡萄糖于燒杯中，用水溶解后，移至50mL容量瓶中，定容，搖勻備用（4℃冰箱中保存期不超過7d）。若該溶液發生混濁和出現絮狀物現象，則應棄之，重新配制。4.103,5-二硝基水楊酸試劑（DNS試劑）稱取0.5g（精確至0.0001g）3,5-二硝基水楊酸，溶于20mL2mol/L氫氧化鈉溶液中再加入50mL水，再稱取30g（精確至0.01g）酒石酸鉀鈉，溶于上述溶液中，用水定容至100mL（保存期不超過7d）。5儀器設備5.1電子天平：感量0.0001g和0.01g。5.2恒溫培養箱（37℃±1℃)。5.3分光光度計（540nm）。6操作步驟6.1標準曲線繪制分別吸取1mg/mL的標準葡糖糖溶液（4.9）0.00、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50mL于50mL比色管中，再補加水至1mL，加DNS試劑（4.10）3mL混勻，于沸水浴中準確反應5min（從試管放入重新沸騰時算起取出后立即于冷水浴中冷卻至室溫，用水定容至50mL，以空白管調零在波長540nm處比色，以吸光值為縱坐標，以葡萄糖濃度為橫坐標繪制標準曲線。6.2土壤蔗糖酶測定稱取5g土壤（精確至0.0001g）（如含量高可適當減少稱樣量），置于50mL具塞三角瓶中，加入15mL80g/L蔗糖溶液（4.8.1），5mLpH5.5磷酸緩沖液（4.8.2）和5滴甲苯（4.1）。搖勻混合后，放入恒溫培養箱，在37℃±1℃下培養24h，取出迅速過濾。準確吸取濾液1.00mL，注入50mL容量瓶中，加入3mLDNS試劑（4.10），沸水水浴5min，隨即將容量瓶移至自來水流下冷卻3min。溶液因生成3-氨基-5-硝基水楊酸而呈橙黃色，最后用水定容至50mL，在分光光度計上于540nm處進行比色。注意事項:①每一個樣品應該做一個無基質對照，以等體積的水代替基質（80g/L蔗糖水溶液其他操作與樣品實驗相同，以排除土樣中原有的蔗糖、葡萄糖對實驗結果的影響。②整個實驗設置一個無土對照，不加土樣，其他操作與樣品實驗相同，以檢驗試劑純度和基質自身分解，即空白試驗。③如果樣品吸光值超過標曲的最大值，則應該增加分取倍數或減少培養的土樣。蔗糖酶活性以24h，1g風干土壤可水解生成葡萄糖毫克數表示，按式（1）計算：式中：X樣品中蔗糖酶的含量，單位為毫克每克每24h（mg/g·24h）；C1加基質樣品由標準曲線求得的葡萄糖的含量，單位為毫克每毫升（mg/mLC2未加基質樣品由標準曲線求得葡萄糖的含量，單位為毫克每毫升（mg/mLV顯色定容體積，單位為毫升（mL）；N為分取倍數=浸出